Pour commencer, incubez la solution de triglycine à 60 degrés Celsius. Retirez trois tubes de bandes de granulés RPA du congélateur. Tapotez doucement les tubes de bande contre la paillasse du laboratoire pour déloger les pastilles blanches.
Transférez les trois pastilles dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre A.Pipette 25 microlitres d’eau sans nucléase pour rincer toute poudre RPA restante dans les tubes de bandelettes. Transférez la solution de rinçage dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre B.Ensuite, ajoutez 10 microlitres de la solution de triglycine 0,57 molaire et 10 microlitres de mélange d’amorce dans le tube de mélange principal B.Après avoir vortex et essoré dans le tube, placez-le sur de la glace. Ensuite, ajoutez 28,4 microlitres du tampon RPA cinq fois dans le tube de mélange principal B.Mix soigneusement en tapotant fort ou en secouant plusieurs fois.
Transférez les granulés collectés dans le tube A dans le tube de mélange principal B et retournez le tube ou tapotez le fond du tube avec votre doigt plusieurs fois pour mélanger. Observez si la solution semble homogène et monophasique. Placez le tube sur de la glace.
Ajoutez ensuite 0,71 microlitre de transcriptase inverse et 2,84 microlitres de RNase H dans le tube de mélange principal. Tapotez doucement ou retournez le tube de mixage principal de haut en bas à plusieurs reprises. Faites tourner brièvement le tube avant de le placer sur de la glace.
Maintenant, aliquote 8,4 microlitres de la solution de mélange principal dans 10 tubes pré-refroidis de 1,5 millilitre et placez les tubes sur de la glace. Après l’aliquotage, placez les tubes dans une grille métallique immergée dans de l’azote liquide pour les préparer à la lyophilisation. Au lyophilisateur, vérifiez la température du collecteur et de l’étagère.
Maintenant, couvrez les tubes ouverts dans le support métallique avec une feuille de papier blanc de nettoyage. Placez la grille métallique avec les tubes ouverts dans l’étagère du lyophilisateur et fermez la porte de l’étagère. Ensuite, sélectionnez le programme souhaité et appuyez sur Démarrer.
Après 30 minutes de l’étape de séchage secondaire, appuyez sur stop. Relâchez la pression en ouvrant la soupape de décharge de vide. Après avoir retiré le support de l’étagère, bouchez immédiatement les tubes.
