Soutenu en partie par Vanderbilt CSTC subvention de 1 UL1 RR024975 du National Center for Research Resources des National Institutes of Health. Ce travail a été financé par le NIH R01 HL 83839; R01 IA 65744.

Pour le protocole suivant, nous utilisons des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) comme les cellules d&#39;intérêt. Cependant, ce protocole peut être utilisé avec d&#39;autres types cellulaires. Effectuer le dosage dans une hotte de culture tissulaire en utilisant une technique stérile. Jour 1: Préparation de la plaque et les cellules <ol><li> Prendre une plaque ELISPOT et ouvrez-le dans la hotte. </li><li> Laver la plaque 3 fois avec 150 ul de PBS 1X aide d&#39;une pipette multicanaux, si disponible, sinon seule pipetage ainsi est acceptable. </li><li> Prenez un paquet de réservoirs et de l&#39;ouvrir dans le capot. </li><li> Ajouter 2 ug / ml de l&#39;anticorps de capture anti-interféron humain-γ, à 11 ml de PBS 1X. Vortex bien. Transfert mélange d&#39;anticorps à un réservoir. </li><li> Placer 100 ml de la solution d&#39;enrobage dans chaque puits en utilisant le multicanal. </li><li> Enveloppez la plaque dans parafilm. </li><li> Placer la plaque dans le réfrigérateur pendant la nuit. Les plaques sont bons pendant des semaines. La règle de base est que si il reste encore liquide dans le puits, la plaque peut être utilisée. </li></ol> Préparation des cellules Si les PBMC sont frais, puis compter les cellules et incuber une nuit à 37 ° C avec 5% de CO 2. Pour PBMC stockés dans l&#39;azote liquide, la décongélation des cellules est nécessaire. Le protocole est le suivant: <ol><li> Décongeler les cryovial de cellules à 37 ° C jusqu&#39;à ce bain d&#39;eau presque complètement décongelé. </li><li> Immédiatement remettre en suspension dans 5 ml de R10 médias. </li><li> Spin pendant 5 minutes à 225 x g. </li><li> Resuspendre nouveau dans 5 ml de R10 médias et compter les cellules viables en utilisant du bleu trypan. </li><li> Apportez la concentration de 2 x 10 6 cellules / mL dans R10 médias. </li><li> Reste une nuit à 37 ° C avec 5% de CO 2. </li></ol> Jour 2: Mise en place de la plaque <ol><li> Couvercle de la plaque d&#39;étiquettes avec numéro d&#39;identification des échantillons, des conditions bien, et la date. </li><li> Laver la plaque 6 fois avec 150 ul de PBS 1x stérile en utilisant le dump et la méthode blot. Soyez prudent de ne pas éclabousser la plaque tout dumping. Cela pourrait causer des puits de la plaque à son tour violet. </li><li> Ajouter 100 ul de R20 à chaque puits. </li><li> Incuber la plaque à 37 ° C pendant 1 heure. </li><li> Alors que la plaque est en incubation, compter les cellules qui ont été reposé toute la nuit. </li><li> Faites tourner la suspension de cellules à 1500 rpm pendant 5 minutes. Décanter le surnageant et remettre le culot de sorte que vous avez une concentration finale de 1x10 6 cellules par 1ml dans R10 médias. </li><li> Après l&#39;incubation de 1 heure, retirer la R20 en utilisant le dump et la méthode blot. Soyez prudent de ne pas éclabousser la plaque tout dumping. </li><li> Ajouter 100 pi de solution de cellules (10 5 cellules) dans chaque puits. Ajouter peptides appropriés et / ou d&#39;antigènes dans les puits correspondants en double exemplaire. Utiliser un nouvel embout de pipette à chaque fois que vous entrez dans la solution de peptide de travail. Concentration de peptide normale est de 10-40 g / mL. Depuis peptides varient, chaque chercheur doit titrer peptides d&#39;obtenir des résultats optimaux. </li><li> Dans les puits de contrôle négatif, ne font qu&#39;ajouter des cellules (pas de peptides) </li><li> Dans les puits de contrôle positif, ajouter la phytohémagglutinine (PHA; 10 pg / mL; Sigma). </li><li> Incuber une nuit à 37 ° C avec 5% de CO 2 (~ 18 heures). </li></ol> Jour 3: Développer la plaque <ol><li> Laver la plaque 6 fois avec 150 uL 1xPBS utilisant la méthode de dump et efface. </li><li> Ajouter 100 ul de PBS dans chaque puits de la plaque à l&#39;aide de la pipette multicanaux. </li><li> Mettez la plaque au réfrigérateur pendant 15 minutes. </li><li> Prenez la plaque du réfrigérateur et placez-le dans la hotte de culture de tissus. </li><li> Préparer la solution d&#39;anticorps biotine <ul><li> Ajouter 0,5 pg / mL d&#39;anticorps biotine (MAB 7-B6-1) à 11ml de PBS. </li><li> Vortex la solution pour bien mélanger. </li><li> Si l&#39;intention d&#39;ajouter la solution en utilisant un multicanaux, le verser dans un réservoir. </li></ul></li><li> Jeter le CPE en le feuilletant à la poubelle. Soyez prudent de ne pas éclabousser la plaque tout dumping. </li><li> Placer 100 ml de la solution dans chaque puits. </li><li> Incuber la plaque dans la hotte de culture de tissus à la température ambiante pendant une heure. </li><li> Laver la plaque 6 fois avec 150μL 1xPBS utilisant la méthode de dump et efface. Sur