Ce travail a été financé par la NSF accorde IOB # 0615996.

Partie 1: Préparation de milieux de croissance des nématodes (NGM) boîtes de Pétri Nématodes expérimentale tels que C. elegans et P. pacificus sont généralement cultivées en laboratoire le 6 boîtes de Pétri contenant un milieu de croissance cm nématode (NGM) 1. Worms sont conservés à 20 ° C, mais peuvent être incubés à une gamme de températures (entre 4 ° C - 25 ° C), selon les espèces de nématodes et la conception expérimentale. Pour préparer les plaques avec le NGM, des techniques standard de stériles doivent être utilisés pour prévenir la contamination fongique et bactérienne. Voici le protocole pour préparer des plaques NGM: <ol><li> Peser 15 g d&#39;agar, 2,4 g de NaCl, 2 g de tryptone, et 2,72 g de KH 2 PO 4 en 2 flacon L conique, faire du volume à 1 L avec de l&#39;eau, l&#39;autoclave et laisser refroidir à 60 ° C dans un bain d&#39;eau. </li><li> Ajouter 0,8 ml de chacune des 1 M CaCl 2, le cholestérol (5 mg / ml dans l&#39;éthanol), et 1 M MgSO 4. Pour éviter la contamination fongique et bactérienne, une ml de streptomycine (100 mg / ml) et la nystatine 1ml (10 mg / ml) peut être ajouté à chaque litre de milieu. </li><li> Utiliser une machine Unispense et le maintien des conditions stériles, versez les médias dans les plaques désiré. Les plaques doivent être remplis à environ 2 / 3 ème plein. Un standard de 60 mm de diamètre plateau nécessite environ 10 ml de la presse. Ne pas déplacer les plaques jusqu&#39;à ce que l&#39;agar est totalement gélifiée, sinon il y aura une surface inégale de la gélose, ce qui rend difficile de se concentrer vers sur le stéréomicroscope. </li><li> Une fois séchées, les plaques peuvent être ensemencées immédiatement ou conservés à 4 ° C jusqu&#39;à l&#39;ensemencement avec des bactéries. </li></ol> Partie 2: Préparation des bactéries OP50 et l&#39;ensemencement des boîtes de Petri NGM P. pacificus est cultivée en laboratoire par l&#39;alimentation sur la souche E. coli OP50. OP50 a une croissance limitée sur des plaques NGM, formant ainsi une pelouse fine qui facilite la visualisation des vers 1. Pour développer une culture de la OP50, utiliser LB-bouillon: <ol><li> Ajouter 5 g bactotryptone, 2,5 g extrait de levure et 2,5 g de NaCl à une bouteille de 500 ml bouchon à vis, faire monter le volume à 500 ml avec de l&#39;eau distillée et autoclave. </li><li> Inoculer le bouillon avec une seule colonie de OP50 de la plaque de culture dans des conditions stériles et laisser pousser une nuit à 37 ° C. </li><li> LB-OP50 est prêt à être utilisé et peut être conservé à 4 ° C pendant plusieurs mois si la stérilité est maintenue. Chaque fois que les plaques doivent être ensemencées, versez une petite quantité de bouillon dans un petit bécher stérile et cela aidera à prévenir la contamination de la culture mère. </li><li> Pour plaques de graines, de distribuer 100 à 120 pl de la OP50 sur le 60 mm de diamètre NGM boîte de Pétri et agiter pour la répandre. </li><li> Incuber ces plaques ensemencées nuit à température ambiante pour la pelouse de croître. Ces plaques ensemencées peuvent désormais être conservés à 4 ° C pendant 3 semaines au maximum. Le stockage dans une position inversée permet d&#39;éviter un séchage rapide. </li></ol> Partie 3: Faire un choix Dans cette section, nous décrivons comment faire un choix pour les vers. La pioche est utilisé pour transférer les vers d&#39;un endroit à l&#39;autre. La pioche est faite de calibre 30 en platine iridié de fil de 90% à 10%, bien que certains chercheurs préfèrent des compositions métalliques légèrement différente: <ol><li> Coupez environ 3-4 cm de fil de fer, placer 0,5 cm de l&#39;intérieur de la pointe d&#39;une pipette Pasteur (dont la pointe était cassée à une petite longueur), puis le sceller dans le verre sur un bec Bunsen. La longueur du fil qui dépasse du verre est d&#39;environ 3-3,5 cm, mais peut varier en fonction des préférences individuelles. </li><li> Aplatir la fin du fil