Pour commencer, acquérez les images des coupes de CHC immunomarquées. Téléchargez et ouvrez QuPath 0.4.3. exe sur l’ordinateur.
Créez un nouveau dossier avec un nom approprié pour l’organisation des projets QuPath. Cliquez sur le bouton Créer un projet dans le coin supérieur gauche du logiciel et sélectionnez le dossier nouvellement créé. Faites ensuite glisser les images numérisées dans la fenêtre du logiciel QuPath.
Une fois qu’une nouvelle fenêtre apparaît, sélectionnez définir le type d’image et cliquez sur H-DAB, puis sur importer. Pour afficher les images importées, vérifiez la liste dans la fenêtre de gauche du menu et double-cliquez sur une image pour l’ouvrir. Sélectionnez fichier dans le menu principal et procédez à l’enregistrement des images en tant que projet.
Choisissez la brosse ou la baguette dans le menu principal pour annoter la zone de la tumeur. En cas de régions tumorales discontinues, annotez chaque région séparément. Appuyez sur la touche de contrôle et maintenez-la enfoncée tout en sélectionnant toutes les régions.
Cliquez ensuite avec le bouton droit de la souris et choisissez Modifier plusieurs et sélectionnez Fusionner la sélection. Ensuite, cliquez sur automatiser dans le menu principal et sélectionnez afficher l’éditeur de script. Copiez le script requis, collez-le dans l’éditeur de script, puis cliquez sur Exécuter.
Vous pouvez également sélectionner l’outil polyligne dans le menu principal pour dessiner avec précision une bordure, séparant les nids de cellules malignes et les tissus non tumoraux adjacents. Sélectionnez ensuite la bordure dans le menu principal, choisissez objets, cliquez sur annotation et sélectionnez développer les annotations. Réglez le rayon de dilatation sur 500 micromètres et choisissez plat pour le capuchon de ligne.
Activez l’option Retirer l’intérieur et assurez-vous que la contrainte au parent est activée. Faites maintenant un clic droit sur l’annotation nouvellement créée. Sélectionnez Modifier un single, puis Diviser.
Pour nommer correctement les régions annotées, cliquez avec le bouton droit de la souris sur l’annotation dans la liste de gauche. Sélectionnez définir les propriétés et entrez les noms appropriés pour les régions de marge intérieure et externe. Définissez la zone tumorale restante comme le centre de la tumeur.
Étendre la zone péritumorale de 500 micromètres de large adjacente à la marge externe, comme démontré précédemment. Pour une analyse détaillée des pixels, sélectionnez l’outil Rectangle dans le menu principal. Annotez ensuite une région, englobant tous les types de pixels à distinguer.
Ensuite, accédez au menu principal. Sélectionnez Analyser et cliquez sur Prétraitement. Cliquez ensuite sur estimer le vecteur de tache.
Lors de l’activation de l’éditeur visuel de taches, sélectionnez auto et cliquez sur OK. Nommez le vecteur de coloration estimé H-DAB. Pour l’analyse des pixels, une autre méthode consiste à utiliser l’outil rectangle du menu principal pour mettre en évidence une petite section d’un noyau coloré à l’hématoxyline.
Ensuite, accédez au menu de gauche et sélectionnez image. Ensuite, double-cliquez sur la première tache et sélectionnez oui. Encore une fois, utilisez l’outil rectangle pour annoter une petite région, montrant une coloration positive avec DAB.
Après cela, sélectionnez l’image dans le menu de gauche et double-cliquez sur la tache deux, suivie de oui. Pour évaluer la fraction de surface des cellules immunitaires positives à partir du menu principal, cliquez sur l’option de classification, sélectionnez la classification des pixels et cliquez sur créer un seuillage. Après cela, réglez la résolution sur élevée, sélectionnez le canal DAB et appliquez un pré-filtre gaussien avec un sigma de 0,5.
Ajustez le seuil entre 0,2 et 0,3. Définissez les pixels au-dessus du seuil comme positifs et les pixels inférieurs au seuil comme négatifs. Pour la sélection de la région, optez pour n’importe quelle annotation.
Donnez un nom au classifieur. Cliquez ensuite sur enregistrer, mesurer et OK. Pour documenter les résultats, copiez les résultats affichés dans le menu de gauche et transférez-les dans une feuille de calcul.
Sélectionnez Mesure dans le menu principal supérieur comme méthode alternative. Choisissez ensuite Afficher les mesures d’annotation. Sélectionnez Copier dans le presse-papiers et collez ces résultats dans une feuille de calcul pour un enregistrement détaillé.
Enfin, faites un clic droit sur l’image, accédez à la vue multiple et cliquez sur Fermer la visionneuse pour fermer l’image. La protéine CD117 a été principalement observée dans les membranes cytoplasmiques des cellules arrondies du stroma tumoral et des espaces paravasculaires. Des cellules CD117-positives ont également été observées dans les capsules tumorales et les zones paravasculaires de la marge externe et de la paratumeur.
La protéine NKp46 a été principalement observée dans les membranes cytoplasmiques des cellules arrondies dans les espaces sinusoïdaux, le stroma du centre de la tumeur et la marge interne. Des cellules Nkp46-positives ont été observées dans les capsules autour des nids tumoraux et le stroma des voies portes dans les régions de la marge externe et péritumorale. La protéine CD1a a été principalement observée dans les membranes cytoplasmiques des cellules arrondies, dispersées ou en agrégats dans le stroma et les espaces sinusoïdaux dans le centre de la tumeur et les régions de la marge interne.
Des cellules CD1a-positives ont été trouvées dans les sinusoïdes et l’épithélium biliaire dans la région paratumorale.
