Les auteurs tiennent à remercier les participants de l&#39;étude et de leurs parents. Nous tenons également à remercier le Dr Réjean Lapointe (CHUM Notre-Dame, Montréal, Canada) pour l&#39;accès à son lecteur ELISpot, le Dr Lubo Alexandrov pour l&#39;analyse statistique, et Denis Blais, Sandra Caron, Silvie Valois et Martine Caty pour expert technique assistance. Pris en charge par des subventions du Fonds d&#39;opération le Pour Les Projets de recherche clinique et D&#39;évalutation des technologies (CHU Sainte-Justine) à HS et PO, par la Fondation Centre de cancérologie Charles-Bruneau, et par la Leukemia &amp; Lymphoma Society de Canada. ISF a été soutenu par des bourses de la Fondation CHU Sainte-Justine et le Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQS). AJG a été le récipiendaire de bourses du Département de microbiologie, infectiologie et d&#39;immunologie de l&#39;Université de Montréal (Bourse Gabriel-Marquis), FRQS, et les Instituts de la santé Recherche du Canada (IRSC). NM a été soutenu par la Fondation CHU Sainte-Justine, la Fondation Cole, et FRQS.

Ce protocole de recherche a été approuvé par le Conseil du CHU Sainte-Justine, Montréal, Québec, Canada, où l&#39;étude a été menée institutionnelle d&#39;évaluation éthique. Le consentement éclairé a été demandé et obtenu de tous les participants à l&#39;étude, leurs parents ou tuteurs légaux. Toutes les procédures effectuées aux jours 1 et 2 doivent être effectuées dans des conditions stériles (c&#39;est à dire sous une hotte à flux laminaire). Les procédures de sécurité standard pour la manipulation du sang humain doivent être strictement respectées. 1. Revêtement des plaques <ol><li> Perméabiliser le polyfluorure de vinylidène (PVDF) des membranes en bas de 96 puits MultiScreen IP plaques ELISpot blanc en ajoutant à chaque puits 20 ul d&#39;éthanol à 35% pendant 1 min. Membranes devraient être légèrement translucide. </li><li> Laver immédiatement les puits 3 fois avec 200 pi de 1x tampon phosphate salin (PBS; mM NaCl 137 mM, KCl 2,7, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4, pH 7,4) en utilisant un multichannel pipette ou un dispositif similaire. Cette étape est essentielle dans la mesure où les résidus d&#39;éthanol peuvent affecter la viabilité des cellules et la liaison de l&#39;anticorps de capture. Plaques ELISpot sont fragiles et doivent être manipulés avec soin: l&#39;utilisation d&#39;un laveur de plaques automatique n&#39;est pas recommandée. </li><li> Enduire les puits avec 10 pi de souris purifié anticorps de capture d&#39;IFN-γ d&#39;anti-humaine diluée dans 1 x PBS à une concentration finale de 10 pg / ml. Couvrir les plaques avec une pellicule de plastique ordinaire et incuber une nuit à 4 ° C. </li></ol> 2. Plaques de blocage <ol><li> Vider les puits, en tapant les sécher et laver les plaques 5 fois avec 200 pi de PBS 1x. </li><li> Remplir les puits avec 200 pi de milieu RPMI 1640 complet et incuber les plaques pendant 2 heures à 37 ° C (étape de blocage). </li><li> Laver les plaques 5x avec 200 pi de PBS 1x et gardent les puits plein de 1x PBS jusqu&#39;à ce que les cellules sont prêtes à être plaqué. </li></ol> 3. Cellule de placage et de stimulation <ol><li> Préparer peripheral cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) à partir d&#39;échantillons de sang veineux humain par centrifugation sur des gradients de Ficoll-Paque à l&#39;aide de procédures standard. Sinon, en utilisant des méthodes standards, décongeler aliquotes de PBMC congelés dans l&#39;azote liquide. Après centrifugation, les derniers, remettre les cellules à une concentration finale de 2 x 10 6 cellules / ml et incuber une nuit à 37 ° C sous une atmosphère de CO2 à 5% dans un incubateur à chemise d&#39;eau. </li><li> Retirer les PBMC de l&#39;incubateur et de les remettre en suspension dans un volume final de 5 ml de milieu RPMI 1640 complet. </li><li> Incuber les PBMC en présence de 10 ul de l&#39;endonucléase de génie génétique à partir de Serratia marcescens pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Supprimer une aliquote de 50 ul de PBMC et mélanger avec 50 pi de colorant bleu trypan. Compter les cellules et estimer% de viabilité en utilisant un hématimètre et l&#39;examen microscopique (méthode d&#39;exclusion de colorant). Divers procédés automatisés pour le comptage des cellules et l&#39;évaluation de la viabilité des cellules can aldonc être utilisé. PBMC doit être&gt; 95% viable. Jeter l&#39;échantillon lorsque la viabilité est inférieure à 95%. </li><li> Centrifugeuse PBMC à 700 xg pendant 5 minutes, jeter le surnageant et remettre les cellules dans du milieu AIM-V supplémenté avec 2% (v / v) de sérum humain inactivé (HIS) à une concentration finale de 2 x 10 6 cellules / ml. Maintenir à 37 ° C jusqu&#39;à ce que des mélanges de stimulation sont