Les auteurs tiennent à remercier Lynne Spencer pour son soutien lors de la partie spectroscopie RMN de l&#39;expérience. Ce travail a été soutenu par des subventions du National Institutes of Health fonds R01 HL059246, R01 HL067970, R01 HL088634 (à M. Tian) et F32 HL096284 (le Dr Kolwicz).

<ol><li> Pour ces expériences, deux systèmes distincts sont utilisés simultanément. Pour l&#39;acquisition de 31 spectres P, un aimant Bruker 14T est interfacé avec la console Avance III et d&#39;un ordinateur équipé du logiciel TopSpin V2.1. Pour l&#39;évaluation de la fonction cardiaque, un système personnalisé construit perfusion cardiaque est interfacé avec le PowerLab 4/30 d&#39;acquisition de données, équipé de la LabChartPro 6 du logiciel d&#39;analyse de données. </li><li> Le jour de l&#39;expérience, 1 litre de tampon Krebs-Henseleit est préparée comme suit: 0,5 mM EDTA, 5,3 mm de KCl, 1,2 mm MgSO 4, 118mm NaCl, 25 mM NaHCO 3 et. Le mélange est ensuite barboter avec 5% de CO 2/95% O 2 pendant 10-15 minutes avant l&#39;addition de 2 mM CaCl 2. Enfin, les substrats, sous la forme de 10 mM de glucose et 0,5 mM de pyruvate, sont ajoutés. </li><li> Régulation de la température lors de l&#39;expérience est essentielle. Circulateurs chauffants sont utilisés pour maintenir la température entre 37,0 à 37,5 ° C tandis que le cœurest à l&#39;intérieur de l&#39;aimant. Température est surveillée pendant la durée de l&#39;expérience en utilisant un capteur de température à fibre optique. </li><li> La pression de perfusion et de la pression ventriculaire gauche sont surveillés par des capteurs de pression reliés à un système d&#39;acquisition de données et affichés à l&#39;aide du logiciel inclus. Ceux-ci sont calibrés avec un sphygmomanomètre norme avant l&#39;expérience. En outre, les conduites de pression sont vidées de manière adéquate afin d&#39;éliminer toutes les bulles d&#39;air. </li><li> Un échantillon standard de 150 mM de phosphate de sodium (qui est équivalent à la force ionique du tampon KH) est utilisé pour &quot;calibrer&quot; la sonde avant l&#39;insertion du coeur. Ce qui facilite le signal diminue et le temps nécessaire pour commencer la période d&#39;acquisition fois le coeur est positionné à l&#39;intérieur de la sonde. </li><li> Pour réduire la coagulation, la souris reçoit une injection de 200 unités de l&#39;héparine IP Après 5 minutes, du pentobarbital de sodium (175 mg / kg) IP est donnée. </li><li> Le cœur est rapidement excisé (avec les poumons d&#39;und intacte thymus) et arrêté dans la glace froide tampon KH. </li><li> Bien conservés sur la glace, les poumons sont rapidement éliminés. Les lobes du thymus sont identifiés et délicatement décollée pour exposer l&#39;aorte. Le thymus est supprimée. L&#39;aorte est ensuite isolé en retirant avec précaution tout tissu environnant. </li><li> Micro pince de suture sont utilisés pour tenir doucement les deux parois de l&#39;aorte à exposer le lumen. L&#39;aorte est soigneusement placé sur la canule faite de 0,965 mm tubes en polyéthylène OD (PE50). L&#39;aorte est maintenu en place avec une pince micro navire tandis que les sutures sont rapidement noué autour de l&#39;aorte. La pince est retirée et les forceps sont utilisés pour contrôler soigneusement ce que la canule est au-dessus de la racine aortique. Liens supplémentaires sont ajoutés si nécessaire pour maintenir le cœur en place. </li><li> Tout tissu supplémentaire est retiré avec une pince et microciseaux. Une petite incision est faite dans l&#39;oreillette gauche. Un tube de polyéthylène de 0,61 mm OD (PE10) est soigneusement inséré dans l&#39;oreillette gauche, la cavité du VG, et à traversle sommet tout en douceur en maintenant le cœur. L&#39;excès de tube est coupé. </li><li> Un dégonflé rempli d&#39;eau ballonnet est inséré à travers l&#39;oreillette dans le LV et est maintenu en place à l&#39;aide de ruban adhésif ou des sutures. La vitesse de la pompe péristaltique est progressivement augmentée pour fournir un débit suffisant pour le coeur. Jusqu&#39;à ce que le cœur est le lieu dans la sonde de la RMN, le cœur va continuer à être perfusé à débit constant équivalent à environ 2 ml / min. Le ballonnet est gonflé LV avec un petit volume à l&#39;aide d&#39;une seringue micromètre pour vérifier que le capteur de pression fonctionne LV. </li><li> Le cœur est soigneusement inséré dans un tube de RMN de 10 mm. Un large trou &quot;spinner&quot; est utilisé pour aider à orienter le tube dans la position correcte à l&#39;intérieur de la sonde. L&#39;ensemble du dispositif est alors solidaire de la &quot;cordon ombilical&quot; avec un ruban adhésif. </li><li> Le cordon ombilical est lentement abaissé dans l&#39;alésage supérieur de l&#39;aimant jusqu&#39;à ce que le tube de coeur / RMN est à l&#39;intérieur de la bobine de la sonde RMN 10 mm. </li><li> Une fois que l&#39;, ill&#39;art est dans la bonne position à l&#39;intérieur de la sonde, le débit de la pompe péristaltique est réglé pour obtenir une pression de perfusion de 80mmHg. (Rappelez-vous, que jusqu&#39;à ce moment, le cœur a été perfusé avec un débit constant d&#39;environ 2 ml / min). La pression de perfusion est alors maintenue en permettant le &quot;hold&quot; sur le mécanisme de commande de la pompe. Le coeur est alors d&#39;un délai d&#39;équilibration 15-20 minutes. Pendant ce temps, le volume du ballon LV est ajustée pour obtenir une pression en fin de diastole de 8-10 mmHg. </li><li> Au cours de la période d&#39;équilibrage, il est nécessaire d&#39;optimiser les paramètres du spectromètre afin d&#39;obtenir le signal de phosphore meilleure possible. Ceci est accompli en mettant l&#39;impulsion radio à la fréquence à laquelle le noyau de phosphore résonne (&quot;tuning&quot;) et de rendre le champ magnétique homogène («calage»). </li><li> Après la période d&#39;équilibrage, plusieurs spectres de RMN 31 P peut être obtenue. La période d&#39;acquisition de chaque spectre est fonction de