qui est en saillie à l&#39;aide d&#39;un marteau ou une pince. Puis plier la partie aplatie vers le haut pour former une boule. </li><li> Lisser les arêtes vives de la reprise avec un papier de sable pour éviter d&#39;endommager le ver ou l&#39;agar. </li></ol> Partie 4: Cueillette des vers <ol><li> Pour ramasser des vers, stériliser le fil de platine sur une flamme et faites glisser la pointe aplatie de la camionnette le long de la pelouse bactérienne pour bien enrober la pointe avec une épaisseur de bactéries collant, en prenant soin de ne pas percer ou d&#39;endommager la surface de la gélose. </li><li> Utilisation de la loupe binoculaire, très légèrement collante brosse à la pointe contre les vers ver / être pris jusqu&#39;à la vis sans fin sur les bâtons à la bactérie sur le pick. </li><li> Une fois que le ver est à la pointe de la pioche, le transférer immédiatement à la nouvelle plaque en touchant ou en faisant glisser la pointe de la reprise de la pelouse contre les bactéries de la plaque de nouveau, et le ver doit ramper hors tension. Des précautions doivent être prises pour ne pas endommager la surface de la gélose sur la plaque reste les vers rampent dans les trous qui rend difficile de les récupérer. Si le ver reste sur le pick pendant trop longtemps, il pourrait dessécher. </li></ol> Partie 5: EMS mutagenèse Méthanesulfonate d&#39;éthyle (EMS) induit un large spectre de mutations dans le génome de la 2. Mutants peuvent être identifiés par des défauts comme la ponte, une anomalie musculaires, la détermination du sexe, de la formation dauer, le comportement et la formation des gonades. Le protocole d&#39;EMS mutagenèse est similaire à celle décrite pour C. elegans 1. <ol><li> Préparer 500 ml (ou plus) de NaOH 1N. </li><li> Prenez 4-5, 6 cm de diamètre boîtes de Pétri pleine de vers, contenant quelques centaines de vers à la troisième juvéniles larvaire (J3) stade et laver les vers off en utilisant 2-3 ml de solution stérile M9 par plaque. </li><li> Ramassez tous les vers dans un stérile, jetable 15 ml tube à centrifuger. Centrifuger à 1500 xg pendant 5-7 minutes ou jusqu&#39;à ce que les vers forment un culot. </li><li> Aspirer le liquide et l&#39;utilisation de 2 ml de M9 à suspendre à nouveau les vers. Ajouter 20 ul EMS dans un tube contenant 2 ml de M9 et secouez-le pour le dissoudre. Puis ajouter cette solution à l&#39;EMS 2ml de suspension ver et remuer doucement. La concentration finale de l&#39;EMS sera de 47 mM. Attention: EMS est un mutagène très fort et doit être manipulé sous une hotte. Tous les matériaux (gants, pipettes, conseils) qui entrent en contact avec cet agent mutagène doivent être traités avec NaOH 1N à l&#39;état inactif du SME. Porter des gants à double lors de la procédure de mutagenèse EMS entier. Éliminer les déchets dangereux, conformément aux directives de votre institution. </li><li> Placez le tube de centrifugeuse et couvrir le bouchon avec du parafilm, le placer horizontalement dans la hotte et de laisser les vers incuber pendant 3,5 heures. Le tube peut aussi être placé sur une bascule basse vitesse. </li><li> Tourner le tube et le bouchon couvercle avec du parafilm et placer en position verticale et incuber jusqu&#39;à ce que le puits de vers. </li><li> Aspirer le surnageant et le jeter dans un bécher / fiole contenant du NaOH 1N. Ce sera inactiver les EMS. </li><li> Ajouter 5 ml M9 aux vers, inverser le tube de 25 à 30 heures pour se laver les vers, centrifuger à 1500 xg pendant 5-7 minutes ou jusqu&#39;à ce que les vers forment un culot. Aspirer le surnageant et jeter dans le bécher de NaOH 1N. </li><li> Répéter l&#39;étape de lavage au moins 3 fois. </li><li> Après le lavage final, remettre en suspension le culot à vis sans fin en quantité minime (~ 500 pi) de M9 et les pipettes sur des plaques à NGM contenant un tapis de bactéries OP50. À ce stade, vous n&#39;avez plus besoin de travailler dans la hotte chimique. </li><li> Laissez le liquide sécher pendant quelques minutes et