Pour commencer, prélevez le tissu ovarien dans la salle d’opération après la biopsie dans un tube contenant cinq millilitres de 1X DPBS supplémenté. À l’aide d’un scalpel stérile, coupez un petit morceau de tissu ovarien d’environ deux millimètres cubes de la surface de l’ovaire. Ensuite, immergez le tissu dans 350 microlitres de la solution de Bouin à température ambiante pendant deux heures.
Après l’incubation, lavez trois fois le tissu avec de l’éthanol à 70 %. Après avoir intégré et sectionné les tissus, effectuez une coloration à l’hématoxyline et à l’éosine et acquérez des images numériques pour l’analyse. Ouvrez les fichiers à l’aide d’un logiciel approprié tel que QuPath.
Faites glisser le fichier dans la fenêtre principale de QuPath et définissez le type d’image sur Brightfield H&E. Définissez un millimètre à partir de l’épithélium de surface à l’aide de la barre d’échelle. Cliquez sur l’outil ellipse et annotez les follicules.
Comptez le nombre de follicules dans cette zone d’un millimètre, du stade primordial au stade de maturation primaire. Entrez l’ID de l’échantillon, l’âge, le nombre de follicules pour chaque lame, l’épaisseur de la section et la section N comptée dans la feuille nommée Follicule en millimètre cube dans le fichier Excel Follicle Z-Score Calculator. Après avoir identifié les 10 % des follicules les plus grands dans chaque section comptée, cliquez sur l’outil de ligne et tracez deux lignes perpendiculaires à travers la membrane de l’ovocyte.
Sélectionnez Mesurer, puis cliquez sur Afficher les mesures d’annotation pour déterminer le diamètre moyen de ces ovocytes. Enregistrez les mesures sous la colonne étiquetée longueur en micromètres. Entrez le diamètre moyen de l’ovocyte des 10 % de follicules les plus grands en micromètres pour chaque lame dans le fichier Excel Follile Z-Score Calculator.
Placez l’image au centre de l’écran dans QuPath et cliquez sur l’icône ImageJ. Sélectionnez ensuite Envoyer l’instantané à ImageJ. Dans ImageJ, délimitez un millimètre de la bordure à l’aide de l’outil pinceau et cliquez sur Image, puis sur Type, et sélectionnez 8 bits.
Ensuite, cliquez sur l’outil Ligne et tracez une ligne sur la barre d’échelle. Sélectionnez Analyser, puis Définir l’échelle, entrez la longueur indiquée sur la barre d’échelle dans le champ Distance connue et cliquez sur OK. Cliquez ensuite sur Image, puis ajustez la luminosité/le contraste, puis sélectionnez Auto. Cliquez maintenant sur Image, puis ajustez le seuil et sélectionnez Auto.
Cliquez sur l’outil baguette, sélectionnez la zone, puis appuyez sur Ctrl M.Entrez la valeur de la zone dans le fichier Excel Follicle Z-Score Calculator. Une fois que toutes les données sont compilées dans le fichier Excel Follicle Z-Score Calculator, accédez à la feuille nommée Z-Score Follicle Per Millimeter Cube dans le même fichier Excel pour déterminer s’il y a une réserve ovarienne réduite. L’épithélium de surface de l’ovaire d’un enfant était clairement visible, avec la réserve ovarienne résidant en dessous après la procédure de coloration.
La densité folliculaire a été utilisée pour calculer les scores Z de la réserve ovarienne, un score Z inférieur à moins de 1,7 indiquant une réserve ovarienne réduite.
