Pour commencer, installez des chambres de 0,5 millilitre dans le respiromètre O2K conformément aux instructions du fabricant. Allumez l’instrument et connectez-le au logiciel fourni pour l’acquisition de données. Lavez les chambres trois fois avec de l’eau déminéralisée.
Remplacez l’eau par 0,54 millilitre de MiR05 et fermez complètement les bouchons. Après avoir retiré l’excès de tampon, soulevez les bouchons pour permettre à l’oxygène de la pièce de s’équilibrer avec l’oxygène de la chambre. Placez une colonne dans le champ magnétique d’un séparateur de cellules magnétiques et lavez la colonne avec trois millilitres de RP5.
Remettez en suspension la cellule mononucléée du sang périphérique fraîchement isolée, ou pastille PBMC, dans 80 microlitres de RP5, avec 20 microlitres de microbilles anti-CD14. Incuber les cellules pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Diluez les cellules avec un millilitre de RP5 avant de charger la suspension sur la colonne.
Collectez les cellules non étiquetées qui s’écoulent dans un tube conique de 15 millilitres étiqueté comme un flux un"Lavez la colonne trois fois avec trois millilitres de RP5 pour recueillir le flux de liquide. Retirez délicatement la colonne du champ magnétique et placez-la sur un nouveau tube conique de 15 millilitres. Après avoir ajouté cinq millilitres de RP5, enfoncez le piston dans la colonne pour recueillir le contenu dans le tube.
Après avoir centrifugé le flux à travers un tube, répétez les étapes d’isolement à l’aide de microbilles anti-CD3 avec les cellules pour obtenir des lymphocytes T. Centrifugez les cellules contenant des lymphocytes T CD3 positifs et des monocytes CD14 positifs. Après avoir jeté le surnageant, remettez la pastille en suspension dans un millilitre de RP5.
À l’aide d’un hémocytomètre, déterminez la concentration cellulaire. Ajoutez 2,5 millions de monocytes et 5 millions de lymphocytes T dans de nouveaux tubes à centrifuger. Granulez les cellules et remettez-les en suspension dans 20 microlitres de MiR05.
Installez les capteurs fluorescents et lancez un dossier expérimental sur l’unité de respiromètre O2K. À l’aide des capteurs fluorescents LED verts, avec le filtre AMR réglé, ajustez le gain du fluorimètre et l’intensité à 1000. Réglez le volume de la chambre à 0,5 millilitre et ajustez la disposition pour voir à la fois le flux d’oxygène et la fluorescence TMRM.
Une fois que le flux d’oxygène est stable, effectuez l’étalonnage de l’oxygène de l’air selon le protocole du fabricant. Fermez les bouchons pour sceller la chambre. À l’aide d’une seringue Hamilton, injectez quatre fois 2,5 microlitres d’ester méthylique de tétraméthylrhodamine de 0,05 millimolaire, ou TMRM.
Calibrez le capteur de débit avec un signal fluorescent pour chaque injection représentant 0, 0,25, 0,5, 0,75 et 1,0 micromolaire de TMRM. Injectez 20 microlitres de MiR05 pour exécuter l’expérience à blanc. Une fois que le flux d’oxygène s’est stabilisé, sélectionnez et étiquetez le flux d’oxygène et le signal TMRM comme pré-cellule.
Injectez 20 microlitres de la suspension cellulaire contenant les cellules et mesurez pendant environ 10 minutes. Ensuite, sélectionnez et étiquetez le flux d’oxygène et les signaux TMRM comme des cellules. Répétez ensuite les étapes de chaque traitement de manière séquentielle et étiquetez le flux d’oxygène et le signal TMRM de manière appropriée.
Une fois que le flux d’oxygène est stable, injectez un microlitre d’antimycine A de 1,25 millimolaire pour inhiber la respiration mitochondriale. Pour chaque expérience à blanc, régler la concentration TMRM pré-échantillon à un pour calculer le rapport de fond. Calculez la diminution proportionnelle subséquente de la TMRM et le rapport de fond moyen de toutes les expériences à blanc.
Multipliez ensuite le TMRM de pré-échantillon de l’expérience d’échantillon par le rapport de fond moyen pour chaque injection de chaque expérience d’échantillon. Soustrayez le contexte de l’expérience aux valeurs TMRM mesurées de l’échantillon. Ensuite, soustrayez le potentiel de membrane mitochondriale corrigé du fond FCCP de chaque injection.
Pour normaliser la diminution induite par l’ADP, définissez le potentiel de membrane le plus élevé et le plus bas à 100 % et 0 % respectivement, et ajustez les données dans un modèle de régression d’ajustement non linéaire. Des études comparatives sur les changements induits par l’ADP dans les lymphocytes T et les monocytes chez des volontaires sains ont montré que les monocytes présentaient une plus grande perte de potentiel de membrane mitochondriale par rapport aux lymphocytes T. La concentration inhibitrice demi-maximale d’ADP sur le potentiel de la membrane mitochondriale était plus faible pour les monocytes par rapport aux lymphocytes T.
Une augmentation typique de la relation dose-réponse des taux de consommation d’oxygène avec l’ADP n’a pas été détectée dans les deux types de cellules.