ensuite choisir et de transfert d&#39;apparence saine J4 larves fraîches plaques ensemencées. Jeter la plaque d&#39;origine, conformément aux directives de votre établissement des déchets dangereux. </li><li> Laissez l&#39;auto mutagénisées vers fertiliser. En utilisant un microscope stéréoscopique, l&#39;écran les phénotypes des mutants génération F2 récessive d&#39;intérêt. </li></ol> Partie 6: psoralène mutagenèse Dans cette section, nous décrivons la procédure de mutagenèse utilisant TMP en conjonction avec grande longueur d&#39;onde ultraviolettes (UV). TMP / UV méthode de mutagenèse est largement utilisé pour induire des mutations dans un génome de suppression 3. <ol><li> Recueillir les vers de 4-5, 6 assiettes cm de Pétri de diamètre dans un tube de 15 ml à centrifuger comme décrit dans la procédure précédente. </li><li> Ajouter 10 ml M9, inverser 20 fois pour laver les vers, et centrifuger à 1500 xg pendant 5 minutes. Jeter le surnageant et répéter le lavage pour un total de 3 fois. Aspirer le liquide et remettre en suspension les vers dans environ 10 fois leur volume d&#39;M9 contenant 30 ug / ml de TMP. Pipeter 20 ul de TMP (3 mg / ml) dans 2 ml de M9. Comme EMS, TMP est un puissant cancérigène et doit être manipulé en prenant les mesures de sécurité appropriées. Afin de prévenir de tout risque potentiel de l&#39;oeil aux UV bonne lumière porte doit être utilisé. Les produits jetables doivent être jetés dans des sacs appropriés Biohazard. </li><li> Incuber le tube dans l&#39;obscurité pendant 15 minutes à température ambiante sur une bascule basse vitesse (40 UPM). Réglez le tube vertical recouvert pendant 10 minutes pour permettre à tous les vers l&#39;évier. </li><li> Retirez les vers du fond du tube avec une pipette Pasteur et de les transférer sur une plaque non ensemencée NGM. Jeter le surnageant suivant les directives de votre établissement chimiques dangereux. </li><li> Conservez la plaque dans l&#39;obscurité jusqu&#39;à ce que la TMP excès est absorbé dans l&#39;assiette. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un mètre de l&#39;intensité des UV, définir la distance entre la source UV à ondes longues et la plaque de telle sorte que l&#39;intensité de la plaque est de 500 uW / cm 2 4. Retirez le couvercle en aluminium et le couvercle et le couvercle et exposer la plaque contenant les vers TMP traitée aux rayons UV à ondes longues de 50 secondes. </li><li> Couvrez et laissez les vers dans l&#39;obscurité pendant 5 heures à température ambiante. </li><li> Pick et le transfert d&#39;apparence saine J4 larves fraîches plaques ensemencées. Jeter la plaque d&#39;origine suivant les directives de votre établissement chimiques dangereux. </li><li> En utilisant un microscope stéréoscopique, l&#39;écran de l&#39;phénotypes génération F2 pour la mutation d&#39;intérêt. </li></ol> Partie 7: Résultats Représentant Certains des P. phénotypes mutants pacificus résultant de la mutagenèse (soit par EMS ou TMP / UV) sont présentés dans la figure 1. Chaque mutant a un phénotype caractéristique qui se distingue facilement de l&#39;animal de type sauvage. Du verqui ont été traités avec le mutagène, 30 J3/J4 larves de la génération parentale (P0) ont été placés dans des assiettes séparées et autorisés à pondre des oeufs, qui sont de la génération F1. Des plaques qui ont montré saine descendance F1, un total de 1000 F1 ont été transférés sur des plaques individuelles et la descendance F2 a été projeté pour les phénotypes. Les animaux atteints Dumpy 5,6, 6 et non coordonnée transformateur 7 phénotypes ont été trouvés. <img src="/files/ftp_upload/2293/2293fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Pristionchus pacificus type sauvage et les animaux mutants. A. B. poids poids hermaphrodites mâles de C. dpy mutant D. unc mutant E. TRA mutant. Haut deux panneaux montrant type sauvage hermaphrodites (à gauche) et mâle (à droite) afin de comparer les animaux avec les différents mutants dans les panneaux restants.