ajoutés à la plaque. </li><li> Ajouter dans les puits, une goutte à la fois, 100 ul du mélange de stimulation approprié. Trois mélanges de stimulation doivent être utilisées comme décrit ci-dessous: <ol><li> Utilisez milieu AIM-V complété avec 2% (v / v) de sérum humain inactivé (IHS) de contrôle négatif. </li><li> Utilisation d&#39;anticorps monoclonal anti-CD3 (OKT3 clone) dilué dans du milieu AIM-V supplémenté avec 2% (v / v) IHS à une concentration finale de 0,5 ug / ml comme contrôle positif). </li><li> Utilisez antigène VZV, sous la forme soit de γ-irradiés (10000 Gy; 30 min d&#39;exposition) vaccin vivant atténué VZV (unités formant plaque 1350 [UFP] / ml) de dilutionted 1:200 dans du milieu AIM-V supplémenté avec 2% (v / v) IHS) ou 1 ug d&#39;un mélange équimolaire de 67 peptides (15 résidus d&#39;acides aminés) synthétisé sur la base de la séquence du VZV immédiatement précoce (IE63) phosphoprotéine . Contrôler l&#39;irradiation efficacité en surveillant l&#39;absence de signes visibles d&#39;effets cytopathiques après 4 jours dans les cultures de CMSP. </li><li> Préparer tous les puits en double. </li></ol></li><li> Ajouter dans les puits, une goutte à la fois, à 100 ul de cellules préparées à l&#39;étape 5.4 dans les puits appropriés. Deux puits devraient être laissés sans cellules (contrôle négatif). Incuber pendant 20 heures à 37 ° C sous une atmosphère de CO2 à 5% dans un incubateur à chemise d&#39;eau. Ne secouez pas, déplacer ou empiler les plaques l&#39;une sur l&#39;autre pendant l&#39;incubation. </li></ol> 4. Spot de développement et de détection <ol><li> Jeter les cellules et laver les plaques 10x avec 1x PBS additionné de 0,05% (v / v) de Tween 20 (PBST). Tween 20 permet que les cellules ont adhéré au PVDF me détacherMbrane après incubation pendant la nuit. </li><li> En utilisant une pipette multicanaux, ajouter 100 ul de 0,5 mg / ml de biotine conjugué à un anticorps monoclonal anti-IFN-γ (4S.B3 clone) dilué dans 1 x PBS contenant 0,5% (p / v) de sérum-albumine bovine (BSA). Incuber les plaques pendant 2 h à température ambiante. </li><li> Laver les puits 6x avec du PBST et ajouter dans chaque puits 100 pi de streptavidine conjugatd avec la phosphatase alcaline dilué 1:1000 dans 1x PBS contenant 0,5% (p / v) de BSA. Couvrir et incuber les plaques pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Laver les plaques 3 fois avec PBST et 3x avec PBS 1x. Ajouter 100 ul d&#39;un phosphate de 5-bromo-4-chloro-3-indolyle (BCIP) / nitro bleu de tétrazolium chlorure (NBT) Solution de substrat et incuber 5 minutes à température ambiante. </li><li> Laver les plaques sous l&#39;eau distillée. Retirer la partie inférieure de la plaque ELISpot et laver les deux côtés de la membrane avec de l&#39;eau distillée. Air sécher les plaques. </li><li> Examiner les puits et énumérer les points à l&#39;aide d&#39;un d stéréoscopiquemicroscope issection ou scanner les plaques à l&#39;aide d&#39;un compteur de point automatique. Garder les assiettes abri de la lumière si elles ne peuvent pas être examinés le même jour. <ol><li> Calculer la moyenne des nombres de points comptés dans les puits en double correspondantes et soustraire le nombre de spots comptés dans les puits témoins négatifs (pas de cellules) à partir du nombre de points comptés dans les puits de test. </li><li> Exprimer la production d&#39;IFN-γ en tant que le nombre d&#39;unités formant des taches (SFU) pour 10 6 CMSP. </li><li> Considérez que les échantillons d&#39;essai sont positifs si le nombre de SFU est&gt; 50 10 6 PBMC et 2 déviations standard (SD) au-dessus du contrôle négatif (cellules + milieu AIM-V complété avec 2% (v / v) IHS). </li><li> Utilisez une valeur de 400 SFU par puits lorsque les taches sont trop nombreux pour être comptés. </li></ol></li><li> Tester si les données ELISpot sont normalement distribués ou non à l&#39;aide du test de Kolmogorov-Smirnov. Lorsque les données sont distribuées normalement, effectuer des comparaisons statistiques en utilisant les T-tes de l&#39;étudiantt (2 groupes) ou analyse de la variance et le post-test de Bonferroni (de comparaisons multiples). Si les données ne sont pas distribuées normalement, utiliser le test de Mann-Whitney (2 groupes) ou le test de Kruskal-Wallis et post-test de Dunn (comparaisons multiples). </li></ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Modifications et dépannage: essais IFN-γ ELISpot ont été utilisées pour examiner les réponses immunitaires à médiation cellulaire dirigée contre une variété de pathogènes microbiens, y compris le type de virus de l&#39;immunodéficience humaine 1 (VIH-1) 24,25, virus de l&#39;hépatite C (VHC) 26, 27, et Mycobacterium tuberculosis 28,29, pour n&#39;en nommer que quelques-uns. Ici, nous avons décrit le développement d&#39;un test ELISPOT IFN-γ pour mesurer l&#39;im...

