Pour commencer, obtenez l’ARN SG et transformez l’Agrobacterium avec l’ADN plasmatique. Transplantez les plantes transgéniques dans des pots et cultivez-les pendant un mois dans une serre. Pour tester le type de mutation, prélevez deux à trois milligrammes de feuilles fraîches de chaque talle d’un seul semis en un seul échantillon en utilisant les protocoles établis.
Extraire l’ADN génomique des échantillons de feuilles collectés. Concevoir des amorces PCR pour amplifier la région du gène SBEIIb entourant le site cible de l’ARN à guide unique afin d’obtenir un long fragment amplifié de 493 paires de bases. Séquencez les fragments de PCR directement à l’aide de la méthode Sanger pour identifier les mutations.
Sélectionnez les lignées E0 présentant des mutations homozygotes et plantez-les dans une serre pour obtenir des graines. Ensuite, récoltez les feuilles des semis de deux semaines et extrayez l’ADN génomique de la plante. Effectuer une PCR génomique à l’aide du programme approprié pour détecter la présence d’hygromycine, d’UB et de Cascoset dans le génome de la plante.
Analysez les produits de PCR à l’aide de l’électrophorèse sur gel pour identifier les lignées qui ne présentent aucune bande, ce qui indique qu’il s’agit de lignées E1 sans transgène. Récoltez les graines de ces lignées sélectionnées. Les plantes mutantes présentaient un aspect cireux et opaque dans leurs grains, contrairement à l’aspect translucide des grains de type sauvage.
Aucune différence significative n’a été observée entre les mutants SBEIIb et les plantes de type sauvage en termes de taux de formation des graines, de grains par panicule et de rendement par plante.