til intensité de champ de l&#39;aimant, la taille de l&#39;échantillon, et le rapport signal sur bruit requis pour un essai spécifique. Spectres sont obtenus à l&#39;aide d&#39;un aimant 14 Telsa par la moyenne du signal obtenu à partir de 256 impulsions à haute fréquence de 20 ms avec un angle de 60 degrés et les retards de bascules 2,0 secondes. Cette expérience aura besoin d&#39;environ 10 minutes. </li></ol> Les résultats représentatifs Du matériel d&#39;acquisition de données et le logiciel LabChart, plusieurs paramètres de la fonction cardiaque peut être mesuré à travers le protocole expérimental. La mesure de la fonction cardiaque typique, la pression développée ventriculaire gauche (LVDevP), est obtenue en soustrayant la pression en fin de diastole (PDE) de la pression systolique (figure 1). Cette mesure peut varier en fonction de la souche de la souris et l&#39;état du cœur (par exemple, la surcharge de pression). Cependant, dans une normale C57BL6 LVDevP coeur de la souris est typiquement comprise entre 100-110 mmHg à taux fixe fin diastola pression publique de 8-10 mmHg. En outre, le programme permet LabChart pour la mesure de la fréquence cardiaque basée sur les mesures cycliques des ondes de pression LV. Encore une fois, cette mesure peut varier, mais les valeurs typiques sont de 350 à 400 bpm quand les cœurs sont autorisés à battre à taux intrinsèques. Cependant, le cœur peut être normalisée à l&#39;aide d&#39;un système de stimulation où la fréquence cardiaque est maintenue à 420 bpm. En outre, des mesures de contractilité (+ dP / dt) et de relaxation (-dP/dt) peut être estimée en utilisant la dérivée première de l&#39;onde de pression LV. Pendant le protocole expérimental, il est facile de déterminer le mécanisme de Starling par incorporation d&#39;une relation pression-volume. Ceci est accompli en faisant une augmentation graduelle du volume LV ballon et en notant la LVDevP ainsi que la PDE. Ces valeurs peuvent ensuite être tracées comme le montre la figure 2. Alors que la courbe de Starling est optimale, en notant le volume nécessaire pour atteindre une EDP de 8-10 mmHg peut donner une idée indirecte de LV chambre de dimension. Ceci peut être utilisé dans les modèles de bande aortiquetion que les coeurs hypertrophiés il faut généralement fournir un volume plus petit ballon en cœur dilaté besoin d&#39;un plus grand volume par rapport aux témoins. Le tableau 1 présente des données représentatives de la fonction cardiaque comme acquis pendant le protocole de perfusion. Le 31 P Spectromètre RMN qui fournissent des signaux de la phosphocréatine (PCr) et les trois phosphates de l&#39;ATP (γ-ATP, ATP-α, β-et ATP), ainsi que le phosphate inorganique (Pi), comme illustré à la figure 2. Analyse de chacun de ces pics donne une valeur pour l&#39;aire sous la courbe. La quantité d&#39;ATP est estimé en calculant la moyenne de la γ-ATP et l&#39;ATP-β zones. (L&#39;α-ATP n&#39;est pas utilisé parce que les molécules de NAD contribuer à une partie inconnue du signal total). Le statut énergétique du cœur est déterminée par le quotient de la PCr et les zones ATP (PCr: rapport ATP). Cette valeur est généralement de 1,5 à 1,7 dans un coeur de souris fourni avec le glucose comme substrat primaire. Bien RMN 31 P nefournir des mesures directes de l&#39;ATP ou la PCR, l&#39;aire des pics est proportionnelle à la quantité du phosphore contenant des composés dans l&#39;échantillon. Les valeurs de ces signaux peuvent être estimés à l&#39;aide d&#39;autres méthodes. Par exemple, des mesures directes de l&#39;ATP par chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP) dans une cohorte de cœur peuvent donner une concentration moyenne. Cette valeur peut alors être utilisé pour calibrer les surfaces moyennes ATP observées dans les spectres. La concentration PCR peut être calculé sur la base de la zone de PCr par rapport à la zone de l&#39;ATP. Il est également possible d&#39;estimer le pH en analysant le déplacement chimique relatif du phosphate inorganique (Pi) signal au signal PCr. 1 Utilisation de différentes séquences d&#39;impulsions radio, la vitesse de réaction de la créatine kinase ou la vitesse de réaction de synthèse d&#39;ATP peut également être mesurée 2. <img src="/files/ftp_upload/2069/2069tab1.jpg" alt="Tableau 1" /> Tableau 1. Base de la fonction cardiaque isolé perfusécœur. LVDevP: pression développée ventriculaire gauche; PTDVG: ventricule gauche en fin de diastole; HR: fréquence cardiaque; RPP: double produit; + dP / dt: dérivée première pression LV positive; -dP/dt: première pression négative dérivé LV; PP la pression de perfusion; CF:: débit coronarien. <img src="/files/ftp_upload/2069/2069fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Représentant ondes de pression LV de LabChart logiciel Pro. <img src="/files/ftp_upload/2069/2069fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Starling courbes représentatives de contrôle (trait plein) et l&#39;aorte bandes (en pointillés) chez la souris. A) La fonction systolique représenté par LVDevP sur l&#39;augmentation du volume LV tel que déterminé par le volume du ballon LV. B) La fonction diastolique représentée par EDP sur des volumes croissants LV tel que déterminé par le volume du ballon LV. LVDevP: la pression ventriculaire gauche développée (systolique moins pression diastolique pression); Informatique: en fin de diastole. <img src="/files/ftp_upload/2069/2069fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Représentant 31 P RMN de coeur isolé perfusé de souris. Remarquez le pic relativement petite Pi. Dans un coeur perfusé aérobie fourni avec des acides gras ou du pyruvate en plus du glucose, ce pic devrait être minime. Pendant les périodes d&#39;ischémie, ce pic augmente tandis que le pic PCr diminue. Remarquez l&#39;épaule à la droite du pic α-ATP. Il s&#39;agit de la contribution des molécules de NAD. Pi: phosphate inorganique; PCr: phosphocréatine; ATP: adénosine triphosphate.