le lavage 6 e, quitter le CPE sur la plaque jusqu&#39;à ce que vous avez préparé l&#39;anticorps Streptavidine. </li><li> Préparer l&#39;anticorps Streptavidine. <ul><li> Ajouter 5,5 μ L Streptavidine anticorps (streptavidine-ALP) pour 11ml de PBS (1:2000 dilution). </li><li> Vortex la solution pour bien mélanger. </li><li> Si l&#39;intention d&#39;ajouter la solution en utilisant un multicanaux, le verser dans un réservoir. </li></ul></li><li> Jeter le PBS restant dans les puits et épongez la plaque. </li><li> Ajouter 100 pi de solution de streptavidine à chaque puits. </li><li> Incuber la plaque dans la hotte de culture de tissus à la température ambiante pendant 1 heure. </li><li> Laver les plaques 6 fois avec du PBS en utilisant le dump et la méthode blot. Sur le lavage 6 e, quitter le CPE sur la plaque jusqu&#39;à ce que vous avez fait la solution de couleur. </li><li> Travailler dans l&#39;obscurité. Préparer la solution de phosphatase alcaline substrat (phosphatase alcaline Substrat Kit IV BCIP / NBT): <ul><li> Ajouter 4 gouttes de réactif substrat de 1 à 11 ml de tampon Tris, vortex bien. Ajouter 4 gouttes de réactif 2 substrat tampon Tris, vortex bien. Ajouter 4 gouttes de réactif substrat à 3 tampon Tris, vortex bien. </li></ul></li><li> Jeter le reste du PBS et épongez la plaque. </li><li> Ajouter 100 ml de la solution de couleur à chaque puits de la plaque à l&#39;aide du multicanal. </li><li> Allumez la lumière au bout de 5 à 10 minutes de la couleur en développement. </li><li> Laisser les réactifs de couleur pour rester sur la plaque jusqu&#39;à ce que les taches commencent à tourner pourpre et sont assez sombres. Cela devrait durer de 5 à 20 minutes. Soyez prudent de ne pas laisser la solution de substrat trop longtemps car cela pourrait causer de fond élevé. </li><li> Laver la plaque ELISPOT 3 fois avec l&#39;eau du robinet. </li><li> Laissez sécher pendant environ une heure ou jusqu&#39;au lendemain. </li><li> Lire la plaque soit manuellement ou avec lecteur de plaque ELISPOT. </li><li> Magasin de la plaque dans une boîte loin de l&#39;exposition lumineuse. </li></ol> Les résultats représentatifs: ELISPOT est conçu pour quantifier les réponses immunitaires contre des antigènes microbiens. Chaque spot indique une seule cellule réactive, exprimant la cytokine d&#39;intérêt. Les taches peuvent être comptés manuellement ou en utilisant un lecteur de plaque ELISPOT. Évaluation que l&#39;ELISPOT a été effectuée correctement devrait commencer à l&#39;enquête du contrôle négatif pour la production d&#39;arrière-plan de la cytokine d&#39;intérêt. Dans les puits de contrôle négatif on pourrait s&#39;attendre à voir pas de taches, même si un peu de fond (couleur violette) peuvent être présents. Typiquement, il devrait être inférieur à une moyenne de cinq points par puits. Les puits de contrôle positif confirme que la réaction a été effectuée correctement, et que les cellules sont sensibles à la stimulation antigénique. Dans les puits de contrôle positif que vous attendez de voir un fond pourpre profond dû à une confluence des taches (Fig1). Il devrait y avoir peu ou pas de fond blanc. Si le contrôle positif et les échantillons témoins négatifs sont appropriés, on peut alors compter les puits contenant l&#39;antigène d&#39;intérêt. Un «sous-optimal&quot; résultat se traduirait par un bruit de fond élevé (les puits sont violet), sans taches ou des taches très peu, le centre vide, des taches ou des taches mal définies confluentes. Une liste des conseils de dépannage est fourni (tableau 1). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/2221/2221fig1.jpg" /> Figure 1. Un représentant de la plaque ELISPOT. Chaque plaque doit comporter un contrôle positif, contrôle négatif et le peptide d&#39;intérêt menée au minimum dans deux puits. C9, C10, D9 et D10 sont les puits de contrôle positif, comme vous pouvez le voir il ya une couleur pourpre profond, les cellules confluentes et presque pas de fond blanc. Les puits de contrôle négatif sont G11, G12, H11 et H12. Ces puits n&#39;ont pas le fond pourpre et sans taches comme prévu. Les taches du G7, du G8, H7 et H8, illustrent les réponses cellulaires aux peptides microbiens; les taches mauves représentent une seule cellule réactive exprimant la cytokine d&#39;intérêt. Tableau 1 <table border="1"><tbody><tr><td> Observation </td><td> Problème possible </td><td> Solution possible </td></tr><tr><td> Bruit de fond élevé </td><td> 1. Les deux côtés de la membrane ne lave pas correctement 2. Trop de cellules sécrétant des cytokines 3. Plaque pas séché correctement 4. Plus de plaque développée </td><td> 1. Lavez les deux côtés de la membrane avec de l&#39;eau distillée avant et après le développement de couleur. Réactifs peut fuir à travers la membrane dans la base de la plaque, et ils peuvent provoquer de fond élevé s&#39;il n&#39;est pas emporté. 