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	<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genetics. 77 (1), 71-71 (1974).</li><li>Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods Cell Biol. 48, 31-31 (1995).</li><li>Yandell, M. D., Edgar, L. G., Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (4), 1381-1381 (1994).</li><li>Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WormBook. , 1-1 (2005).</li><li>Kenning, C., Kipping, I., Sommer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J. Genesis. 40 (3), 176-176 (2004).</li><li>Sommer, R. J., Carta, L. K., Kim, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fundamental and Applied Nematology. 19 (6), 511-511 (1996).</li><li>Pires-daSilva, A., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genes &#38; development. 18 (10), 1198-1198 (2004).</li><li>Wei, A., Yuan, A., Fawcett, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nucleic acids research. 30 (20), 110-110 (2002).</li><li>Jorgensen, E. M., Mango, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nat Rev Genet. 3 (5), 356-356 (2002).</li></ol>

La mutagenèse est une technique largement utilisée pour des études génétiques dans divers organismes modèles expérimentaux. Expériences de mutagenèse sont souvent utilisés pour identifier la fonction d&#39;un gène 2. Les procédures de mutagénèse décrites ici peuvent être utilisées non seulement pour P. pacificus, mais aussi pour C. elegans et d&#39;autres espèces de nématodes connexes. Nous décrivons ici deux méthodes, EMS et TMP / UV mutagenèse. <p class="jove_cont...

an introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis

Ce protocole décrit les procédures pour maintenir les nématodes dans le laboratoire et la façon de les mutagénéiser en utilisant deux méthodes alternatives: méthanesulfonate d&#39;éthyle (EMS) et 4, 5, 8-trimethylpsoralen combinée avec la lumière ultraviolette (TMP / UV). Les nématodes sont de puissants systèmes biologiques pour les études génétiques en raison de leur plan d&#39;organisation simple et le système d&#39;accouplement, qui est composé d&#39;auto-fertilisation hermaphrodites et mâles qui peuvent générer des centaines de descendants par animal. Les nématodes sont maintenus dans des boîtes de gélose contenant un tapis de bactéries et peuvent être facilement transférés d&#39;une plaque à l&#39;autre en utilisant un médiator. EMS est un agent alkylant couramment utilisés pour induire des mutations ponctuelles et de petites délétions, tandis que la TMP / UV induit principalement des suppressions. Selon l&#39;espèce de nématode utilisé, les concentrations de l&#39;EMS et TMP devront être optimisés. Pour isoler des mutations récessives de l&#39;pacificus nématodes Pristionchus, les animaux de la génération F2 étaient visuellement dépistage de phénotypes. Pour illustrer ces méthodes, nous mutagénisées vers et cherché non coordonnés (UNC), plutôt moche (dpy) et transformateur (TRA) des mutants.

