Pour commencer, placez un œil de souris formel et fixe sur un morceau de papier ciré sous un microscope à dissection. À l’aide d’une paire de micro-pinces, tenez les restes du muscle et du nerf optique. Orientez ensuite l’œil de manière à ce que la cornée soit tournée d’un côté.
Utilisez maintenant une lame chirurgicale pour faire une incision d’un à deux millimètres de long derrière et parallèlement au limbe. Appliquez une force vers le bas avec la lame tout en maintenant l’œil en place jusqu’à ce que le segment antérieur se sépare de l’extrémité postérieure. Jetez ensuite le segment antérieur et le cristallin.
Transférez le segment postérieur dans un plat de six centimètres rempli de PBS. À l’aide d’une microspatule, retirez la rétine tout en tenant simultanément le nerf optique à l’aide d’une micro-pince. Pour rincer la rétine, transférez-la dans un puits d’une plaque de 12 puits qui comporte six puits remplis d’eau distillée double.
Utilisez une pipette P1000 pour pipeter soigneusement l’eau de haut en bas à côté de la rétine tout en soufflant l’eau pour provoquer une légère agitation. Ensuite, utilisez une pipette en verre inversé pour transférer la rétine dans le deuxième puits. Pour digérer la rétine, transférez la rétine rincée dans une solution de trypsine dans une plaque à 12 puits avec une pipette en verre inversé.
Centrez une pointe de pipette P200 imbibée de trypsine sur le nerf optique. Ensuite, pipetez doucement l’ensemble du réseau vasculaire de haut en bas pour dissocier le tissu non vasculaire. Maintenant, utilisez une pipette en verre inversé pré-rincée à la trypsine pour transférer le système vasculaire rétinien dans un puits contenant de l’eau distillée double dans une plaque à six puits.
Faites tourner la plaque, puis pipetez le système vasculaire de haut en bas avec une pipette en verre inversé rincé à la trypsine pour éliminer tout tissu non vasculaire résiduel. Transférez soigneusement le système vasculaire rétinien au centre de la région marquée sur une lame de microscopie à surface chargée. Ensuite, utilisez une pipette P200 pour retirer soigneusement l’excès d’eau d’un bord.
Placez la lame dans une enceinte de biosécurité près de la face avant pour laisser l’eau résiduelle s’évaporer. Lorsque le système vasculaire est presque sec, transférez-le sous un microscope à contraste de phase. À l’aide d’une pipette P200, ajoutez lentement de l’eau distillée deux fois d’un côté de la région marquée afin de réhydrater soigneusement le système vasculaire.
La fixation du système vasculaire rétinien isolé a permis d’obtenir un tissu structurellement robuste et suffisamment durable, adapté aux mesures AFM. En revanche, les vaisseaux rétiniens isolés des yeux non fixés ou brièvement fixés se sont fragmentés et se sont effondrés.
