Pour commencer, obtenez la coupe de tissu endométrial humain sur une lame de verre pour l’immunohistochimie multiplex, et faites cuire les coupes de tissu à 60 degrés Celsius pendant deux heures. Par la suite, immergez la lame séquentiellement dans des solutions appropriées pour le déparaffinage, l’hydratation et la fixation. Ajoutez 200 millilitres du tampon AR6 ou AR9 respectif pour chaque anticorps dans une cassette de récupération d’antigène résistante à la chaleur.
Après avoir placé les sections dans le tampon de récupération de l’antigène, chauffez-les au micro-ondes à puissance élevée jusqu’à ébullition. Couvrez la cassette sans serrer et chauffez à basse puissance pendant 15 minutes. Une fois la lame refroidie, rincez-la avec de l’eau distillée deux fois, puis avec du PBST.
Retirez ensuite l’excès de solution avec du papier absorbant et tracez un cercle complet autour du tissu avec un stylo barrière hydrophobe. Ensuite, incubez les sections avec du peroxyde d’hydrogène à 3 % pendant huit minutes à température ambiante. Ensuite, appliquez une solution bloquante et incubez pendant 10 minutes à température ambiante.
Après avoir retiré la solution bloquante, appliquez 150 microlitres du premier anticorps primaire, CD49a, sur chaque lame à une dilution de 1 à 1000 dans 1x diluant d’anticorps. Avant d’appliquer l’anticorps secondaire, éliminez l’excès d’humidité à l’aide d’un papier absorbant. Ajoutez quatre à cinq gouttes de l’anticorps secondaire 1x anti-souris et peroxydase de raifort de lapin sur chaque lame.
Diluez ensuite l’amplification du signal tyramide ou le colorant TSA 1 à 100 fois dans le diluant d’amplification. Et ajoutez 150 microlitres de cette solution diluée à chaque lame et incuber. Pour éliminer les fluorophores non liés, faites bouillir les sections dans 200 millilitres de tampon AR6 dans une cassette résistante à la chaleur au micro-ondes pendant deux minutes.
Tournez ensuite le micro-ondes de haute puissance à faible puissance pendant 15 minutes. Ajouter 150 microlitres de solution de travail DAPI diluée dans du PBST goutte à goutte. Séchez entièrement les sections dans un endroit sombre pendant environ 30 minutes.
Appliquez une seule goutte de l’agent de montage fluorescent anti-trempe et placez soigneusement une lamelle.