2. Réduire le nombre de cellules par puits, ce qui nécessitera l&#39;optimisation 3. Sécher la plaque avant de lire plus 4. Réduire le temps de développement </td></tr><tr><td> Pas de taches / Spots Très peu </td><td> 1. Cytokine sécrètent pas assez de cellules / protéine d&#39;intérêt 2. Assurer les cellules sont stimulées correctement 3. Cellules non incubées pendant long assez ou peut prendre du temps pour répondre aux stimulants 4. Développement de la couleur inadéquate 5. Pas assez d&#39;anticorps primaire ou secondaire </td><td> 1. Augmenter le nombre de cellules. Cela nécessitera l&#39;optimisation 2. Également utiliser un contrôle de stimulation positive - un stimulant qui vous savez induire l&#39;expression de votre cytokine / protéine d&#39;intérêt 3. Augmenter le temps d&#39;incubation de cellules ou d&#39;utiliser la méthode indirecte (pré-traitement des cellules avec des stimulants) 4. Surveiller le développement de couleur avec un microscope frais généraux et s&#39;assurer que les réactifs de développement ont été enregistrés correctement et n&#39;ont pas perdu l&#39;activité 5. La concentration de l&#39;anticorps primaire et / ou secondaire devra être augmenté. Cela nécessitera d&#39;optimisation. </td></tr><tr><td> Des zones blanches </td><td> 1. Membrane non pré-traités 2. Membrane a séché à une certaine étape 3. Cellules inégalement répartie </td><td> 1. Assurez-membrane est suffisamment prétraitées avec de l&#39;éthanol à 70% (toutes les membranes n&#39;ont pas besoin de cela afin de vérifier avec votre fournisseur). Lavez-les bien avec du PBS 3X suite 2. Assurer la membrane ne sèche pas 3. Assurez-vous mélangez délicatement les cellules d&#39;avoir une bonne suspension homologue cellulaire avant de pipetage sur dans les puits </td></tr><tr><td> Centre Blank </td><td> 1. Les dommages causés par le lavage </td><td> 1. Débit sur la rondelle automatisé (ou pipette) peut être trop élevé. Besoin d&#39;une procédure de lavage plus doux </td></tr><tr><td> Faux positifs </td><td> 1. Agrégats d&#39;anticorps secondaire 2. Cellules toujours sur la membrane 3. Contamination de la culture cellulaire </td><td> 1. Filtrer les anticorps secondaire 2. S&#39;assurer que tous les cellules sont lavées de la membrane avec du PBS Tween 20 avant l&#39;incubation anticorps secondaire. Les cellules à gauche sur la membrane donnera irrégulière des taches en forme 3. Gardez réactifs comme stérile et propre que possible. Assurez votre technique de culture cellulaire est aseptique. Vérifier les faux positifs en exécutant un média de contrôle négatif. Pour le mouvement des plaques, <a href="http://www.abcam.com/index.html?pageconfig=resource&amp;rid=11457#7">des taches mal définies</a> </td></tr><tr><td> Spots Confluent </td><td> 1. Revêtement pauvres, trop d&#39;anticorps 2. Culture cellulaire prolongé 3. Cellules sur-stimulé </td><td> 1. Réduire la concentration d&#39;anticorps primaires 2. Le plus les cellules sont incubées, plus de cytokines / protéines qu&#39;ils sécrètent. Cela se traduira par de plus grandes taches qui commencent à fusionner et deviennent indiscernables. 3. Réduire la culture de cellules d&#39;incubation pas de temps. Sur-stimulation se traduira par un grand nombre de cytokines / protéines sont sécrétées par la cellule. Ceci va produire des taches qui vont commencer à fusionner et deviennent indiscernables. Réduire la quantité de stimulants dans les milieux de culture ou de culture pour un court laps de temps </td></tr><tr><td> Spots mal définis </td><td> 1. Membrane non pré-traités (si votre membrane nécessite ce sujet, consultez le fournisseur) 2. Le mouvement des plaques pendant l&#39;incubation des cellules </td><td> 1. La membrane doit être pré-traitées avec de l&#39;éthanol ou de ce qui peut entraîner floue, taches mal définies. Il sera difficile pour le lecteur de distinguer ces 2. Ne pas laisser la plaque de se déplacer pendant l&#39;incubation des cellules comme les cellules qui ont déménagé va créer plus d&#39;un spot. Si possible utiliser un incubateur qui consacre ne sera pas ouvert pendant l&#39;incubation. Ne touchez pas la plaque après l&#39;ajout de cellules </td></tr><tr><td> Contrôle positif puits est faible </td><td> 1. Le sous-développement - peut être une conséquence de l&#39;utilisation de streptavidine ALP et / ou BCIP / NBT solutions qui n&#39;ont pas été portées à la température ambiante </td><td> 1. Amener les réactifs à température ambiante avant d&#39;ajouter dans les puits </td></tr><tr><td> Densité des points, il est difficile de les quantifier </td><td> 1. Trop de cellules ont été ajoutées aux puits </td><td> 1. Faire des dilutions de cellules (par exemple, 1 x 10 6, 5 x 10 5, 1 x 10 5, 5 x 10 4, 1 x 10 4 cellules par puits) pour déterminer le nombre optimal de cellules qui se traduira par la formation de taches distinctes </td></tr></tbody></table>

