Pour commencer, préchauffez un incubateur thermique à 42 degrés Celsius. Ajoutez un microlitre de mélange de solution d’acétate de magnésium et d’acétate de potassium sur le côté du tube contenant la pastille de RTRPA lyophilisée et pré-mélangée. Remettre en suspension la pastille dans 12,4 microlitres de l’échantillon d’ARN.
Pour initier la réaction RTRPA, faites tourner brièvement la solution ajoutée à l’aide d’une mini-centrifugeuse à température ambiante pendant trois secondes. Tapotez soigneusement le tube pour bien mélanger le contenu et tournez à nouveau. Incuber la réaction à 42 degrés Celsius pendant 60 minutes dans un incubateur à agitation thermique préchauffé.
Une fois la réaction terminée, retirez les tubes de réaction et placez-les sur de la glace avant de procéder à la détection CRISPR-Cas. Pour la détection des acides nucléiques, allumez un lecteur de microplaques à fluorescence. Réglez et préchauffez le lecteur de microplaques à 37 degrés Celsius et sélectionnez le programme.
Placez ensuite une plaque à 384 puits sur de la glace. Pour remettre en suspension la réaction de détection pré-mélangée CRISPR-Cas lyophilisée, ajoutez 17 microlitres de solution de chlorure de magnésium de huit millimolaires. Mélangez en tapotant soigneusement le tube.
Tournez brièvement pendant trois secondes avant de placer le tube sur de la glace. Transférez 18 microlitres du mélange réactionnel remis en suspension dans chaque puits de la plaque pré-refroidie de 384 puits sur de la glace. Ajoutez deux microlitres du produit RPA bien préparé à chaque réaction.
Retirez la plaque de la glace. Placez-le rapidement dans un lecteur de microplaques à fluorescence préchauffé et appuyez sur Démarrer. Pour les réactions lyophilisées et pré-mélangées à base de Cas13a, 6 % de tréhalose ou 2 % de saccharose préserve l’efficacité de la réaction bien après la lyophilisation.
Les réactifs pré-mélangés lyophilisés pour les réactions à base de RTRPA et de Cas13 sont stables à 20 degrés Celsius pendant au moins huit mois.
