Avant de commencer l’isolement des embryons murins, nettoyez soigneusement la zone avec de l’éthanol à 70 %. Assurez-vous que tous les outils de dissection sont lavés et stérilisés. Obtenez cinq millilitres de DMEM stérile contenant 10 % de FBS et 20 millilitres de DPBS et placez-les sur de la glace.
Ensuite, pour effectuer l’isolement de l’embryon, à l’aide d’un stéréomicroscope avec une platine à lumière transmise et une caméra, placez la mère enceinte correctement euthanasiée sur son dos et stérilisez la zone près de l’ouverture vaginale avec de l’éthanol. À l’aide de ciseaux de dissection et d’une pince à épiler, soulevez le pli cutané près de l’ouverture vaginale et faites une petite incision en forme de V révélant lentement l’utérus de la mère enceinte. Ensuite, disséquez la corne utérine du barrage en tenant une extrémité de celle-ci avec une pince à épiler et en coupant le long de celle-ci.
Assurez-vous d’enlever le col de l’utérus. Placez la corne utérine dans une boîte de Pétri de 10 centimètres contenant du DPBS sur de la glace. À l’aide de ciseaux de dissection et d’une pince à épiler, retirez le muscle utérin le long des sites d’implantation et coupez chaque site d’implantation ou perles contenant les gonflements déciduals à l’intérieur.
Placez-le dans du DPBS frais dans une boîte de Pétri de six centimètres sur de la glace. Prenez un site d’implantation. Placez-le dans une nouvelle boîte de Pétri de six centimètres au-dessus de la platine du stéréomicroscope et ajoutez-y 500 microlitres de DPBS.
Ajustez la mise au point du microscope et la source lumineuse. Maintenez le site d’implantation avec une pince à épiler dans une main, et avec l’autre main, insérez lentement une autre paire de pinces à l’extrémité du site d’implantation coupé de la corne utérine, révélant progressivement le gonflement à feuilles caduques. Pour révéler l’embryon, tenez l’extrémité anti-métissage du gonflement décidual isolé avec une paire de pinces et avec l’autre paire, faites lentement une coupe horizontale d’environ un quart de la taille du gonflement décidual à partir de l’extrémité du métissage.
Maintenant, avec les deux forceps, poussez lentement à partir de l’extrémité anti-mistrial du gonflement décidual jusqu’à ce que l’embryon sorte de l’extrémité fraîchement coupée. Une fois l’embryon révélé, procédez au prélèvement de tous les tissus embryonnaires supplémentaires attachés. Si le sac endodermique pariétal et le cône ecto placentaire ne se détachent pas spontanément de l’embryon, utilisez une paire de pinces pour les retirer ainsi que le sang maternel associé.
Ensuite, tout en maintenant l’embryon avec une paire de pinces, décollez lentement le sac vitellin viscéral de l’embryon à l’aide d’une autre paire de pinces. Localisez le sac endodermique pariétal et le cône ectoplacentaire. À l’aide d’une pipette AP 20, transférez le sac vitellin avec pas plus de 10 microlitres de DPBS de la boîte dans un tube PCR à huit bandes sur de la glace.
Prenez des photos en champ clair d’embryons fraîchement isolés pour vous assurer que la mise en scène des compagnons de portée est similaire. À l’aide d’une pipette P200, transférez lentement l’embryon avec 50 microlitres de DMEM contenant 10 % de FBS dans un tube de 1,5 millilitre maintenu sur de la glace. Répétez la même chose pour tous les gonflements déciduals, en utilisant des outils propres et des plastiques neufs pour chaque isolation.