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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+GLUT4-deficient+hearts+to+ischemia+underscore+the+importance+of+glycolysis.">Responses of GLUT4-deficient hearts to ischemia underscore the importance of glycolysis.</a> Circulation. 103, 2961-2966 (2001).</li><li>Liao, R., Jain, M., Cui, L., D'Agostino, J., Aiello, F., Luptak, I., Ngoy, S., Mortensen, R. M., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac-specific+overexpression+of+GLUT1+prevents+the+development+of+heart+failure+attributable+to+pressure+overload+in+mice.">Cardiac-specific overexpression of GLUT1 prevents the development of heart failure attributable to pressure overload in mice.</a> Circulation. 106, 2125-2131 (2002).</li><li>Tian, R., Musi, N., D'Agostino, J., Hirshman, M. F., Goodyear, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+adenosine+monophosphate-activated+protein+kinase+activity+in+rat+hearts+with+pressure-overload+hypertrophy.">Increased adenosine monophosphate-activated protein kinase activity in rat hearts with pressure-overload hypertrophy.</a> Circulation. 104, 1664-1669 (2001).</li></ol>

31 P RMN dans le coeur perfusé de Langendorff isolés de la souris fournit des données fiables et reproductibles. 3, 4 Toutefois, il est impératif que la canulation de l&#39;aorte et de l&#39;insertion du ballon LV sont bien faites pour permettre une telle performance cardiaque stable tandis que l&#39;intérieur de la RMN tube. En outre, la régulation de température est primordiale pour réaliser la fonction de base correcte. Un facteur important pour obtenir une bonne, spectres RMN analysables augmente le rapport signal sur bruit. Ceci peut être réalisé en assurant optimale &quot;tuning&quot; et &quot;caler&quot; sur l&#39;échantillon. Comme mentionné dans le texte du protocole, l&#39;utilisation d&#39;un échantillon standard avant l&#39;insertion du cœur peut faciliter ce processus. Il est également utile d&#39;avoir une taille adéquate &quot;échantillon&quot;. Coeurs pesant moins de 100 mg fournissent généralement inférieure PCr et de l&#39;ATP afin signaux augmentation du temps d&#39;acquisition sera nécessaire d&#39;obtenir des spectres de phosphore bonne. Il estplusieurs manières de modifier le protocole existant pour recueillir des renseignements supplémentaires sur la fonction cardiaque et de l&#39;énergétique. Dans notre laboratoire, nous avons perfusé coeurs avec des tampons de substrats mixtes qui peuvent inclure la présence de différentes combinaisons d&#39;acides gras (à des concentrations basses et hautes), le lactate, cétones, et l&#39;insuline. Avec l&#39;utilisation des isotopes stables dans le tampon de perfusion (c.-à-13 C substrats marqués), nous possédons la capacité d&#39;évaluer l&#39;utilisation du substrat par la contribution relative de l&#39;acétyl-CoA marqué le cycle de Krebs. 5-7 Pour cette application, nous effectuons isotopomère analyse de 13-C3 et C4-13 glutamate de spectroscopie 13 C-RMN. Ce gel-serrage nécessite le coeur à la fin de la perfusion de protocole et en effectuant une extraction de tissu congelé. Ce sera une expérience supplémentaire que l&#39;analyse requiert l&#39;utilisation d&#39;une sonde différente avec des paramètres de configuration séparés. D&#39;autres applications incluent l&#39;substitution du glucose avec désoxyglucose dans le tampon, tout en surveillant l&#39;accumulation en fonction du temps de 2-désoxyglucose phosphate dans le coeur en utilisant la spectroscopie RMN 31 P. Cette méthode permet la mesure de l&#39;absorption du glucose myocardique. 7, 8 En outre, notre laboratoire a analysé la fonction cardiaque et énergétique dans les protocoles de perfusion constitués d&#39;ischémie / reperfusion et le défi charge de travail élevée. 6, 8-10 En résumé, 31 P RMN dans les cœurs de souris isolées est une procédure techniquement difficile nécessitant l&#39;utilisation d&#39;équipements sophistiqués. Toutefois, les données qu&#39;elle donne une valeur inestimable pour le chercheur qui souhaite analyser la fonction et le bilan énergétique de modèles de souris transgéniques. Pour notre laboratoire, ces techniques ont joué un rôle essentiel dans notre compréhension des conséquences d&#39;une variété de facteurs de stress sur la fonction cardiaque, l&#39;énergétique et le métabolisme. 1, 11, 12