Tout d&#39;abord effectuée en 1989, UCBT est de plus en plus utilisé dans le cadre du traitement de différentes maladies du sang néoplasiques et non néoplasiques chez les enfants de 1. Le VZV est un alphaherpèsvirus humaine cytopathique qui provoque deux maladies différentes, la varicelle (après l&#39;infection primaire) et l&#39;herpès zoster (après réactivation). Après l&#39;infection primaire, le VZV persiste tout au long de la vie de l&#39;hôte à l&#39;abri dans les nerfs sensoriels de ganglions rachidiens. Une des complications infectieuses les plus menaçants suivants UCBT est associé à VZV 2-4. Dans notre centre clinique, en l&#39;absence de prophylaxie VZV, l&#39;incidence cumulative de la maladie VZV maladie de VZV à 3 ans était de 46% postUCBT 2. Chez ces patients, l&#39;infection de novo avec ou réactivation du VZV est souvent associée à la diffusion viscérale pour le système nerveux central, les poumons et le foie 5-7. En prophylaxie résultat, l&#39;acyclovir, le valacyclovir ou le famciclovir est couramment administré à UBBénéficiaires CT 8,9. Cependant, cette stratégie de traitement ne prend pas en compte le potentiel de protection de lymphocytes T spécifiques de VZV ou la cinétique de reconstitution des réponses des lymphocytes T spécifiques de VZV. Problèmes potentiels liés à l&#39;utilisation croissante de la prophylaxie anti-herpétiques à long terme comprennent a) surtraitement patient; b) le développement de la résistance aux antiviraux 10,11; et c) la dégradation du VZV reconstitution immunitaire spécifique 12,13. Parce que la détection des lymphocytes T spécifiques fonctionnels VZV est en corrélation avec la présence d&#39;une protection à long terme de l&#39;infection VZV et l&#39;amélioration de l&#39;issue clinique 4,14,15, le suivi des réponses immunitaires à médiation cellulaire dirigée contre le VZV pendant la période post-transplantation pourrait aboutir à une utilisation plus rationnelle des médicaments antiviraux traitement en permettant aux médecins de distinguer les patients qui pourraient bénéficier de la prophylaxie VZV de celles dont le système immunitaire est capable de contrôler la réplication du VZV 4,13. Le test ELISPOT IFN-γ est largement utilisé pour les réponses immunitaires médiées par des cellules de contrôle dans une variété de systèmes expérimentaux et les conditions cliniques. Taches sont générées suivant le clivage d&#39;un substrat chromogène, la génération d&#39;un précipité visible et stable au niveau du site de la réaction. Chaque spot individu représente ainsi l&#39;empreinte d&#39;une cellule de cytokine production individuelle. IFN-γ ELISpot non seulement mesure la capacité des cellules individuelles ex vivo pour produire de l&#39;IFN-γ en réponse à une stimulation in vitro avec l&#39;antigène apparenté, mais il fournit également une estimation de la fréquence de la réponse des cellules dans une population cellulaire donnée 16,17. En plus de sa grande sensibilité, l&#39;IFN-γ ELISpot est simple à effectuer, ce qui rend son utilisation possible dans le cadre de protocoles cliniques personnalisés destinés à guider l&#39;initiation ou l&#39;arrêt du traitement antiviral. La procédure décrite ci-dessous décrivantes un test ELISpot qui est spécifiquement conçu pour détecter et mesurer la production d&#39;IFN-γ par les cellules mononucléaires du sang périphérique après stimulation in vitro avec des antigènes dérivés du VZV.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="857">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Leucocep tube</td>
			<td style="width:101px;">VWR</td>
			<td style="width:143px;">89048-936/89048-932</td>
			<td style="width:397px;">12 ml or 50 ml tubes may be used depending on the volume of blood.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ficoll-Paque</td>
			<td style="width:101px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:143px;">17-1440-02</td>
			<td>Protect from light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Benzonase nuclease</td>
			<td style="width:101px;">Novagen</td>
			<td style="width:143px;">70746-3</td>
			<td>Keep at -20 C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MultiScreenHTS-IP Filter Plate</td>
			<td style="width:101px;">Millipore</td>
			<td style="width:143px;">MSIPS4W10</td>
			<td>Sterile with pore size of 0.45 &#181;m.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Mouse anti-human IFN-&#947; capture antibody</td>
			<td style="width:101px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:143px;">551221</td>
			<td>NIB42 clone.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pepmix VZV IE63&#160;</td>
			<td style="width:101px;">JPT Peptide Technologies</td>
			<td style="width:143px;">PM-VZV-IE63</td>
			<td>Dissolve contents of one vial in 40 &#956;L of DMSO. Use within 6 months.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Biotin-conjugated anti-IFN-&#947; monoclonal antibody</td>
			<td style="width:101px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:143px;">554550</td>
			<td>4SB3 clone.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Streptavidin conjugated with alkaline phosphatase&#160;</td>
			<td style="width:101px;">Bio-Rad Life Science</td>
			<td style="width:143px;">170-3554</td>
			<td>Dilute for use on the same day.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">BCIP/NBT</td>
			<td style="width:101px;">Bio-Rad Life Science</td>
			<td style="width:143px;">170-6432</td>
			<td>Protect from light.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of an ifn-&#947; elispot assay to assess varicella-zoster virus-specific cell-mediated immunity following umbilical cord blood transplantation

