Ce nouveau protocole permet à l’investigateur de surveiller de multiples paramètres métaboliques comprenant l’oxygénation cytosolic et mitochondrique aussi bien que le statut cytosolic de redox. Tout en mesurant simultanément les mesures traditionnelles de la fonction myocardique. Le principal avantage de cette technique est une simple surveillance dynamique nondestructive des éléments importants du métabolisme mitochondrial dans le cœur perfusé qui évite les artefacts associés à la spectroscopie de réflexion.
Ceux qui sont nouveaux à cette technique peuvent avoir du mal à insérer le cathéter sans endommager la valve et éviter la contamination de la lumière ambiante. Le cathéter doit être inséré et ajusté avec soin. La fibre de collecte doit également être positionnée correctement pour maximiser la lumière transmise à travers le mur libre ventriculaire gauche qui peut être difficile.
Pour commencer à couper un petit morceau de l’appendice auriculaire gauche et insérer un cathéter à fibres optiques dans le ventricule gauche via la valve mitrale. Tournez-le ensuite pour obtenir un mur libre de ventricule gauche illuminé. Connectez l’autre extrémité de la fibre de ramasseur à un spectromètre à balayage rapide.
Placez la fibre optique pick up directement en face de la région de l’éclairage maximum du ventricule gauche à environ un centimètre du cœur. Les sources lumineuses de la pièce devraient être nulles. La rotation du cathéter et le positionnement de la fibre optique de ramasserie doivent être ajustés pour obtenir une lumière adéquate sans saturation du détecteur.
Éteignez les lumières dans la zone expérimentale pour obtenir l’obscurité complète. Démarrez le programme personnalisé intégrant des pilotes de spectromètres pour effectuer l’acquisition de données et l’analyse en temps réel de la lumière transmise. Naviguez à travers toutes les invites en sélectionnant des options pour le mode d’acquisition de spectroscopie cardiaque perfusée.
La page suivante indique si la collecte de données auxiliaires a lieu. Enfin, entrez les paramètres d’acquisition, y compris l’emplacement des spectres de référence chromophore et des données à sauver. Maintenant, entrez une bande passante de 490 à 630 nanomètres.
Entrez un taux d’échantillonnage de deux hertz. Recueillir un courant sombre ou zéro spectre lumineux pour corriger les niveaux de signal de fond en éteignent la source lumineuse. Cliquez pour sélectionner les références chromophore souhaitées à utiliser dans la routine d’ajustement.
Dans la page de données d’acquisition ajuster la position du cathéter et de la fibre de ramassage pour maximiser la lumière transmise affichée sur le logiciel avec une attention spécifique à l’amplitude du signal dans la région de 500 nanomètres où les absorbances oxygénées de myoglobine devraient être observées. Assurez-vous que la lumière transmise ne sature pas le détecteur dans la région de 600 nanomètres. Assurez-vous qu’aucune source de lumière externe ne contribue au spectre recueilli en éteigneant l’éclairage du cathéter et en confirmant qu’aucune lumière n’est maintenant détectée.
Lancez la collecte de données en cliquant sur le bouton Enregistrer Spectra. Cliquez sur Définir comme contrôle pour afficher le spectre d’absorption de différence des spectres futurs par rapport au spectre de commande actuel. À ce stade effectuer toute perturbation physiologique comme vous le souhaitez.
Par exemple, pour déterminer les effets de la cyanidine sur la performance cardiaque et l’absorption du chromophore, arrêtez la recirculation du perfusate pour éviter le recyclage du cyanure. Utilisez une pompe à seringues pour injecter du cyanure à des vitesses différentes dans le perfusate juste avant la canule aortique pour atteindre les concentrations désirées de cyanure dans le perfusate qui coule dans le cœur. Surveillez simultanément la fonction cardiaque et les propriétés optiques.