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du produit </td><td> Type </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Sulfate de magnésium </td><td> Réactif </td><td> Sigma Aldrich </td><td> M7506 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Réactif </td><td> Sigma Aldrich </td><td> E1644 </td></tr><tr><td> Le chlorure de potassium </td><td> Réactif </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P4505 </td></tr><tr><td> Le bicarbonate de sodium </td><td> Réactif </td><td> Sigma Aldrich </td><td> S6297 </td></tr><tr><td> De chlorure de sodium </td><td> Réactif </td><td> Sigma Aldrich </td><td> S7653 </td></tr><tr><td> Chlorure de calcium dihydraté </td><td> Réactif </td><td> Sigma Aldrich </td><td> C5080 </td></tr><tr><td> Le D-glucose </td><td> Réactif </td><td> Sigma Aldrich </td><td> G7528 </td></tr><tr><td> Pyruvate de sodium </td><td> Réactif </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P2256 </td></tr><tr><td> Bruker UltraShield 600WB plus </td><td> Équipement </td><td> Bruker </td><td> &amp; Nbs<html> p; </td></tr><tr><td> <a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/ML866/" target="_blank">PowerLab 4/30</a> </td><td> Équipement </td><td> <a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank">ADInstruments</a> </td><td> <a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/ML866/" target="_blank">ML866 / P</a> </td></tr><tr><td> <a href="http://www.adinstruments.com/products/software/research/LabChart-Software/" target="_blank">LabChart 6 Pro</a> </td><td> Équipement </td><td> <a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank">ADInstruments</a> </td><td> <a href="http://www.adinstruments.com/products/software/research/LabChart-Software/" target="_blank">MLS260 / 6</a> </td></tr><tr><td> <a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/FE224/" target="_blank">Quad Pont Amp</a> </td><td> Équipement </td><td> <a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank">ADInstruments</a> </td><td><html> s.com/products/hardware/corporate/product/FE224 / &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; ML224 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/research/product/ML175/" target="_blank">Contrôleur de pompe STH</a> </td><td> Équipement </td><td> <a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank">ADInstruments</a> </td><td> <a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/research/product/ML175/" target="_blank">ML175</a> </td></tr><tr><td> <a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/ML172/" target="_blank">Minipuls 3 Pompe péristaltique</a> </td><td> Équipement </td><td> <a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank">ADInstruments</a> </td><td> <a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/ML172/" target="_blank">ML172</a> </td></tr><tr><td> <a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/MLT0699/" target="_blank">Transducteur BP jetable</a> </td><td> Équipement </td><td>struments.com &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; ADInstruments </td><td> <a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/MLT0699/" target="_blank">MLT0699</a> </td></tr><tr><td> Tube 10mm échantillon RMN </td><td> Équipement </td><td> Wilmad LabGlass </td><td> 513-7PP-7 </td></tr><tr><td> PE10 tuyaux en polyéthylène </td><td> Équipement </td><td> Becton-Dickinson </td><td> 427401 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/MLT844/" target="_blank">Capteur de pression physiologique</a> </td><td> Équipement </td><td> <a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank">ADInstruments</a> </td><td> <a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/MLT844/" target="_blank">MLT844</a> </td></tr><tr><td> PE50 tuyaux en polyéthylène </td><td> Équipement </td><td> Becton-Dickinson </td><td> 427411 </td></tr><tr><td> Seringue micrométrique </td><td> Équipement </td><td> Gilmont Instruments </td><td> GS-1101 </td></tr><tr><td> McPherson forceps </td&gt; <td> Équipement </td><td> Miltex Inc </td><td> 18-949 </td></tr><tr><td> Microciseaux Castraviejo </td><td> Équipement </td><td> Instruments chirurgicaux Roboz </td><td> RS-5650 </td></tr><tr><td> Conditionneur de signal Neoptix </td><td> Équipement </td><td> Neoptix, Inc </td><td> Reflex - 1 </td></tr></tbody></table>

assessment of cardiac function and energetics in isolated mouse hearts using 31p nmr spectroscopy