Virus varicelle-zona (VZV) est une cause importante de morbidité et de mortalité à la suite ombilical transplantation de sang de cordon (UCBT). Pour cette raison, la prophylaxie anti-herpétique est administré systématiquement aux bénéficiaires UCBT pédiatriques pour prévenir les complications associées à l&#39;infection VZV, mais il n&#39;existe aucune preuve fondée sur le consensus solide, qui définit sa durée optimale. Parce T immunité à médiation cellulaire est responsable du contrôle de l&#39;infection VZV, l&#39;évaluation de la reconstitution des réponses des lymphocytes T spécifiques de VZV suivante UCBT pourrait fournir des indications quant à la prophylaxie doivent être maintenues ou peuvent être interrompues. A cette fin, un interféron gamma spécifique VZV (IFN-γ) immunospot lié à une enzyme (ELISPOT) a été développée pour caractériser la production d&#39;IFN-γ par les lymphocytes T en réponse à une stimulation in vitro avec le vaccin contre VZV vivant atténué irradié. Ce test fournit une mesure rapide, reproductible et sensible du VZV c spécifiqueell immunité approprié pour la surveillance de la reconstitution de l&#39;immunité spécifique VZV dans un environnement clinique et d&#39;évaluation de la réponse immunitaire aux antigènes de VZV médiation.