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	<li>Dosanjh, D. P., Hinks, T. S., Innes, J. A., Deeks, J. J., Pasvol, G., Hackforth, S., Varia, H., Millington, K. A., Gunatheesan, R., Guyot-Revol, V., Lalvani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+diagnostic+evaluation+of+suspected+tuberculosis.">Improved diagnostic evaluation of suspected tuberculosis.</a> Ann Intern Med. 148, 325-336 (2008).</li><li>Sung, H. K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+abdominal+tuberculosis+by+T-cell+based+assays+on+peripheral+blood+and+peritoneal+fluid+mononuclear+cells.">Diagnosis of abdominal tuberculosis by T-cell based assays on peripheral blood and peritoneal fluid mononuclear cells.</a> Journal of Infection. 59, 409-415 (2009).</li><li>Kim, S. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+Central+Nervous+System+Tuberculosis+by+T-Cell-Based+Assays+on+Peripheral+Blood+and+Cerebrospinal+Fluid+Mononuclear+Cells.">Diagnosis of Central Nervous System Tuberculosis by T-Cell-Based Assays on Peripheral Blood and Cerebrospinal Fluid Mononuclear Cells.</a> Clinical and Vaccine Immunology. , 1356-1362 (2008).</li><li>Drake, W. P., Dhason, M. S., Nadaf, M., Shepherd, B. E., Vadivelu, S., Hajizadeh, R., Newman, L. S., Kalams, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+recognition+of+Mycobacterium+tuberculosis+ESAT-6+and+KatG+peptides+in+systemic+sarcoidosis.">Cellular recognition of Mycobacterium tuberculosis ESAT-6 and KatG peptides in systemic sarcoidosis.</a> Infect Immun. 75, 527-530 (2007).</li><li>Allen, S. S., Evans, W., Carlisle, J., Hajizadeh, R., Nadaf, M., Shepherd, B. E., Pride, D. T., Johnson, J. E., Drake, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+dismutase+A+antigens+derived+from+molecular+analysis+of+sarcoidosis+granulomas+elicit+systemic+Th-1+immune+responses.">Superoxide dismutase A antigens derived from molecular analysis of sarcoidosis granulomas elicit systemic Th-1 immune responses.</a> Respir Res. 25, 36-36 (2008).</li><li>Mutsvangwa, J., Millington, K. A., Chaka, K., Mavhudzi, T., Cheung, Y. B., Mason, P. R., Butterworth, A. E., Corbett, E. L., Lalvani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+recent+Mycobacterium+tuberculosis+transmission+in+the+setting+of+high+HIV+and+TB+burden.">Identifying recent Mycobacterium tuberculosis transmission in the setting of high HIV and TB burden.</a> Thorax. 65, 315-320 (2010).</li><li>Streeck, H., Frahm, N., Walker, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+IFN-gamma+Elispot+assay+in+HIV+vaccine+research.">The role of IFN-gamma Elispot assay in HIV vaccine research.</a> Nat Protoc. 4, 461-469 (2009).</li><li>Chaudhary, N., Staab, J. F., Marr, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Healthy+human+T-Cell+Responses+to+Aspergillus+fumigatus+antigens.">Healthy human T-Cell Responses to Aspergillus fumigatus antigens.</a> PLoS One. 5, e9036-e9036 (2010).</li><li>Manigold, T., Mori, A., Graumann, R., Llop, E., Simon, V., Ferr, S. M., Valdivieso, F., Castillo, C., Hjelle, B., Vial, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+differentiated,+resting+gn-specific+memory+CD8++T+cells+persist+years+after+infection+by+andes+hantavirus.">Highly differentiated, resting gn-specific memory CD8+ T cells persist years after infection by andes hantavirus.</a> PLoS Pathog. 6, e1000779-e1000779 (2010).</li><li>Ndongala, M. L., Kamya, P., Boulet, S., Peretz, Y., Rouleau, D., Tremblay, C., Leblanc, R., C&#244;t&#233;, P., Baril, J. G., Thomas, R., V&#233;zina, S., Boulassel, M. R., Routy, J. P., S&#233;kaly, R. P., Bernard, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+function+of+HIV-specific+T-cell+responses+with+increasing+time+from+infection.">Changes in function of HIV-specific T-cell responses with increasing time from infection.</a> Viral Immunol. 2, 159-168 (2010).</li></ol>