Modèles de souris transgéniques sont devenus des outils de recherche puissants à établir les relations de cause à effet entre les altérations moléculaires et des modèles de maladies cardio-vasculaires. Bien que la biologie moléculaire est nécessaire pour identifier les principaux changements dans la voie de signalisation, ce n&#39;est pas un substitut pour signification fonctionnelle. Alors que la physiologie peut apporter des réponses à la question de la fonction, combinant la physiologie à l&#39;évaluation biochimique de métabolites dans l&#39;intacte, le cœur battant permet de brosser un tableau complet de la fonction cardiaque et de l&#39;énergétique. Pendant des années, notre laboratoire a utilisé des perfusions cardiaques isolées combinées à résonance nucléaire (RMN) magnétique pour accomplir cette tâche. La fonction ventriculaire gauche est évaluée par la méthode de Langendorff mode de perfusions cardiaques isolés, alors que l&#39;énergétique cardiaque est mesuré en effectuant<sup&gt; 31</sup&gt; P spectroscopie de résonance magnétique des coeurs perfusés. Avec ces techniques, les indices de la fonction cardiaque en association avec les niveaux de phosphocréatine et d&#39;ATP peuvent être mesurés simultanément dans le cœur battant. En outre, ces paramètres peuvent être surveillés tout stress physiologiques ou pathologiques sont engagées. Par exemple, l&#39;ischémie / reperfusion ou élevés protocoles défi charge de travail peut être adoptée. L&#39;utilisation de l&#39;aorte cerclage ou d&#39;autres modèles de pathologie cardiaque sont aptes aussi bien. Quelles que soient les variantes dans le protocole, la signification fonctionnelle et dynamique des modifications moléculaires des modèles de souris transgéniques peuvent être correctement décrites, conduisant à de nouvelles connaissances sur les voies enzymatiques et métaboliques associées. Par conséquent,<sup&gt; 31</sup&gt; P spectroscopie RMN dans le coeur isolé perfusé est une technique de recherche précieux dans des modèles animaux de maladies cardio-vasculaires.

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Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

Langendorff mode de perfusion cardiaque isolée, en collaboration avec<sup&gt; 31</sup&gt; P spectroscopie RMN, combine les domaines de la biochimie et de la physiologie dans une expérience. Ce protocole permet la mesure dynamique de la teneur énergétique élevée en phosphate et chiffre d&#39;affaires dans le coeur tout en même temps surveiller la fonction physiologique. Quand elle est réalisée correctement, il s&#39;agit d&#39;une technique précieuse dans l&#39;évaluation de l&#39;énergétique cardiaque.

L&#39;évaluation de la fonction cardiaque et Energétique dans les coeurs isolés de souris à l&#39;aide<sup&gt; 31</sup&gt; P NMR Spectroscopy

Bioengineered mouse models have become powerful research tools in determining causal relationships between molecular alterations and models of ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

26.0K vues.  University of Washington School of Medicine. Langendorff mode de perfusion cardiaque isolée, en collaboration avec 31 P spectroscopie RMN, combine les domaines de la biochimie et de la physiologie dans une expérience. Ce protocole permet la mesure dynamique de la teneur énergétique élevée en phosphate et chiffre d'affaires dans le coeur tout en même temps surveiller la fonction physiologique. Quand elle est réalisée correctement, il s'agit d'une technique précieuse dans l'?...

Vidéo: Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

NADH Fluorescence Imaging of Isolated Biventricular Working Rabbit Hearts

Since its inception by Langendorff1, the isolated perfused heart remains a prominent tool for studying cardiac physiology2. However, it is not well-suited for studies of cardiac metabolism, which require the heart to perform work within the context of physiologic preload and afterload pressures. Neely introduced modifications to the Langendorff technique to establish appropriate left ventricular (LV) preload and afterload pressures3. The model is known as the isolated LV working heart model and has been used extensively to study LV performance and metabolism4-6. This model, however, does not provide a properly loaded right ventricle (RV). Demmy et al. first reported a biventricular model as a modification of the LV working heart model7, 8. They found that stroke volume, cardiac output, and pressure development improved in hearts converted from working LV mode to biventricular working mode8. A properly loaded RV also diminishes abnormal pressure gradients across the septum to improve septal function. Biventricular working hearts have been shown to maintain aortic output, pulmonary flow, mean aortic pressure, heart rate, and myocardial ATP levels for up to 3 hours8.
When studying the metabolic effects of myocardial injury, such as ischemia, it is often necessary to identify the location of the affected tissue. This can be done by imaging the fluorescence of NADH (the reduced form of nicotinamide adenine dinucleotide)9-11, a coenzyme found in large quantities in the mitochondria. NADH fluorescence (fNADH) displays a near linearly inverse relationship with local oxygen concentration12 and provides a measure of mitochondrial redox state13. fNADH imaging during hypoxic and ischemic conditions has been used as a dye-free method to identify hypoxic regions14, 15 and to monitor the progression of hypoxic conditions over time10.
The objective of the method is to monitor the mitochondrial redox state of biventricular working hearts during protocols that alter the rate of myocyte metabolism or induce hypoxia or create a combination of the two. Hearts from New Zealand white rabbits were connected to a biventricular working heart system (Hugo Sachs Elektronik) and perfused with modified Krebs-Henseleit solution16 at 37 &deg;C. Aortic, LV, pulmonary artery, and left &amp; right atrial pressures were recorded. Electrical activity was measured using a monophasic action potential electrode. To image fNADH, light from a mercury lamp was filtered (350&plusmn;25 nm) and used to illuminate the epicardium. Emitted light was filtered (460&plusmn;20 nm) and imaged using a CCD camera. Changes in the epicardial fNADH of biventricular working hearts during different pacing rates are presented. The combination of the heart model and fNADH imaging provides a new and valuable experimental tool for studying acute cardiac pathologies within the context of realistic physiological conditions.

The objective is to monitor the mitochondrial redox state of isolated hearts within the context of physiologic preload and afterload pressures. A biventricular working rabbit heart model is presented. High spatiotemporal resolution fluorescence imaging of NADH is used to monitor the mitochondrial redox state of epicardial tissue.