Le protocole ELISPOT IFN-γ détaillé ci-dessus a été développé et optimisé dans notre laboratoire pour mesurer l&#39;ampleur et la qualité des réponses immunitaires à médiation cellulaire dirigées contre le VZV 4. Diverses sources d&#39;antigène VZV peuvent être utilisés pour l&#39;étape de stimulation. Il s&#39;agit notamment: a) disponible dans le commerce détergents extraits inactivés du VZV infectés cellules Vero 18; b) les piscines de chevauchement des peptides synthétiques...

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Development of an IFN-&amp;#947; ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

Générations nouveaux de dosages fonctionnels, tels que l&#39;interféron gamma (IFN-γ) ELISpot, qui détecte la production de cytokines au niveau de la cellule unique et fournissent à la fois la caractérisation quantitative et qualitative des réponses des cellules T peuvent être utilisés pour évaluer les réponses immunitaires à médiation cellulaire dirigées contre la varicelle zoster virus (VZV).

Développement d&#39;une varicelle-zona immunité à médiation cellulaire spécifique-Virus IFN-γ ELISPOT pour évaluer la suite de cordon ombilical transplantation de sang

Varicella zoster virus (VZV) is a significant cause of morbidity and mortality following umbilical cord blood transplantation (UCBT). For this reason, ...

development-an-ifn-elispot-assay-to-assess-varicella-zoster-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Development of an IFN-&#947; ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

15.5K vues.  Université de Montréal.  Générations nouveaux de dosages fonctionnels, tels que l'interféron gamma (IFN-γ) ELISpot, qui détecte la production de cytokines au niveau de la cellule unique et fournissent à la fois la caractérisation quantitative et qualitative des réponses des cellules T peuvent être utilisés pour évaluer les réponses immunitaires à médiation cellulaire dirigées contre la varicelle zoster virus (VZV). 

Vidéo: Development of an IFN-&#947; ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens. The ability to detect and quantify these responses in humans is an important diagnostic tool. The enzyme-linked immunospot assay (ELISPOT) is gaining popularity for its ability to identify cellular immune responses against microbial antigens, including immunosuppressed populations such as those with HIV infection, transplantation, and steroid use. This assay has the capacity to quantify the immune responses against specific microbial antigens, as well as distinguish if these responses are Th1 or Th2 in character. ELISPOT is not limited to the site of inflammation. It is versatile in its ability to assess for immune responses within peripheral blood, as well as sites of active involvement such as bronchoalveolar lavage, cerebral spinal fluid, and ascites. Detection of immune responses against a single or multiple antigens is possible, as well as specific epitopes within microbial proteins. This assay facilitates detection of immune responses over time, as well as distinctions in antigens recognized by host T cells. Dual color ELISPOT assays are available for detection of simultaneous expression of two cytokines. Recent applications for this technique include diagnosis of extrapulmonary tuberculosis, as well as investigation of the contribution of infectious antigens to autoimmune diseases.

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Identification of microbial targets of adaptive immunity in idiopathic diseases can be accomplished by the use of the enzyme-linked immunospot assay.

