Dissociation cellulaire d’embryons murins gastrulants isolés pour le séquençage unicellulaire

Procéder à la dissociation cellulaire d’embryons murins isolés une fois que les génotypes ont été confirmés. À l’aide d’une pipette P200, ajoutez 50 microlitres de DMEM avec 10% FBS dans un nouveau tube de 1,5 millilitre. Après avoir regroupé les embryons du même génotype dans le nouveau tube, placez-le sur de la glace.

Laissez les embryons regroupés se déposer au fond du tube, puis lavez les embryons à l’aide de 50 microlitres de DPBS et attendez qu’ils se déposent avant de retirer autant de DPBS que possible sans retirer les embryons. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de trypsine aux embryons regroupés et incubez à 37 degrés Celsius dans un bloc de chaleur pendant cinq minutes. Agitez doucement le tube de 1,5 millilitre toutes les 30 secondes pour aider les cellules à se dissocier.

Après cinq minutes, neutralisez la trypsine avec 300 microlitres de DMEM contenant 10% de FBS. Centrifugez les embryons à 100 G pendant quatre minutes à température ambiante. Remettez en suspension le petit granulé obtenu dans 40 microlitres de DMEM avec 10%FBS et placez le tube sur de la glace.

Mélangez cinq microlitres de suspension cellulaire avec cinq microlitres de bleu de trypan dans un nouveau tube de 1,5 millilitre, et pipetez le mélange de haut en bas à fond. Transférez le mélange sur une lame pour déterminer le numéro de cellule et la viabilité à l’aide d’un compteur de cellules automatisé. Enfin, procédez au partitionnement d’une seule cellule à l’aide d’une puce microfluidique, en suivant le protocole du fabricant.