NADH imagerie par fluorescence de biventriculaire isolé travail coeurs de lapin

Since its inception by Langendorff1, the isolated perfused heart remains a prominent tool for studying cardiac physiology2. However, it is not well-suited ...

Recherche

Médecine

Reduction in Left Ventricular Wall Stress and Improvement in Function in Failing Hearts using Algisyl-LVR

Injection of Algisyl-LVR, a treatment under clinical development, is intended to treat patients with dilated cardiomyopathy. This treatment was recently used for the first time in patients who had symptomatic heart failure. In all patients, cardiac function of the left ventricle (LV) improved significantly, as manifested by consistent reduction of the LV volume and wall stress. Here we describe this novel treatment procedure and the methods used to quantify its effects on LV wall stress and function.
Algisyl-LVR is a biopolymer gel consisting of Na+-Alginate and Ca2+-Alginate. The treatment procedure was carried out by mixing these two components and then combining them into one syringe for intramyocardial injections. This mixture was injected at 10 to 19 locations mid-way between the base and apex of the LV free wall in patients.
Magnetic resonance imaging (MRI), together with mathematical modeling, was used to quantify the effects of this treatment in patients before treatment and at various time points during recovery. The epicardial and endocardial surfaces were first digitized from the MR images to reconstruct the LV geometry at end-systole and at end-diastole. Left ventricular cavity volumes were then measured from these reconstructed surfaces.
Mathematical models of the LV were created from these MRI-reconstructed surfaces to calculate regional myofiber stress. Each LV model was constructed so that 1) it deforms according to a previously validated stress-strain relationship of the myocardium, and 2) the predicted LV cavity volume from these models matches the corresponding MRI-measured volume at end-diastole and end-systole. Diastolic filling was simulated by loading the LV endocardial surface with a prescribed end-diastolic pressure. Systolic contraction was simulated by concurrently loading the endocardial surface with a prescribed end-systolic pressure and adding active contraction in the myofiber direction. Regional myofiber stress at end-diastole and end-systole was computed from the deformed LV based on the stress-strain relationship.

This article describes procedures for implanting a novel hydrogel in failing hearts and quantifying its effect on left ventricular wall stress and function. These procedures have been successfully applied in dogs and humans.

Réduction du ventricule gauche Stress mur et amélioration de la fonction dans les coeurs défaillants utilisant Algisyl-LVR

Injection of  Algisyl-LVR, a treatment under clinical development, is intended to treat  patients with dilated cardiomyopathy. This treatment was recently ...

Assessment of Cardiac Function and Myocardial Morphology Using Small Animal Look-locker Inversion Recovery (SALLI) MRI in Rats

Small animal magnetic resonance imaging is an important tool to study cardiac function and changes in myocardial tissue. The high heart rates of small animals (200 to 600 beats/min) have previously limited the role of CMR imaging. Small animal Look-Locker inversion recovery (SALLI) is a T1 mapping sequence for small animals to overcome this problem 1. T1 maps provide quantitative information about tissue alterations and contrast agent kinetics. It is also possible to detect diffuse myocardial processes such as interstitial fibrosis or edema 1-6. Furthermore, from a single set of image data, it is possible to examine heart function and myocardial scarring by generating cine and inversion recovery-prepared late gadolinium enhancement-type MR images 1.
	The presented video shows step-by-step the procedures to perform small animal CMR imaging. Here it is presented with a healthy Sprague-Dawley rat, however naturally it can be extended to different cardiac small animal models.

Assessment of Cardiac Function and Myocardial Morphology Using Small Animal Look-locker Inversion Recovery SALLI MRI in Rats

Contrast enhanced cardiac magnetic resonance (CMR) imaging allows comprehensive in vivo assessment of the heart in small animal models of cardiovascular disease. Here we detail the procedures to perform CMR imaging, reconstruction and analysis using Small Animal Lock-Locker Inversion Recovery (SALLI) in rats.

L&#39;évaluation de la fonction cardiaque et la morphologie du myocarde en utilisant de petits Inversion Recovery Look-casier animale (SALLI) IRM chez les rats

Small animal magnetic resonance  imaging is an important tool to study cardiac function and changes in myocardial  tissue. The high heart rates of small ...

Assessment of Right Ventricular Structure and Function in Mouse Model of Pulmonary Artery Constriction by Transthoracic Echocardiography

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, the RV is significantly affected in pulmonary diseases such as pulmonary artery hypertension (PAH). In addition, the RV is remarkably sensitive to cardiac pathologies, including left ventricular (LV) dysfunction, valvular disease or RV infarction4. To understand the role of RV in the pathogenesis of cardiac diseases, a reliable and noninvasive method to access the RV structurally and functionally is essential.
A noninvasive trans-thoracic echocardiography (TTE) based methodology was established and validated for monitoring dynamic changes in RV structure and function in adult mice. To impose RV stress, we employed a surgical model of pulmonary artery constriction (PAC) and measured the RV response over a 7-day period using a high-frequency ultrasound microimaging system. Sham operated mice were used as controls. Images were acquired in lightly anesthetized mice at baseline (before surgery), day 0 (immediately post-surgery), day 3, and day 7 (post-surgery). Data was analyzed offline using software.
Several acoustic windows (B, M, and Color Doppler modes), which can be consistently obtained in mice, allowed for reliable and reproducible measurement of RV structure (including RV wall thickness, end-diastolic&#160;and end-systolic dimensions), and function (fractional area change, fractional shortening, PA peak velocity, and peak pressure gradient) in normal mice and following PAC.
Using this method, the pressure-gradient resulting from PAC was accurately measured in real-time using Color Doppler mode and was comparable to direct pressure measurements performed with a Millar high-fidelity microtip catheter. Taken together, these data demonstrate that RV measurements obtained from various complimentary views using echocardiography are reliable, reproducible and can provide insights regarding RV structure and function. This method will enable a better understanding of the role of RV cardiac dysfunction.