ELISA immunospot (ELISPOT): Quantification des Th-1 réponses immunitaires cellulaires contre des antigènes microbiens

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

Recherche

Immunologie et infection

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where the CB does not contain appreciable numbers of virus-experienced T cells which can protect the recipient from infection.1-4 We and others have shown that virus-specific CTL generated from seropositive donors and infused to the recipient are safe and protective.5-8 However, until recently, virus-specific T cells could not be generated from cord blood, likely due to the absence of virus-specific memory T cells. 
In an effort to better mimic the in vivo priming conditions of na&iuml;ve T cells, we established a method that used CB-derived dendritic cells (DC) transduced with an adenoviral vector (Ad5f35pp65) containing the immunodominant CMV antigen pp65, hence driving T cell specificity towards CMV and adenovirus.9 At initiation, we use these matured DCs as well as CB-derived T cells in the presence of the cytokines IL-7, IL-12, and IL-15.10 At the second stimulation we used EBV-transformed B cells, or EBV-LCL, which express both latent and lytic EBV antigens. Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL are used to stimulate the T cells in the presence of IL-15 at the second stimulation. Subsequent stimulations use Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL and IL-2. 
From 50x106 CB mononuclear cells we are able to generate upwards of 150 x 106 virus-specific T cells that lyse antigen-pulsed targets and release cytokines in response to antigenic stimulation.11 These cells were manufactured in a GMP-compliant manner using only the 20% fraction of a fractionated cord blood unit and have been translated for clinical use.

Here we describe the first good manufacturing practice (GMP)-compliant method of producing virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) from umbilical cord blood, a source of predominantly na&#238;ve T cells.

L&#39;expansion des lymphocytes T cytotoxiques à partir de sang de cordon ombilical qui cytomégalovirus cible, le virus Epstein-Barr Virus et Adénovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

Application clinique de<em&gt; Belle au Bois Dormant</em&gt; Et artificielle cellules présentatrices d&#39;antigènes pour modifier génétiquement des cellules T du sang de cordon ombilical et périphériques

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for isolating precursor B-cells at four different stages of differentiation. Because genes are expressed and epigenetic modifications occur in a tissue specific manner, it is vital to discriminate between tissues and cell types in order to be able to identify alterations in the genome and the epigenome that may lead to the development of disease. This method can be adapted to any type of cell present in umbilical cord blood at any stage of differentiation.	
This method comprises 4 main steps. First, mononuclear cells are separated by density centrifugation. Second, B-cells are enriched using biotin conjugated antibodies that recognize and remove non B-cells from the mononuclear cells. Third the B-cells are fluorescently labeled with cell surface protein antibodies specific to individual stages of B-cell development. Finally, the fluorescently labeled cells are sorted and individual populations are recovered. The recovered cells are of sufficient quantity and quality to be utilized in downstream nucleic acid assays.

Here we describe a protocol for isolating subsets of precursor B-cells from umbilical cord blood. A sufficient quantity and quality of nucleic acids may be extracted from the cells and used in subsequent assays utilizing DNA or RNA.

Isolement des précurseurs des cellules B des sous-ensembles à partir de sang de cordon ombilical

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a prerequisite for pneumococcal infections such as pneumonia and otitis media. In vitro adherence assays can be used to study the attachment of pneumococci to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions, such as the use of probiotics, to inhibit pneumococcal&#160;colonization.&#160;The protocol described here is used to investigate the effects of the probiotic Streptococcus salivarius on the adherence of pneumococci to the human epithelial cell line CCL-23 (sometimes referred to as HEp-2 cells). The assay involves three main steps: 1) preparation of epithelial and bacterial cells, 2) addition of bacteria to epithelial cell monolayers, and 3) detection of adherent pneumococci by viable counts (serial dilution and plating) or quantitative real-time PCR (qPCR). This technique is relatively straightforward and does not require specialized equipment other than a tissue culture setup. The assay can be used to test other probiotic species and/or potential inhibitors of pneumococcal colonization and can be easily modified to address other scientific questions regarding pneumococcal adherence and invasion.

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

In vitro adherence assays can be used to study the attachment of Streptococcus pneumoniae to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions such as the use of probiotics for inhibiting pneumococcal colonization.

