Pour commencer, préparez les mélanges de sérum et d’enzymes ainsi que leurs contrôles respectifs. Dans le lecteur de microplaques, mettez en place un protocole de lecture cinétique pour mesurer l’absorbance à 260 nanomètres avec l’intervalle de lecture le plus court pendant 30 minutes. Ensuite, décongelez tous les échantillons congelés sur de la glace et diluez chaque échantillon décongelé de 1 à 10 avec 1x PBS préchauffé à 37 degrés Celsius dans des tubes de microcentrifugation LoBind.
Pour préparer un bouillon d’adénosine de cinq millimolaires, ajoutez 66,8 milligrammes d’adénosine à 50 millilitres de 1x PBS. Après l’avoir dilué dans une solution de 250 micromolaires, préchauffez l’adénosine à 37 degrés Celsius dans un incubateur. À une microplaque compatible avec les ultraviolets de 96 puits, ajoutez 160 microlitres d’adénosine suivis de 40 microlitres de chaque échantillon de protéine diluée en trois exemplaires.
Mesurez l’absorbance de chaque puits à 260 nanomètres pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Pour l’analyse des données, exportez les données vers une feuille de calcul, puis déterminez la pente de la région linéaire des données d’absorbance en fonction du temps pendant les premières minutes. Soustraire la pente du témoin négatif constitué de sérum humain ou de PBS mélangé des pentes des mélanges d’enzymes et de sérum et des mélanges d’enzymes et de PBS, respectivement.
Enfin, normalisez toutes les pentes ajustées à la pente d’origine au point de l’heure zéro pour obtenir la fraction d’activité restante à l’aide de l’équation, et tracez la fraction d’activité restante en fonction du temps. L’activité de HsADA1 de type sauvage a diminué plus rapidement dans le sérum humain mélangé par rapport à 1x PBS sur cinq jours. Les courbes de baisse de l’absorbance pour HsADA1 de type sauvage ont montré une pente initiale plus raide au jour zéro par rapport au jour cinq.
Les échantillons témoins négatifs ont montré une variation négligeable de l’absorbance par rapport aux échantillons enzymatiques.
