Pour obtenir des macrophages à partir de la moelle osseuse d’une souris adulte de type sauvage, placez les cellules de la moelle osseuse dans une plaque à fond plat traitée optiquement à 96 puits contenant du DMEM complété par 10 % de FBS et 10 % de LCCM. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius avec 7% de dioxyde de carbone pendant 10 jours. Après différenciation, pipeter 75 microlitres de la suspension de Mycobacterium abscessus dans les macrophages contenant des puits.
Incuber les cellules à 37 degrés Celsius avec 7 % de dioxyde de carbone pendant quatre heures. À l’aide d’un distributeur de réactifs sur microplaques, équipé d’une petite cassette, ajoutez 110 microlitres de DMEM complétés par 10 % de FBS et 10 % de LCCM dans les composés ou les colonnes de contrôle de solvant. Distribuez 104 microlitres supplémentaires de DMEM complétés par 10 % de FBS et 10 % de LCCM dans les colonnes contenant la plus forte concentration du composé ou du solvant.
Maintenant, pipetez 5,9 microlitres de composés ou de solvant dans leurs puits désignés dans les colonnes. À l’aide d’une micropipette multicanaux, effectuez deux dilutions en série pour chaque composé et solvant. Après la dernière dilution, jetez les 110 microlitres de milieu en excès du dernier puits.
Ajouter 110 microlitres de DMEM complétés par 10 % de FBS et 10 % de LCCM dans toutes les colonnes, à l’exclusion des puits vierges. Préparez une solution de clarithromycine à une concentration de deux microgrammes par millilitre dans un DMEM. Après l’incubation, retirez de l’incubateur la plaque à 96 puits contenant les macrophages infectés.
À l’aide d’un laveur de plaques, lavez les cellules trois fois avec 200 microlitres de solution de lavage d’infection. Transférez 200 microlitres de composés dans la plaque contenant les macrophages infectés. Ajoutez ensuite 200 microlitres de milieu de culture cellulaire supplémenté et une solution de clarithromycine dans leurs puits respectifs.
Incuber la plaque à 37 degrés Celsius avec 7% de dioxyde de carbone pendant 48 heures. Après l’incubation, lavez les cellules infectées trois fois chacune avec 200 microlitres de solution de lavage des composés. À l’aide d’une micropipette multicanaux, versez 200 microlitres de solution de fixation dans tous les puits et incubez pendant 10 minutes.
Après avoir lavé les cellules, transférez 200 microlitres de solution perméable dans tous les puits et incubez pendant 15 minutes. Ensuite, aspirez la solution perméable avant d’ajouter 100 microlitres de la solution de coloration dans tous les puits. Incuber pendant 30 minutes à température ambiante.
Après l’incubation, lavez les cellules trois fois avec 200 microlitres de solution de lavage du composé. Pour cribler la plaque à l’aide d’un système d’imagerie à haut contenu, sélectionnez le type de plaque comme plaque de 96 microtitres. Objectif comme 20X avec ouverture numérique de 0,4 et mode sur confocal.
Ensuite, sélectionnez les canaux DAPI, CellMask deep red et mCherry pour capturer les noyaux colorés, le cytoplasme et le signal bactérien, respectivement. Sélectionnez les puits de la plaque et les champs respectifs de chaque puits pour l’analyse. Ensuite, cliquez sur le test et capturez une image pour vérifier les paramètres.
Enfin, mettez en place un robot de manutention d’équipements pour automatiser l’acquisition d’images pendant la nuit. Ce bras robotique remplace les plaques dans le système d’imagerie à haut contenu sans intervention humaine. Les composés daunorubicine, doxorubicine, thiostrepton, épirubicine et pamoate de pyrvinium étaient toxiques pour les macrophages infectés par les mycobactéries, entraînant une viabilité cellulaire inférieure à 85 %.
Les composés moxalactam et bésifloxacine avaient une viabilité mycobactérienne inférieure à 50 % à 13,3 micromolaires, mais n’ont montré aucune différence significative par rapport au témoin DMSO. Les composés cefdinir, gatifloxacine et moxifloxacine étaient puissants contre les mycobactéries intracellulaires à 13,3 micromolaires, le composé de pamoate de pyrvinium étant le plus actif. Les composés roxithromycine, clarithromycine et rifabutine ont montré une puissance extrême contre les mycobactéries intracellulaires, la clarithromycine réduisant la viabilité des mycobactéries à moins de 10 % pour toutes les concentrations.