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An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis

Le dépistage de mutants avec des défauts phénotypique est une méthode simple pour identifier les gènes qui fonctionnent dans un processus biologique donné. Dans cet article, nous décrivons comment les vers la culture vivante gratuit (par exemple,<em&gt; Pristionchus pacificus</em&gt;) Dans le laboratoire et montrent deux méthodes différentes mutagenèse, EMS et TMP / UV.

Une introduction au laboratoire Worm: La culture de Worms à la mutagenèse

This protocol describes procedures to maintain nematodes in the laboratory and how to mutagenize them using two alternative methods: ethyl methane ...

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Biology

34.2K vues.  University of Texas at Arlington. Le dépistage de mutants avec des défauts phénotypique est une méthode simple pour identifier les gènes qui fonctionnent dans un processus biologique donné. Dans cet article, nous décrivons comment les vers la culture vivante gratuit (par exemple, Pristionchus pacificus) Dans le laboratoire et montrent deux méthodes différentes mutagenèse, EMS et TMP / UV.

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Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned target gene can be altered by substitution, deletion or insertion of a few bases directly into a plasmid. It works by simply amplifying the whole plasmid, in a non PCR-based thermocycling reaction. During the reaction mutagenic primers, carrying the desired mutation, are integrated into the newly synthesized plasmid. In this video tutorial we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid. The protocol works with standard reagents and is independent from commercial kits, which often are very expensive. Applying this protocol can reduce the total cost of a reaction to an eighth of what it costs using some of the commercial kits. In this video we also comment on critical steps during the process and give detailed instructions on how to design the mutagenic primers.

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. Here we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid using standard reagents.

Mutagenèse dirigée maison des plasmides entiers

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

Recherche

Biologie

Single Oocyte Bisulfite Mutagenesis

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for regulating gene transcription1. DNA methylation is an epigenetic modification that acts predominantly as a repressive mark. Through the covalent addition of a methyl group onto cytosines in CpG dinucleotides, it can recruit additional repressive proteins and histone modifications to initiate processes involved in condensing chromatin and silencing genes2. DNA methylation is essential for normal development as it plays a critical role in developmental programming, cell differentiation, repression of retroviral elements, X-chromosome inactivation and genomic imprinting.
One of the most powerful methods for DNA methylation analysis is bisulfite mutagenesis. Sodium bisulfite is a DNA mutagen that deaminates cytosines into uracils. Following PCR amplification and sequencing, these conversion events are detected as thymines. Methylated cytosines are protected from deamination and thus remain as cytosines, enabling identification of DNA methylation at the individual nucleotide level3. Development of the bisulfite mutagenesis assay has advanced from those originally reported4-6 towards ones that are more sensitive and reproducible7. One key advancement was embedding smaller amounts of DNA in an agarose bead, thereby protecting DNA from the harsh bisulfite treatment8. This enabled methylation analysis to be performed on pools of oocytes and blastocyst-stage embryos9. The most sophisticated bisulfite mutagenesis protocol to date is for individual blastocyst-stage embryos10. However, since blastocysts have on average 64 cells (containing 120-720 pg of genomic DNA), this method is not efficacious for methylation studies on individual oocytes or cleavage-stage embryos.
Taking clues from agarose embedding of minute DNA amounts including oocytes11, here we present a method whereby oocytes are directly embedded in an agarose and lysis solution bead immediately following retrieval and removal of the zona pellucida from the oocyte. This enables us to bypass the two main challenges of single oocyte bisulfite mutagenesis: protecting a minute amount of DNA from degradation, and subsequent loss during the numerous protocol steps. Importantly, as data are obtained from single oocytes, the issue of PCR bias within pools is eliminated. Furthermore, inadvertent cumulus cell contamination is detectable by this method since any sample with more than one methylation pattern may be excluded from analysis12. This protocol provides an improved method for successful and reproducible analyses of DNA methylation at the single-cell level and is ideally suited for individual oocytes as well as cleavage-stage embryos.