Le test ELISPOT a émergé comme l&#39;un des essais les plus importants et largement utilisé pour surveiller la réponse immunitaire chez les humains et une variété d&#39;autres espèces. Avec le test ELISPOT, les fréquences des cellules immunitaires peuvent être mesurés au niveau de la cellule unique sans expansion ou la manipulation des populations de cellules. Test ELISPOT a été largement appliqué pour étudier les réponses immunitaires spécifiques d&#39;antigènes dans diverses maladies, y compris les in...

A. Préparation des médias <img src="/files/ftp_upload/2221/2221materialsA.jpg" alt="Matériaux Une" /> B. Préparation d&#39;un tampon Tris <ol><li> Ajouter 800 ml de DDH 2 O à 1 bécher L. </li><li> Mesure 12 grammes de tris et d&#39;ajouter dans le bécher. </li><li> Ajouter 0,12 g de chlorure de magnésium hexahydraté (MgCl 2: 6H 2 O) dans le bécher. </li><li> Remuer avec tige agitation magnétique sur une plaque en remuant automatique. </li><li> Une fois dissous, le pH de la solution à 9,5. </li><li> Ajouter 200 ml de DDH 2 O dans le bécher, le portant à 1000ml. </li><li> Filtrer la solution avec un filtre de 0,22 um. </li></ol> C. Matériaux nécessaires à l&#39;analyse ELISPOT: <img src="/files/ftp_upload/2221/2221materialsb.jpg" alt="Matériaux B" />

enzyme-linked immunospot assay (elispot):  quantification of th-1 cellular immune responses against microbial antigens

L&#39;immunité adaptative est une composante importante à la clairance des pathogènes intracellulaires. La capacité de détecter et de quantifier ces réponses chez les humains est un outil important de diagnostic. L&#39;épreuve immuno-enzymatique immunospot (ELISPOT) gagne en popularité pour sa capacité à identifier les réponses immunitaires cellulaires contre les antigènes microbiens, y compris les populations immunodéprimées comme les personnes ayant une infection à VIH, transplantation, et l&#39;utilisation de stéroïdes. Ce test a la capacité de quantifier les réponses immunitaires contre les antigènes microbiens spécifiques, ainsi que la distinction si ces réponses sont Th1 ou Th2 dans le caractère. ELISPOT n&#39;est pas limité au site de l&#39;inflammation. Il est polyvalent dans sa capacité à évaluer les réponses immunitaires au sein du sang périphérique, ainsi que les sites de la participation active tels que lavage broncho-alvéolaire, liquide céphalo-rachidien, et une ascite. Détection des réponses immunitaires contre un seul ou plusieurs antigènes est possible, ainsi que des épitopes spécifiques dans les protéines microbiennes. Ce test facilite la détection des réponses immunitaires au cours du temps, ainsi que des distinctions dans les antigènes reconnus par des lymphocytes T hôte. Double tests ELISPOT couleurs sont disponibles pour la détection de l&#39;expression simultanée de deux cytokines. Les applications récentes de cette technique comprennent le diagnostic de tuberculose extrapulmonaire, ainsi que des enquêtes de la contribution des antigènes maladies infectieuses aux maladies auto-immunes.

