Pour commencer, déshydratez l’explant d’os ostéochondral prélevé sur des moutons dans un flacon en verre de 40 millilitres contenant 25 millilitres de solution de déshydratation. Placez les flacons sur une roue tournante pendant une heure à température ambiante. Après le dernier lavage, remplacez la solution de déshydratation par 25 millilitres de xylène.
Placez les flacons en verre sur la roue tournante pendant une heure à température ambiante. Ensuite, ajoutez 10 % de peroxyde de benzoyle, 10 % de phtalate de dibutyle et 450 microlitres de N, N-Diméthylaniline diluée de 1 à 20 dans du propanol, et placez le flacon en verre à moins 20 degrés Celsius pendant la nuit. Maintenant, placez l’explant dans un moule d’enrobage de taille moyenne dans une boîte en plastique.
Versez la solution de méthacrylate de benzoyle, de peroxyde de benzoyle, de phtalate de dibutyle N, de N-aniline dans le moule. Aérez le moule avec un flux d’azote pendant cinq minutes. Fermez hermétiquement la boîte et placez-la à quatre degrés Celsius pendant 48 heures pour la polymérisation et le durcissement du MMA.
Au bout de deux jours, retirez la résine contenant l’explant du moule. Coupez le bloc de polyméthacrylate de méthyle contenant l’explant à l’aide d’une scie diamantée le long de son axe long pour générer une section de 1,5 millimètre d’épaisseur à 3000 tr/min avec une vitesse de trois millimètres par minute. Meulez la section avec du papier en carbure de silicium avec des nombres croissants.
Recouvrez la section épaisse d’un film de carbone de 10 nanomètres. Montez la section sur un embout en aluminium. Ensuite, créez un pont de peinture argentée entre le haut de la section et le talon pour permettre l’évacuation de la charge d’électrons vers le sol.
Placez le talon sur la platine de microscopie électronique à balayage, ou MEB. Fermez la chambre et amorcez un vide. Allumez le faisceau d’électrons et ajustez les paramètres MEB pour fonctionner en mode électrons rétrodiffusés.
Réglez les normes de niveau de gris à 25 pour le carbone, 225 pour l’aluminium et 253 pour le silicium. Après avoir calibré le MEB avec les étalons, acquérez des images de l’échantillon en mode électronique rétrodiffusé. Utilisez l’image électronique rétrodiffusée de l’échantillon pour convertir les niveaux de gris en calcium.
Ensuite, tracez la distribution du calcium de l’image. Placez la section sur la platine du microspectromètre Raman. Calibrez le nombre d’ondes pour plus de précision et alignez le laser avant la mesure.
Pour collecter les spectres Raman, utilisez un laser de 785 nanomètres à 30 milliwatts. Réglez le temps d’intégration sur 20 secondes, répétez trois fois et utilisez une plage spectrale de 350 à 1 800 par centimètre avec un étalonnage de 1 200 lignes par millimètre. Une fois le système de nanoindentation calibré, placez l’échantillon dans le système optique et identifiez l’emplacement de la nanoindentation.
Ensuite, déplacez l’échantillon sous le dispositif d’indentation. Réglez la profondeur d’indentation à 900 nanomètres avec une vitesse de chargement-déchargement de 40 millimètres par minute et une pause de 15 secondes entre le chargement et le déchargement. Réglez le coefficient cosinus du tissu osseux sur 0,3 et lancez la nanoindentation.