Bisulfite mutagenesis is the gold standard for analyzing DNA methylation. Our modified protocol allows for DNA methylation analysis at the single-cell level and was specifically designed for individual oocytes. It can also be used for cleavage-stage embryos.

Simple mutagenèse bisulfite d&#39;ovocytes

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for ...

Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated sensor chip and a phosphatidylcholine monolayer on top. This assembly is mounted into a cuvette system containing the reference electrode, a chlorinated silver wire.
After adsorption of membrane fragments or proteoliposomes containing the membrane protein of interest, a fast solution exchange is used to induce the transport activity of the membrane protein. In the single solution exchange protocol two solutions, one non-activating and one activating solution, are needed. The flow is controlled by pressurized air and a valve and tubing system within a faraday cage.
The kinetics of the electrogenic transport activity is obtained via capacitive coupling between the SSM and the proteoliposomes or membrane fragments. The method, therefore, yields only transient currents. The peak current represents the stationary transport activity. The time dependent transporter currents can be reconstructed by circuit analysis.
This method is especially suited for prokaryotic transporters or eukaryotic transporters from intracellular membranes, which cannot be investigated by patch clamp or voltage clamp methods.

Here we present an electrophysiological method based on solid supported membranes with focus on its applications for the characterization of electrogenic membrane transporters.

Introduction à la membrane solide étayée par électrophysiologie

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated ...

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors are offering new opportunities for regenerative medicine. Such clinical applications of iPS cells have been limited so far, mainly due to the poor efficiency of the existing reprogramming methodologies and the risk of the generated iPS cells to form tumors upon implantation.
We hypothesized that the reprogramming of somatic cells towards pluripotency could be achieved in vivo by gene transfer of reprogramming factors. In order to efficiently reprogram cells in vivo, high levels of the Yamanaka (OKSM) transcription factors need to be expressed at the target tissue. This can be achieved by using different viral or nonviral gene vectors depending on the target tissue. In this particular study, hydrodynamic tail-vein (HTV) injection of plasmid DNA was used to deliver the OKSM factors to mouse hepatocytes. This provided proof-of-evidence of in vivo reprogramming of adult, somatic cells towards a pluripotent state with high efficiency and fast kinetics. Furthermore no tumor or teratoma formation was observed in situ.
It can be concluded that reprogramming somatic cells in vivo may offer a potential approach to induce enhanced pluripotency rapidly, efficiently, and safely compared to in vitro performed protocols and can be applied to different tissue types in the future.

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

This study demonstrates the reprogramming of somatic cells towards pluripotency in vivo without the generation of teratomas. We used hydrodynamic tail vein injection of plasmid DNA encoding the Yamanka factors to induce the in vivo reprogramming of adult hepatocytes into cells of enhanced pluripotency.

Dans reprogrammation in vivo de cellules somatiques adultes à la pluripotence par surexpression de facteurs Yamanaka

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors ...

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to assemble. Therefore, to identify these functional protein complexes, it is important to stabilize them in vivo before cell lysis and subsequent purification. Here we describe a method used to isolate large bona fide protein complexes from Drosophila embryos. This method is based on embryo permeabilization and stabilization of the complexes inside the embryos by in vivo crosslinking using a low concentration of formaldehyde, which can easily cross the cell membrane. Subsequently, the protein complex of interest is immunopurified followed by gel purification and analyzed by mass spectrometry. We illustrate this method using purification of a Tudor protein complex, which is essential for germline development. Tudor is a large protein, which contains multiple Tudor domains - small modules that interact with methylated arginines or lysines of target proteins. This method can be adapted for isolation of native protein complexes from different organisms and tissues.