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Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Identification de cibles microbiennes de l&#39;immunité adaptative dans les maladies idiopathiques qui peut être accompli par l&#39;utilisation du dosage immuno-enzymatique.

ELISA immunospot (ELISPOT): Quantification des Th-1 réponses immunitaires cellulaires contre des antigènes microbiens

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

34.6K vues.  Vanderbilt University School of Medicine. Identification de cibles microbiennes de l'immunité adaptative dans les maladies idiopathiques qui peut être accompli par l'utilisation du dosage immuno-enzymatique.

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Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human papillomavirus (HPV), that cause localized infections. The steps involved are identifying region(s) of HPV proteins that contain T-cell epitope(s) from a subject, selecting for the peptide-specific T cells based on interferon-&gamma; (IFN-&gamma;) secretion, and growing and characterizing the T-cell clones (Fig. 1). Subject 1 was a patient who was recently diagnosed with a high-grade squamous intraepithelial lesion by biopsy and underwent loop electrical excision procedure for treatment on the day the T cells were collected1. A region within the human papillomavirus type 16 (HPV 16) E6 and E7 proteins which contained a T-cell epitope was identified using an IFN- g enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay performed with overlapping synthetic peptides (Fig. 2). The data from this assay were used not only to identify a region containing a T-cell epitope, but also to estimate the number of epitope specific T cells and to isolate them on the basis of IFN- &gamma; secretion using commercially available magnetic beads (CD8 T-cell isolation kit, Miltenyi Biotec, Auburn CA). The selected IFN-&gamma; secreting T cells were diluted and grown singly in the presence of an irradiated feeder cell mixture in order to support the growth of a single T-cell per well. These T-cell clones were screened using an IFN- &gamma; ELISPOT assay in the presence of peptides covering the identified region and autologous Epstein-Barr virus transformed B-lymphoblastoid cells (LCLs, obtained how described by Walls and Crawford)2 in order to minimize the number of T-cell clone cells needed. Instead of using 1 x 105 cells per well typically used in ELISPOT assays1,3, 1,000 T-cell clone cells in the presence of 1 x 105 autologous LCLs were used, dramatically reducing the number of T-cell clone cells needed. The autologous LCLs served not only to present peptide antigens to the T-cell clone cells, but also to keep a high cell density in the wells allowing the epitope-specific T-cell clone cells to secrete IFN-&gamma;. This assures successful performance of IFN-&gamma; ELISPOT assay. Similarly, IFN- &gamma; ELISPOT assays were utilized to characterize the minimal and optimal amino acid sequence of the CD8 T-cell epitope (HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY) and its HLA class I restriction element (B58). The IFN- &gamma; ELISPOT assay was also performed using autologous LCLs infected with vaccinia virus expressing HPV 16 E6 or E7 protein. The result demonstrated that the E6 T-cell epitope was endogenously processed. The cross-recognition of homologous T-cell epitope of other high-risk HPV types was shown. This method can also be used to describe CD4 T-cell epitopes4.

Use of Interferon-&amp;#947; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Characterizing T-cell epitopes of pathogens that cause localized infections such as human papillomavirus is a challenge because of limited number of T cells in circulation. A method is described in which rare T cells were isolated and were characterized starting with a very small number of cells.

Utilisation de l&#39;interféron γ-enzymatique de dosage immunoenzymatique pour caractériser les nouveaux épitopes de lymphocytes T de virus du papillome humain

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human ...