Right ventricle (RV) dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease, yet limited methodologies are available for its evaluation. Recent advances in ultrasound imaging provide a noninvasive and accurate option for longitudinal RV study. Herein, we detail a step-by-step echocardiographic method using a murine model of RV pressure overload.

Évaluation de ventriculaire droite Structure et fonction dans le modèle de souris de l&#39;artère pulmonaire constriction par échocardiographie transthoracique

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, ...

Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for myocardial infarction and cardiac complications of thoracic surgery. The ability of certain drugs to precondition the myocardium against ischemia reperfusion injury has led to multiple clinical trials, with little success. The isolated heart model allows acute observation of the functional effects of ischemia reperfusion injury in real time, including the effects of various pharmacological interventions administered at any time-point before or within the ischemia-reperfusion injury window. Since brief periods of ischemia can precondition the heart against ischemic injury, in situ aortic cannulation is performed to allow for functional assessment of non-preconditioned myocardium. A saline filled balloon is placed into the left ventricle to allow for real-time measurement of pressure generation. Ischemic injury is simulated by the cessation of perfusion buffer flow, followed by reperfusion. The duration of both ischemia and reperfusion can be modulated to examine biochemical events at any given time-point. Although the Langendorff isolated heart model does not allow for the consideration of systemic events affecting ischemia and reperfusion, it is an excellent model for the examination of acute functional and biochemical events within the window of ischemia reperfusion injury as well as the effect of pharmacological intervention on cardiac pre- and postconditioning. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform in situ aortic cannulation and heart excision followed by ischemia/reperfusion injury in the Langendorff model.

The isolated rat heart is an enduring model for ischemia reperfusion injury. Here, we describe the process of harvesting the beating heart from a rat via in situ aortic cannulation, Langendorff perfusion of the heart, simulated ischemia-reperfusion injury, and infarct staining to confirm the extent of ischemic insult.

Induction et de l&#39;évaluation de l&#39;ischémie-reperfusion dans coeurs de rat Langendorff perfusés

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for ...

Assessment of Human Adipose Tissue Microvascular Function Using Videomicroscopy

While obesity is closely linked to the development of metabolic and cardiovascular disease, little is known about mechanisms that govern these processes. It is hypothesized that pro-atherogenic mediators released from fat tissues particularly in association with central/visceral adiposity may promote pathogenic vascular changes locally and systemically, and the notion that cardiovascular disease may be the consequence of adipose tissue dysfunction continues to evolve. Here, we describe a unique method of videomicroscopy that involves analysis of vasodilator and vasoconstrictor responses of intact small human arterioles removed from the adipose depot of living human subjects. Videomicroscopy is used to examine functional properties of isolated microvessels in response to pharmacological or physiological stimuli using a pressured system that mimics in vivo conditions. The technique is a useful approach to gain understanding of the pathophysiology and molecular mechanisms that contribute to vascular dysfunction locally within the adipose tissue milieu. Moreover, abnormalities in the adipose tissue microvasculature have also been linked with systemic diseases. We applied this technique to examine depot-specific vascular responses in obese subjects. We assessed endothelium-dependent vasodilation to both increased flow and acetylcholine in adipose arterioles (50 - 350 &#181;m internal diameter, 2 - 3 mm in length) isolated from two different adipose depots during bariatric surgery from the same individual. We demonstrated that arterioles from visceral fat exhibit impaired endothelium-dependent vasodilation compared to vessels isolated from the subcutaneous depot. The findings suggest that the visceral microenvironment is associated with vascular endothelial dysfunction which may be relevant to clinical observation linking increased visceral adiposity to systemic disease mechanisms. The videomicroscopy technique can be used to examine vascular phenotypes from different fat depots as well as compare findings across individuals with different degrees of obesity and metabolic dysfunction. The method can also be used to examine vascular responses longitudinally in response to clinical interventions.

Videomicroscopy systems are used to examine functional properties of isolated adipose tissue arterioles in response to physiological and pharmacological stimuli. This technique can be used to examine microvascular phenotypes in different adipose tissue domains in obese humans.

Évaluation de la fonction microvasculaire tissu adipeux humain en utilisant la vidéomicroscopie

While obesity is closely linked to the development of metabolic and cardiovascular disease, little is known about mechanisms that govern these processes. ...

Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function in diabetic nephropathy and podocyte-specific VEGF-A knock-out mice; therefore, this protocol describes the full kidney work-up used in our lab to assess these mouse models of glomerular disease, enabling a vast amount of information regarding kidney and glomerular function to be obtained from a single mouse. In comparison to alternative methods presented in the literature to assess glomerular function, the use of the method outlined in this paper enables the glomerular phenotype to be fully evaluated from multiple aspects. By using this method, the researcher can determine the kidney phenotype of the model and assess the mechanism as to why the phenotype develops. This vital information on the mechanism of disease is required when examining potential therapeutic avenues in these models. The methods allow for detailed functional assessment of the glomerular filtration barrier through measurement of the urinary albumin creatinine ratio and individual glomerular water permeability, as well as both structural and ultra-structural examination using the Periodic Acid Schiff stain and electron microscopy. Furthermore, analysis of the genes dysregulated at the mRNA and protein level enables mechanistic analysis of glomerular function. This protocol outlines the generic but adaptable methods that can be applied to all mouse models of glomerular disease.

