Pour commencer, mettez 15 millilitres de milieu à gradient de densité dans un tube de centrifugation de 15 millilitres et faites-le tourner à 1 000 G pendant une minute à 20 degrés Celsius. Retournez le tube contenant du sang humain recueilli dans de l’héparine et, à l’aide d’une pince à épiler stérilisée au feu, retirez le couvercle du tube de prélèvement sanguin. Distribuez environ 10 à 15 millilitres de sang dans le milieu à gradient de densité dans le tube.
Réglez le niveau de décélération de la centrifugeuse sur un et centrifugez le tube avec du sang à 1 000 G pendant 10 minutes à température ambiante. Retirez la couche supérieure de plasma jusqu’à un centimètre au-dessus de la couche leucocytaire. Décanter le surnageant restant du tube de centrifugation dans un autre tube à centrifuger contenant 10 millilitres de PBS.
Réinitialisez le niveau de décélération de la centrifugeuse à trois et centrifugez le tube avec du PBS et du surnageant. Aspirez le surnageant et tapotez doucement le tube pour détacher la pastille. Ensuite, incorporez 13 millilitres de milieu d’isolement dans le tube de centrifugation et lavez la paroi interne pour collecter correctement les cellules.
À l’aide d’une pince à épiler stérilisée au feu, placez une crépine à cellules de 100 micromètres sur le tube conique de 15 millilitres. Filtrez ensuite la suspension cellulaire à travers la crépine de cellule dans le tube conique de 15 millilitres. Distribuez des quantités égales de suspension cellulaire dans deux tubes coniques de 15 millilitres.
Énumérez les cellules pour calculer la concentration appropriée de tampon d’isolement. Granulez les cellules à 250 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir retiré le surnageant, ajoutez la quantité appropriée de tampon d’isolement et pipetez environ 20 fois pour détacher la pastille.