Recherche

Immunologie et infection

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is controlled up to 95 % of the T cells generated during the expansion phase are eliminated (i.e., contraction phase) and memory T cells remain, sometimes for a lifetime. In humans, two functionally distinct subsets of memory T cells have been described based on the expression of lymph node homing receptors. Central memory T cells express C-C chemokine receptor 7 and CD45RO and are mainly located in T-cell areas of secondary lymphoid organs. Effector memory T cells express CD45RO, lack CCR7 and display receptors associated with lymphocyte homing to peripheral or inflamed tissues. Effector T cells do not express either CCR7 or CD45RO but upon encounter with antigen produce effector cytokines, such as interferon-&#947;. Interferon-&#947; release assays are used for the diagnosis of bovine and human tuberculosis and detect primarily effector and effector memory T cell responses. Central memory T cell responses by CD4+ T cells to vaccination, on the other hand, may be used to predict vaccine efficacy, as demonstrated with simian immunodeficiency virus infection of non-human primates, tuberculosis in mice, and malaria in humans. Several studies with mice and humans as well as unpublished data on cattle, have demonstrated that interferon-&#947; ELISPOT assays measure central memory T cell responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are cultured in decreasing concentration of antigen for 10 to 14 days (long-term culture), allowing effector responses to peak and wane; facilitating central memory T cells to differentiate and expand within the culture.

Application of Long-term cultured Interferon-&amp;#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Long-term cultured interferon-&#947; enzyme-linked immunospot assay is used as a measure of central memory responses and correlates with protective anti-mycobacterial vaccine responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are stimulated with mycobacterial antigens and interleukin-2 for 14 days, enabling differentiation and expansion of central memory T cells.

Application de long terme de culture interféron-γ-enzymatique immunospot Essai d&#39;évaluation de mémoires et effectrices réponses des cellules T chez les bovins

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

Mesure de la grippe neuraminidase Inhibition Titres d&#39;anticorps par-enzymatique lectine Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

Isolement de Salmonella typhimurium-contenant des Phagosomes des Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. This system enables the quantification of human IFN-&#945; protein with unprecedented sensitivity, and with no cross-reactivity for other species of IFN.
The first key step of the protocol is the choice of the antibody pair, followed by the conjugation of the capture antibody to paramagnetic beads, and biotinylation of the detection antibody. Following this step, different parameters such as assay configuration, detector antibody concentration, and buffer composition can be modified until optimum sensitivity is achieved. Finally, specificity and reproducibility of the method are assessed to ensure confidence in the results. Here, we developed an IFN-&#945; single molecule array assay with a limit of detection of 0.69 fg/mL using high-affinity autoantibodies isolated from patients with biallelic mutations in the autoimmune regulator (AIRE) protein causing autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED). Importantly, these antibodies enabled detection of all 13 IFN-&#945; subtypes.
This new methodology allows the detection and quantification of IFN-&#945; protein in human biological samples at attomolar concentrations for the first time. Such a tool will be highly useful in monitoring the levels of this cytokine in human health and disease states, most particularly infection, autoimmunity, and autoinflammation.

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&amp;#945;

Here we present a protocol to describe the development and validation of a single molecule array digital ELISA assay, which enables the ultra-sensitive detection of all IFN-&#945; subtypes in human samples.

Développement et Validation d’une seule molécule ultrasensible de tableau numérique Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human interféron-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a formidable defense against invading pathogens via diverse mechanisms. One major goal of vaccination is to induce protective antigen-specific antibodies to prevent life-threatening infections. Both thymus-dependent (TD) and thymus-independent (TI) antigens can elicit robust antigen-specific IgM responses and can also induce the production of isotype-switched antibodies (IgG, IgA and IgE) as well as the generation of memory B cells with the help provided by antigen presenting cells (APCs). Here, we describe a protocol to characterize TD and TI Ig isotype responses in mice using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). In this protocol, TD and TI Ig responses are elicited in mice by intraperitoneal (i.p.) immunization with hapten-conjugated model antigens TNP-KLH (in alum) and TNP-polysaccharide (in PBS), respectively. To induce TD memory response, a booster immunization of TNP-KLH in alum is given at 3 weeks after the first immunization with the same antigen/adjuvant. Mouse sera are harvested at different time points before and after immunization. Total serum Ig levels and TNP-specific antibodies are subsequently quantified using Ig isotype-specific Sandwich and indirect ELISA, respectively. In order to correctly quantify the serum concentration of each Ig isotype, the samples need to be appropriately diluted to fit within the linear range of the standard curves. Using this protocol, we have consistently obtained reliable results with high specificity and sensitivity. When used in combination with other complementary methods such as flow cytometry, in vitro culture of splenic B cells and immunohistochemical staining (IHC), this protocol will allow researchers to gain a comprehensive understanding of antibody responses in a given experimental setting.

In this paper, we describe a protocol to characterize T-dependent and T-independent immunoglobulin (Ig) isotype responses in mice using ELISA. This method used alone or in combination with flow cytometry will allow researchers to identify differences in B cell-mediated Ig isotype responses in mice following T-dependent and T-independent antigen immunization.