This protocol describes a full kidney work-up that should be carried out in mouse models of glomerular disease. The methods allow for detailed functional, structural, and mechanistic analysis of glomerular function, which can be applied to all mouse models of glomerular disease.

Évaluation de la fonction rénale chez les modèles murins de la maladie glomérulaire

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function ...

Normothermic Ex Situ Heart Perfusion in Working Mode: Assessment of Cardiac Function and Metabolism

The current standard method for organ preservation (cold storage, CS), exposes the heart to a period of cold ischemia that limits the safe preservation time and increases the risk of adverse post-transplantation outcomes. Moreover, the static nature of CS does not allow for organ evaluation or intervention during the preservation interval. Normothermic ex situ heart perfusion (ESHP) is a novel method for preservation of the donated heart that minimizes cold ischemia by providing oxygenated, nutrient-rich perfusate to the heart. ESHP has been shown to be non-inferior to CS in the preservation of standard-criteria donor hearts and has also facilitated the clinical transplantation of the hearts donated after the circulatory determination of death. Currently, the only available clinical ESHP device perfuses the heart in an unloaded, non-working state, limiting assessments of myocardial performance. Conversely, ESHP in working mode provides the opportunity for comprehensive evaluation of cardiac performance by assessment of functional and metabolic parameters under physiologic conditions. Moreover, earlier experimental studies have suggested that ESHP in working mode may result in improved functional preservation. Here, we describe the protocol for ex situ perfusion of the heart in a large mammal (porcine) model, which is reproducible for different animal models and heart sizes. The software program in this ESHP apparatus allows for real-time and automated control of the pump speed to maintain desired aortic and left atrial pressure and evaluates a variety of functional and electrophysiological parameters with minimal need for supervision/manipulation.

Normothermic ex situ heart perfusion (ESHP), preserves the heart in a beating, semi-physiologic state. When performed in a working mode, ESHP provides the opportunity to perform sophisticated assessments of donor heart function and organ viability. Here, we describe our method for myocardial performance evaluation during ESHP.

Normothermique Ex Situ coeur Perfusion en Mode de travail : évaluation de la fonction cardiaque et le métabolisme

The current standard method for organ preservation (cold storage, CS), exposes the heart to a period of cold ischemia that limits the safe preservation ...

Echocardiographic Assessment of Cardiac Anatomy and Function in Adult Rats

The use of experimental animal models has become crucial in cardiovascular science. Most studies using rodent models are focused on two-dimensional imaging to study the cardiac anatomy of the left ventricle and M-mode echo to assess its dimensions. However, this could limit a comprehensive study. Herein, we describe a protocol that allows an assessment of the heart chamber size, left ventricular function (systolic and diastolic) and valvular function. A conventional medical ultrasound machine was used in this protocol and different echo views were obtained through left parasternal, apical and suprasternal windows. In the left parasternal window, the long and short axis were acquired to analyze left chamber dimensions, right ventricle and pulmonary artery dimensions, and mitral, pulmonary and aortic valve function. The apical window allows the measurement of heart chamber dimensions and evaluation of systolic and diastolic parameters. It also allows Doppler assessment with detection and quantification of heart valve disturbances (regurgitation or stenosis). Different segments and walls of the left ventricle are visualized throughout all views. Finally, the ascending aorta, aortic arch, and descending aorta can be imaged through the suprasternal window. A combination of ultrasound imaging, Doppler flow and tissue Doppler assessment have been obtained to study cardiac morphology and function. This represents an important contribution to improve the assessment of cardiac function in adult rats with impact for research using these animal models.

A non-invasive protocol for transthoracic echocardiography assessment of cardiac anatomy and function for adult rats is presented in the current study. The heart valves, all four cardiac chambers and the ascending aorta, aortic arch and descending aorta are studied in detail.

Évaluation échocardiographique de l'anatomie cardiaque et de la fonction chez les rats adultes

The use of experimental animal models has become crucial in cardiovascular science. Most studies using rodent models are focused on two-dimensional ...

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring apparatus and a motor to perform functional studies. These studies will allow measurement of cardiomyocyte stiffness (passive force) and its activation with different calcium (Ca2+)-containing solutions to determine, amongst others: maximum force development, myofilament Ca2+-sensitivity (pCa50), cooperativity (nHill) and the rate of force redevelopment (ktr). This method also enables determination of the effects of drugs acting directly on myofilaments and of the expression of exogenous recombinant proteins on both active and passive properties of cardiomyocytes. Clinically, skinned cardiomyocyte studies highlight the pathophysiology of many myocardial diseases and allow in vitro assessment of the impact of therapeutic interventions targeting the myofilaments. Altogether, this technique enables the clarification of cardiac pathophysiology by investigating correlations between in vitro and in vivo parameters in animal models and human tissue obtained during open heart or transplant surgery.

This protocol aims to describe step-by-step the technique of extraction and assessment of cardiac function using skinned cardiomyocytes. This methodology allows measurement and acutemodulation of myofilament function using small frozen biopsies that can be collected from different cardiac locations, from mice to men.

Évaluation in vitro de la fonction cardiaque à l’aide de cardiomyocytes écorchés

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...