Pour commencer, plongez une fiole de HUVECs cryoconservés dans un bain d’eau à 37 degrés pendant deux minutes. Rincez ensuite le flacon avec de l’éthanol à 70 % pour éviter toute contamination. Pipetez cinq millilitres d’ECGM préchauffé dans un tube conique de 15 millilitres.
À l’aide d’une micropipette, transférez soigneusement les cellules décongelées du flacon dans le tube conique. Ajoutez ensuite un millilitre de milieu frais préchauffé dans le cryoflacon pour rincer l’intérieur et transférer les cellules restantes dans le tube conique. Après avoir jeté le surnageant, remettre les cellules en suspension dans 10 millilitres de milieu frais.
Transférez ensuite les cellules dans une fiole T75. Incuber le ballon dans un incubateur à dioxyde de carbone humidifié à 37 degrés Celsius. Rincez les cellules HUVEC confluentes à 90 % dans une fiole T75 avec 10 millilitres de DPBS.
Ajoutez ensuite un millilitre de 0,25 % d’ET dans la fiole. Après l’incubation, tapotez doucement les côtés de la fiole et ajoutez cinq millilitres de solution neutralisante de trypsine. Transférez ensuite les cellules dans un tube conique de 15 millilitres.
Récupérez les cellules restantes avec cinq millilitres d’ECGM frais et transférez-les dans le tube conique. Maintenant, centrifugez le tube conique à 250 x g pendant trois minutes pour recueillir la pastille de cellule. Après avoir jeté le surnageant, remettez en suspension la pastille cellulaire dans un millilitre d’ECGM frais et comptez les cellules.
Après une nouvelle centrifugation, jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 90 microlitres d’ECGM frais. Ensuite, aspirez brièvement les canaux des récipients imprimés sur une plaque pour éliminer la lumière. À l’aide d’une micropipette, chargez doucement le canal avec 15 microlitres de suspension de cellules HUVEC.
Placez la plaque à plat à l’intérieur d’un incubateur pendant deux heures. Par la suite, retournez la plaque à 180 degrés, en la maintenant à plat pendant les deux prochaines heures. Après quatre heures, lavez le canal avec du DPBS pour éliminer les cellules non adhérentes et mortes.
Ensuite, pipetez deux millilitres d’ECGM frais dans chaque puits. Placez la culture dynamique sur un rocker à un angle d’inclinaison de 10 degrés et cinq tr/min. Les cellules HUVEC se sont rapidement fixées et ont proliféré pour couvrir la surface luminale des canaux vasculaires de la VOP.
La maturation de l’endothélium a été vérifiée par immunomarquage pour CD31 5 jours après l’ensemencement cellulaire, ce qui a démontré la localisation de CD31 aux jonctions serrées.
