Pour commencer, colorez les cellules de la moelle osseuse murine avec Hoechst 33342. Pour la cytométrie en flux, lancez le logiciel requis, puis sélectionnez la normalisation CQ. Insérez le tube d’échantillon de contrôle qualité ou QC FluoroSphere dans le support de tube avant de sélectionner démarrer pour commencer la procédure de contrôle qualité.
Pour créer une nouvelle expérience, cliquez sur Nouvelle expérience dans le menu Fichier, spécifiez le chemin d’accès au fichier et enregistrez l’expérience. Sélectionnez ensuite Définir la chaîne dans le menu Paramètres. Cochez la case du signal de canal et ajoutez le nom du réactif dans la colonne de l’étiquette.
Ensuite, cliquez sur l’icône des tracés de pseudo-couleur dans la zone de tracé pour créer des tracés. Cliquez sur Ajouter un tube dans l’écran du tube à essai pour créer de nouveaux tubes d’échantillon et modifier leurs noms. Sélectionnez ensuite Exécuter pour charger l’exemple, afficher les tracés et établir les portes.
Ajustez les paramètres de gain et de seuil et sélectionnez Enregistrer pour enregistrer les données. Pour concevoir la logique de réglage de la porte, cliquez sur l’axe des x pour sélectionner FSEW, puis sur l’axe des y pour sélectionner FSEA. Sélectionnez Porte polygonale pour dessiner la porte A afin d’entourer la cellule individuelle et d’exclure les cellules adhérentes.
Pour le deuxième graphique, cliquez sur l’axe des x pour sélectionner FSEA, puis cliquez sur l’axe des y pour sélectionner SSEA. Sélectionnez Porte polygonale pour dessiner la porte B afin de séparer les cellules non fragmentaires et d’exclure les débris cellulaires. Pour le troisième graphique, cliquez sur l’axe des x pour sélectionner PIA, puis cliquez sur l’axe des y pour sélectionner SSEA.
Après avoir dessiné la porte B, sélectionnez les cellules vivantes présentant un iodure de propidium négatif et dessinez la porte C pour obtenir des cellules vivantes. Pour le quatrième graphique bidimensionnel, cliquez sur l’axe des x pour sélectionner Hoechst Red, puis sur l’axe des y pour sélectionner Hoechst Blue. Cliquez avec le bouton droit de la souris sur le tracé et sélectionnez Propriété dans le menu déroulant.
Sélectionnez le format linéaire pour l’axe des x et l’axe des y, puis dessinez la porte pour les cellules de population latérales. Utilisez simultanément les lasers de 355 nanomètres et de 405 nanomètres pour détecter à la fois les cellules de contrôle et les cellules expérimentales. Acquérez des signaux fluorescents au niveau des canaux 690 par 50 et 450 par 50 nanomètres correspondant aux deux lasers.
Observez la stimulation efficace du colorant Hoechst 33342 avec des lasers de 355 et 405 nanomètres pour visualiser les cellules de population du côté clair. Pour les mêmes échantillons, utilisez les lasers de 375 nanomètres et de 405 nanomètres pour la détection des cellules. Le laser de 355 nanomètres a efficacement excité le colorant Hoechst 33342, ce qui a permis une observation claire des cellules SP de la moelle osseuse.
Les cellules SP des mêmes échantillons détectées par le laser de 355 nanomètres et le laser de 405 nanomètres se sont avérées essentiellement identiques. Les lasers de 375 nanomètres et de 405 nanomètres ont efficacement excité Hoechst 33342 pour obtenir des cellules SP.
