Avant les mesures de microscopie à force atomique ou AFM, montez le porte-à-faux sur un bloc de verre. Insérez une boîte de Pétri remplie de PBS dans le support de l’étage moteur et insérez le bloc de verre dans la tête AFM. Positionnez ensuite la tête AFM sur la boîte de Pétri de manière à ce que le cantilever soit immergé dans le tampon et alignez le laser manuellement.
Dans le logiciel JPK, appuyez sur le bouton d’approche et d’acquisition pour faire avancer le cantilever sur une surface dure. Une fois la courbe force-distance unique acquise, ouvrez le gestionnaire d’étalonnage et sous Méthode, sélectionnez basé sur le contact. Ajustez ensuite la température ambiante à 20 degrés Celsius.
Zoomez maintenant sur la courbe et sélectionnez la pièce linéaire pour l’ajustement de sensibilité. Cliquez sur la case à cocher de sensibilité et rétractez le porte-à-faux à 200 micromètres de la surface. Cochez ensuite la case du symbole de l’infini et cliquez sur Exécuter le bruit thermique.
Ensuite, zoomez sur le graphique de fréquence résultant et définissez une plage à l’aide du bouton droit de la souris. Cochez la case Constante de ressort et fermez le gestionnaire d’étalonnage. Insérez la boîte de Pétri contenant le membre axolotl régénéré intégré dans le bloc de tissu et le milieu de culture dans le support de boîte de l’AFM.
Obtenez une image d’ensemble du bloc tissulaire en mode fond clair. Zoomez sur la zone d’intérêt et ajustez le temps d’exposition et la mise au point. Configurez les paramètres de la grille pour les mesures d’indentation et enregistrez un ensemble de courbes force-distance.
Pour le traitement des données dans le logiciel PyJibe, ouvrez le fichier contenant la courbe de déplacement de force. Sélectionnez l’onglet Prétraitement et, sous l’estimation du point de contact, sélectionnez Ajustement par morceaux avec ligne et polynôme. Sélectionnez ensuite l’onglet d’ajustement et sous modèle, sélectionnez pénétrateur sphérique, sous méthode, sélectionnez soudeur.
Pour l’analyse viscoélastique dans le logiciel PyJibe, ouvrez le fichier contenant la courbe force-distance. Sélectionnez l’onglet Prétraitement et, sous l’estimation du point de contact, sélectionnez Ajustement par morceaux avec ligne et polynôme. Sélectionnez ensuite l’onglet d’ajustement et, sous modèle, sélectionnez le modèle Hertz corrigé pour la viscoélasticité à l’aide du modèle KVM.
Sous Méthode, sélectionnez leastsq. Réglez le rayon d’entrée précis à 10 micromètres et la vitesse d’approche à 7,5 micromètres par seconde. Appuyez sur Appliquer le modèle et Ajuster tout pour obtenir les modules de Young apparents et non détendus, la viscosité apparente et le temps de relaxation de l’élément Maxwell.
Les mesures du module de Young apparent du radius et du cubitus dans les membres intacts n’ont montré aucune différence significative. Au cours de la phase d’histolyse, les modules de Young apparents du radius et du cubitus ont considérablement diminué à 0,03 et 0,13 kilopascals respectivement. Les modules de Young apparents au centre du cartilage intact étaient plus élevés qu’à la périphérie.
Au stade de l’histolyse, les mesures apparentes du module de Young n’ont montré aucune différence significative entre le centre et la périphérie du cartilage. Lors de la condensation du cartilage, les modules de Young apparents ont augmenté de manière significative à 0,77 kilopascal, représentant des valeurs de rigidité intermédiaires. Les modules non relâchés ont montré des différences substantielles dans les tissus intacts pendant l’histolyse et dans le cartilage en condensation.
Les modules de Young apparents étaient très similaires aux modules non relâchés, indiquant une réponse principalement élastique. La viscosité apparente était significativement plus faible pendant l’histolyse par rapport aux tissus intacts et au cartilage en condensation.