Étude des effets des probiotiques sur la colonisation pneumococcique l&#39;aide d&#39;un<em&gt; In Vitro</em&gt; Respect de dosage

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

Un flux Essai d&#39;adhésion à étudier Leucocyte recrutement pour hépatiques humaines sinusoïdales endothélium dans des conditions de contrainte de cisaillement

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are used for host defense. For the quantitative determination of the functional status of the humoral immune response of an individual, both serum Abs and circulating ASCs are commonly measured as functional readouts. In humans, peripheral blood is the most convenient and readily accessible sample that can be used for the determination of the humoral immune response elicited by host B cells. Distinct B-cell subsets, including ASCs, can be isolated directly from peripheral blood via selection with lineage-specific Ab-conjugated microbeads or via cell sorting with flow cytometry. Moreover, purified na&#239;ve and memory B cells can be activated and differentiated into ASCs in culture. The functional activities of ASCs to contribute to Ab secretion can be quantified by ELISpot, which is an assay that converges enzyme-linked immunoabsorbance assay (ELISA) and western blotting technologies to enable the enumeration of individual ASCs at the single-cell level. In practice, the ELISpot assay has been increasingly used to evaluate vaccine efficacy because of the ease of handling of a large number of blood samples. The methods of isolating human B cells from peripheral blood, the differentiation of B cells into ASCs in vitro, and the employment of ELISpot for the quantification of total IgM- and IgG-ASCs will be described here.

Human peripheral blood is commonly used for the assessment of the humoral immune response. Here, the methods for isolating human B cells from peripheral blood, differentiating human B cells into antibody (Ab)-secreting B cells (ASCs) in culture, and enumerating the total IgM- and IgG-ASCs via an ELISpot assay are described.

L&#39;isolement, la différenciation, et la quantification des anticorps humain sécrétant des cellules B du sang: ELISpot comme indicateur fonctionnel de humorale Immunité

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly versatile in vitro assay that can be modified to examine different aspects of antibody and Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis in both research and clinical settings. The assay utilizes adherent monocytes from peripheral blood mononuclear cells isolated from mammalian whole blood. MMA has been described for use in both human and murine investigations. These monocytes express Fc&#947;Rs (e.g., Fc&#947;RI, Fc&#947;RIIA, Fc&#947;RIIB, and Fc&#947;RIIIA) that are involved in immune responses. The MMA exploits the mechanism of Fc&#947;R-mediated interactions, phagocytosis in particular, where antibody-sensitized red blood cells (RBCs) adhere to and/or activate Fc&#947;Rs and are subsequently phagocytosed by the monocytes. In vivo, primarily tissue macrophages found in the spleen and liver carry out Fc&#947;R-mediated phagocytosis of antibody-opsonized RBCs, causing extravascular hemolysis. By evaluating the level of phagocytosis using the MMA, different aspects of the in vivo Fc&#947;R-mediated process can be investigated. Some applications of the MMA include predicting the clinical relevance of allo- or autoantibodies in a transfusion setting, assessing candidate drugs that promote or inhibit phagocytosis, and combining the assay with fluorescent microscopy or traditional Western immunoblotting to investigate the downstream signaling effects of Fc&#947;R-engaging drugs or antibodies. Some limitations include the laboriousness of this technique, which takes a full day from start to finish, and the requirement of research ethics approval in order to work with mammalian blood. However, with diligence and adequate training, the MMA results can be obtained within a 24-h turnover time.

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&amp;#947; Receptor-mediated Phagocytosis

The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay that utilizes isolated primary monocytes obtained from mammalian peripheral whole blood to evaluate Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis.

Utilisation d&#39;un monocytes monocouche Assay pour évaluer phagocytose Fcy Receptor médiée

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

Basées sur la fluorescence neuraminidase Essai d&#39;inhibition pour évaluer la sensibilité des virus de la grippe à la neuraminidase Inhibiteur Classe de Antiviraux

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for drug discovery, therapeutic target identification, and developing of diagnostics. Here, we present a protocol to discover specific Zika virus (ZIKV) diagnostic peptides using a high-density peptide microarray. A human serum sample validated for ZIKV infection was incubated with a high-density peptide microarray containing the entire ZIKV protein translated into 3,423 unique 15 linear amino acid (aa) residues with a 14-aa residue overlap printed in duplicate. Staining with different secondary antibodies within the same array, we detected peptides that bind to Immunoglobulin M (IgM) and Immunoglobulin G (IgG) antibodies present in serum. These peptides were selected for further validation experiments. In this protocol, we describe the strategy followed to design, process, and analyze a high-density peptide microarray.

In this protocol, we describe a technique to discover Zika virus specific diagnostic peptides using a high-density peptide microarray. This protocol can readly be adapted for other emerging infectious diseases.

Zika Virus spécifique Diagnostic épitope découverte

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...