Pour préparer des cylindres d’un centimètre de long et d’un centimètre de diamètre, chauffez un cutter en carton sous la flamme d’un bec Bunsen et coupez un tube de 15 millilitres avec la lame chauffée. Couvrez un côté des cylindres avec des morceaux de Parafilm. Après avoir anesthésié l’axolotl et vous être assuré qu’il ne répond pas aux stimuli tactiles, orientez le membre perpendiculairement à l’axe du corps.
Amputez le membre immédiatement distal de la zone calcifiée de la région zeugopodiale. Remettez l’axolotl dans un réservoir contenant de l’eau de rétention fraîche avec des analgésiques. Après 24 heures, transférez l’axolotl dans de l’eau de rétention fraîche et laissez le membre se régénérer jusqu’au stade d’intérêt souhaité.
Après avoir placé l’axolotl anesthésié sous un microscope stéréoscopique, mesurez la longueur du membre au stade de régénération souhaité pour l’histolyse et les stades de condensation du cartilage. Après avoir recueilli les membres, placez-les dans une boîte de Pétri pour la dissection. À l’aide d’un stéréomicroscope, disséquez les membres à l’aide d’un scalpel au niveau du coude et placez-les dans une boîte de Pétri contenant une solution d’APBS.
Disposez les pipettes Pasteur et le thermobloc réglé à 37 degrés Celsius avec des aliquotes d’agarose sur la plate-forme de travail. Retirez le bloc froid du congélateur à moins 20 degrés Celsius et placez le cylindre avec l’extrémité recouverte de Parafilm vers le bas sur le dessus. Placez le membre sur une assiette propre et retirez délicatement l’excès de liquide du membre disséqué avec du papier de soie.
Ajoutez l’agarose fondue à bas point de fusion sur le dessus et déplacez brièvement le membre dans l’agarose pour déplacer tout APBS restant de la surface de la peau. Placez rapidement le membre à l’intérieur du cylindre, en vous assurant qu’il est orienté verticalement avec la zone d’intérêt tournée vers le haut. Ajoutez de l’agarose à bas point de fusion à l’intérieur du cylindre jusqu’à ce que le tissu soit complètement recouvert.
Ensuite, retirez le cylindre du bloc froid et laissez l’agarose se solidifier pendant 30 secondes. Après solidification, retirez le Parafilm du fond du cylindre et fixez le tissu contenant de l’agarose à l’étage de vibratome avec de la colle cyanoacrylate. Ensuite, retirez l’excès d’agarose environnante à l’aide d’un scalpel.
Immergez l’étage dans la solution APBS pour le sectionnement. Commencez à sectionner l’agarose par étapes de 100 micromètres jusqu’à ce que l’extrémité du tissu soit atteinte. Ensuite, sectionnez jusqu’à ce que la partie distale du tissu soit retirée.
À l’aide d’une lame de rasoir, retirez avec précaution le bloc d’agarose contenant des tissus de l’étage de vibratome. Fixez immédiatement le bloc à une boîte de Pétri en plastique de 35 millimètres avec de la colle adhésive pour tissus chirurgicaux. Ajouter environ deux millilitres de milieu de culture pour couvrir le tissu.