Caractérisation des Thymus-dépendants et indépendants de Thymus immunoglobuline Isotype réponses chez la souris à l’aide d’Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

Optimized Interferon-gamma ELISpot Assay to Measure T Cell Responses in the Guinea Pig Model after Vaccination

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, influenza, diphtheria, and viral hemorrhagic fevers. We have demonstrated that plasmid-DNA (pDNA) vaccine delivery into the skin elicits robust humoral responses in the guinea pig. However, the use of this animal to model immune responses was somewhat limited in the past due to the lack of available reagents and protocols to study T cell responses. T cells play a pivotal role in both immunoprophylactic and immunotherapeutic mechanisms. Understanding T cell responses is crucial for the development of infectious disease and oncology vaccines and accommodating delivery devices. Here we describe an interferon-gamma (IFN-&#947;) enzyme-linked immunospot (ELISpot) assay for guinea pig peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The assay enables researchers to characterize vaccine-specific T-cell responses in this important rodent model. The ability to assay cells isolated from the peripheral blood provides the opportunity to track immunogenicity in individual animals.

The development of the interferon-gamma ELISpot assay for guinea pig PBMCs allows the characterization of T-cell responses in this highly relevant model for studying infectious diseases. We have applied the assay to measure T cell responses associated with intradermal delivery of DNA vaccines.

Test ELISpot interféron-gamma optimisé à mesure les réponses des cellules T dans le modèle cobaye après Vaccination

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

Évaluation des réponses de l’hôte-pathogène et l’efficacité du vaccin chez la souris

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental procedure in which phagocytic cells are co-cultured with bacterial units. The immune cells will phagocytose and kill the bacterial cultures in a complement-dependent manner. The efficiency of the immune-mediated cell killing is dependent on a number of factors and can be used to determine how different bacterial cultures compare with regard to resistance to cell death. In this way, the efficacy of potential immune-based therapeutics can be assessed against specific bacterial strains and/or serotypes. In this protocol, we describe a simplified OPKA that utilizes basic culture conditions and cell counting to determine bacterial cell viability after co-culture with treatment conditions and HL-60 immune cells. This method has been successfully utilized with a number of different pneumococcal serotypes, capsular and acapsular strains, and other bacterial species. The advantages of this OPKA protocol are its simplicity, versatility (as this assay is not limited to antibody treatments as opsonins), and minimization of time and reagents to assess basic experimental groups.

This opsonophagocytic killing assay is used to compare the ability of phagocytic immune cells to respond to and kill bacteria based on different treatments and/or conditions. Classically, this assay serves as the gold&#160;standard for assessing effector functions of antibodies raised against a bacterium as opsonin.

Opsonophagocytic meurtre dosage pour évaluer les réponses immunologiques contre les bactéries pathogènes

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Assessing Respiratory Immune Responses to Haemophilus Influenzae

Haemophilus influenzae (Hi) is a prevalent bacterium found in a range of respiratory conditions. A variety of different assays/techniques may be used to assess the respiratory immune/inflammatory response to this bacterium. Flow cytometry and confocal microscopy are fluorescence-based technologies that allow detailed characterization of biological responses.&#160;Different forms of Hi antigen can be used, including cell wall components, killed/inactivated preparations, and live bacteria. Hi is a fastidious bacterium that requires enriched media but is generally easy to grow in standard laboratory settings. Tissue samples for stimulation with Hi may be obtained from peripheral blood, bronchoscopy, or resected lung (e.g., in patients undergoing surgery for the treatment of lung cancer). Macrophage and neutrophil function may be comprehensively assessed using flow cytometry with a variety of parameters measured, including phagocytosis, reactive oxygen species, and intracellular cytokine production. Lymphocyte function (e.g., T cell and NK cell function) may be specifically assessed using flow cytometry, principally for intracellular cytokine production. Hi infection is a potent inducer of extracellular trap production, both by neutrophils (NETs) and macrophages (METs). Confocal microscopy is arguably the most optimal way to assess NET and MET expression, which may also be used to assess protease activity. Lung immunity to Haemophilus influenzae can be assessed using flow cytometry and confocal microscopy.

Assessing Respiratory Immune Responses to Haemophilus Influenzae

Haemophilus influenzae induces inflammation in the respiratory tract. This article will focus on the use of flow cytometry and confocal microscopy to define immune responses by phagocytes and lymphocytes in response to this bacterium.

Évaluation des réponses immunitaires respiratoires à Haemophilus influenzae

Haemophilus influenzae (Hi) is a prevalent bacterium found in a range of respiratory conditions. A variety of different assays/techniques may be used to ...