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Multi-component protein complexes play crucial roles during cellular function and development. Here we describe a method used to isolate native protein complexes from Drosophila embryos after in vivo crosslinking followed by purification of the crosslinked complexes for subsequent structure-function analysis.

Un In vivo Approche de réticulation pour isoler les complexes protéiques De Drosophila Embryons

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media (mCeHR). Additionally, the steps for exposing and acclimatizing C. elegans grown on E. coli to axenic liquid media are described. Finally, downstream experiments that utilize axenic C. elegans illustrate the benefits of this procedure. The ability to analyze and determine C. elegans&#160;nutrient requirement was illustrated by growing N2 wild type worms in axenic liquid media with varying heme concentrations. This procedure can be replicated with other nutrients to determine the optimal concentration for worm growth and development or, to determine the toxicological effects of drug treatments. The effects of varied heme concentrations on the growth of wild type worms were determined through qualitative microscopic observation and by quantitating the number of worms that grew in each heme concentration. In addition, the effect of varied nutrient concentrations can be assayed by utilizing worms that express fluorescent sensors that respond to changes in the nutrient of interest. Furthermore, a large number of worms were easily produced for the generation of transgenic C. elegans using microparticle bombardment.

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

C. elegans is usually grown on solid agar plates or in liquid cultures seeded with E. coli. To prevent bacterial byproducts from confounding toxicological and nutritional studies, we utilized an axenic liquid medium, CeHR, to grow and synchronize a large number of worms for a range of downstream applications.

Culture<em&gt; Caenorhabditis elegans</em &gt; En Axenic Liquid Media et création d&#39;transgéniques Worms par bombardement de microparticules

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media ...

Using Mouse Mammary Tumor Cells to Teach Core Biology Concepts: A Simple Lab Module

Undergraduate biology students are required to learn, understand and apply a variety of cellular and molecular biology concepts and techniques in preparation for biomedical, graduate and professional programs or careers in science. To address this, a simple laboratory module was devised to teach the concepts of cell division, cellular communication and cancer through the application of animal cell culture techniques. Here the mouse mammary tumor (MMT) cell line is used to model for breast cancer. Students learn to grow and characterize these animal cells in culture and test the effects of traditional and non-traditional chemotherapy agents on cell proliferation. Specifically, students determine the optimal cell concentration for plating and growing cells, learn how to prepare and dilute drug solutions, identify the best dosage and treatment time course of the antiproliferative agents, and ascertain the rate of cell death in response to various treatments. The module employs both a standard cell counting technique using a hemocytometer and a novel cell counting method using microscopy software. The experimental procedure lends to open-ended inquiry as students can modify critical steps of the protocol, including testing homeopathic agents and over-the-counter drugs. In short, this lab module requires students to use the scientific process to apply their knowledge of the cell cycle, cellular signaling pathways, cancer and modes of treatment, all while developing an array of laboratory skills including cell culture and analysis of experimental data not routinely taught in the undergraduate classroom.

A feasible laboratory module for biology undergraduates that explores advanced cellular and molecular concepts using animal cell culture is described. Students grow, characterize and manipulate a breast cancer cell model by exposure to chemotherapy agents. Cell viability is assayed through cell counting using both a standard and novel method.

Utilisation de la souris des cellules tumorales mammaires pour enseigner Biologie Concepts de base: un module de laboratoire simple

Undergraduate biology students are required to learn, understand and apply a variety of cellular and molecular biology concepts and techniques in ...

Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab

Understanding how enzymes work, and relating this to real life examples, is critical to a wide range of undergraduate degrees in the biological and biomedical sciences. This easy to follow protocol was developed for first year undergraduate pharmacy students and provides an entry-level introduction to enzyme reactions and analytical procedures for enzyme analysis. The enzyme of choice is lactase, as this represents an example of a commercially available enzyme relevant to human disease/pharmaceutical practice. Lactase is extracted from dietary supplement tablets, and assessed using a colorimetric assay based upon hydrolysis of an artificial substrate for lactase (ortho-nitrophenol-beta-D-galactopyranoside, ONPG). Release of ortho-nitrophenol following the hydrolytic cleavage of ONPG by lactase is measured by a change in absorbance at 420 nm, and the effect of the temperature on the enzymatic reaction is evaluated by carrying out the reaction on ice, at room temperature and at 37 &#176;C. More advanced analysis can be implemented using this protocol by assessing the enzyme activity under different conditions and using different reagents.

The enzymatic activity of lactase is essential for the catabolic processing of the disaccharide lactose. Here, the activity of lactase found in dietary supplements is assayed using a colorimetric assay. This provides students with an experimental platform for understanding the activity of lactase and enzyme kinetics.

Mesure de l’activité enzymatique Lactase dans le laboratoire d’enseignement

Understanding how enzymes work, and relating this to real life examples, is critical to a wide range of undergraduate degrees in the biological and ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for cartilage tissue engineering. MSCs from synovial fluid (SF-MSCs) have been considered promising candidates for articular regeneration, and their potential therapeutic benefit has made them an important research topic of late. SF-MSCs from the knee cavity of the New Zealand white rabbit can be employed as an optimized translational model to assess human regenerative medicine. By means of CD90-based magnetic activated cell sorting (MACS) technologies, this protocol successfully obtains rabbit SF-MSCs (rbSF-MSCs) from this rabbit model and further fully demonstrates the MSC phenotype of these cells by inducing them to differentiate to osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes. Therefore, this approach can be applied in cell biology research and tissue engineering using simple equipment and procedures.

This article presents a simple and economic protocol for the straightforward isolation and purification of mesenchymal stem cells from New Zealand white rabbit synovial fluid.

Cellule magnétique activé tri des stratégies visant à isoler et purifier Synovial fluide mésenchymateuses cellules souches dérivées d’un modèle de lapin

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and calcium handling. For this purpose, atrial or ventricular cardiomyocytes of high quality are necessary to perform patch-clamp measurements or to explore calcium handling abnormalities. However, the limited yield of high-quality cardiomyocytes obtained by current isolation protocols does not allow both measurements in the same mouse. This article describes a method to isolate high-quality murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, for subsequent simultaneous measurements of calcium transients and L-type calcium current from one animal. Mouse hearts are obtained, and the aorta is rapidly cannulated to remove blood. Hearts are then initially perfused with a calcium-free solution (37 &#176;C) to dissociate the tissue at the level of intercalated discs and afterwards with an enzyme solution containing little calcium to disrupt extracellular matrix (37 &#176;C). The digested heart is subsequently dissected into atria and ventricles. Tissue samples are chopped into small pieces and dissolved by carefully pipetting up and down. The enzymatic digestion is stopped, and cells are stepwise reintroduced to physiologic calcium concentrations. After loading with a fluorescent Ca2+-indicator, isolated cardiomyocytes are prepared for simultaneous measurement of calcium currents and transients. Additionally, isolation pitfalls are discussed and patch-clamp protocols and representative traces of L-type calcium currents with simultaneous calcium transient measurements in atrial and ventricular murine myocytes isolated as described above are provided.

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis. For this purpose, high quality cardiomyocytes are necessary to perform patch-clamp measurements. Here, a method to isolate murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, which allows simultaneous measurements of calcium-transients and L-type calcium current, is described.

Isolement de myocytes auriculaires et ventriculaires murins de haute qualité pour des mesures simultanées des transitoires Ca2+ et du courant calcique de type L

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...