Arrêtez la pompe de seringue de cyanure quand les effets du flux coronaire et de la fréquence cardiaque, avec la transmission optique par la paroi cardiaque sont à l’état régulier. Cinq minutes après l’arrêt de l’infusion de cyanure passer le gaz bouillonnant de 100% oxygène à 100% azote pour enlever l’oxygène du système. Après environ 10 minutes arrêter le flux pour simuler une condition ischémique et hypoxique totale.
Pour l’analyse des données spectrales exécuter le programme dans le mode d’analyse cardiaque perfusée. Sélectionnez le programme d’analyse approprié. Entrez le chemin de fichier de données et le fichier spectra de référence.
Sélectionnez la source de lumière du cathéter qui charge le spectre pré-enregistré de la source lumineuse du cathéter. Sélectionnez Lire les données du bac. Ensuite, sélectionnez Définir la longueur d’onde minimale et maximale.
Entrez la bande passante pour l’analyse des données sous forme de 490 à 630 nanomètres. Sélectionnez Retour au menu principal, puis sélectionnez Références de lecture. Confirmer les spectres de référence à utiliser dans l’analyse.
Sélectionnez Retour au menu principal, puis sélectionnez points de temps dans le menu principal. Sélectionnez maintenant un point de temps zéro comme le contrôle et réglez la plage à 100 points. Sélectionnez également un point de temps une fois comme la période expérimentale à une gamme de 100 points.
Observez le spectre de différence brute dans l’onglet Spectre d’absorption moyenne. Sélectionnez Calculer les coefficients d’ajustement, puis cliquez sur l’onglet Coefficients d’ajustement pour observer le cours du temps de l’ajustement rétrospectif. Retournez au menu principal et sélectionnez Calculer l’absorption de la différence.
Sélectionnez le temps zéro et la différence entre le temps zéro et le temps un à toutes les positions. Observez le spectre ajusté dans la fenêtre de spectre différente et les éléments d’ajustement dans la fenêtre de poids de référence. Répétez cette procédure pour comparer d’autres points de temps dans l’expérience.
Retour au menu principal. Enregistrez les données et l’analyse dans un rapport de feuille de calcul en tapant le nom désiré et en sélectionnant Save Data pour une analyse plus approfondie avec d’autres programmes. On y voit le spectre du cathéter et le spectre brut de la lumière transmise par la paroi libre du cœur de lapin.
Ces données révèlent une très grande atténuation de la lumière dans la région bleue du spectre. Cependant, les bandes d’absorption de la myoglobine et des cytochromes mitochondriques peuvent être directement observées entre 490 et 580 nanomètres dans l’insert. Le spectre de différence du coeur control and cyanure-traité est montré ici.
Le spectre d’ajustement est calculé à partir des spectres de référence. Le spectre résiduel est la soustraction de l’ajustement à partir des données brutes. On y voit des amplitudes spectra des spectres de référence.
De fortes augmentations de l’absorption de la plupart des cytochromes sont observées car le flux d’électrons dans la chaîne cytochrome a été bloqué par le cyanure à l’état stable. En outre, l’absorption de la myoglobine oxygénée a augmenté pendant que la consommation d’oxygène a été éliminée par le cyanure. Le spectre de différence du lavage de cyanure par rapport à l’injection de cyanure indique une inversion partielle de l’effet de cyanure.
Il est indiqué ici le spectre de différence de l’état d’ischémie sans flux par rapport au contrôle. Ce spectre représente l’état complètement désoxygéné et réduit de la mitochondrie cytosolente verus la condition de contrôle. Nous étudions actuellement les effets de l’oxyde nitrique sur le métabolisme cardiaque.
En plus des chromophores susmentionnés, nous pouvons également suivre d’autres espèces optiquement détectables, dont la mémyoglobine produite par l’oxyde nitrique. En outre, le cathéter peut être connecté à un laser pour étudier le métabolisme des lipides à l’aide de la spectroscopie raman. Le métabolisme cardiaque de calcium peut également être étudié par absorption des sondes de calcium incorporées exogènement ou génétiquement.
