Nous tenons à remercier nos sources de financement: Le California Institute for Regenerative Medicine Clinical Fellow Formation Grant (AN), la National Science Foundation (MW), Irène Perstein Award (MTC), l&#39;American College of Surgeons (MTC), l&#39;American Pediatric Association chirurgical ( MTC), et le Mars of Dimes (MTC).

1. Préparation des pipettes d&#39;injection <ol><li> Calibrer l&#39;extracteur pipette tels que la séparation de la pipette en verre se produit dans les 15 secondes (voir les instructions du fabricant concernant l&#39;étalonnage). La pipette aura un cône où il se sépare. </li><li> Coupez l&#39;extrémité de la pipette de telle sorte que la distance entre le début du cône à l&#39;extrémité de la pipette est 1.04cm à 1.05cm. La longueur de la pipette est inversement proportionnel au calibre de l&#39;orifice de la pipette. Soyez conscient que faire un plus long pipette entraîne aussi un affaiblissement astuce qui est plus sensible à la casse lors de l&#39;injection. </li><li> La prochaine étape dans la prise de la pipette est de créer un biseau en douceur en aiguisant la pointe de diamant sur une roue d&#39;affûtage. Au moment de la coupe de la pipette à la taille appropriée, la pipette casse souvent avec un biseau naturelle à son extrémité qui doit être utilisé lorsque vous placez la pipette sur la roue. Pendant ce processus, il est important de douceur reste de la pipette sur la roue d&#39;affûtage et de réévaluer périodiquement pour s&#39;assurer que la pipette est encore en contact avec la roue (comme le biseau devient plus lisse, il perdra le contact avec la roue d&#39;affûtage). </li><li> Une fois que le biseau est lisse, la pointe de la pipette doit être aiguisé (Figure 1). Surélever la pipette de telle sorte qu&#39;il ne touche plus la roue d&#39;affûtage, tournez dans le sens horaire par 10-50 degrés, et le lieu du dos pipette sur la roue tournante d&#39;affûtage pour ~ 10 secondes. Retirer la pipette de la roue d&#39;affûtage et maintenant examiner le bord. Cette étape doit habituellement être répété avec plusieurs petits ajustements afin de créer un bord tranchant. Si la pipette est placée sur son bord pendant trop longtemps, il est plus susceptible de développer une surface inégale (figure 1). Après avoir complété un côté, vous pouvez procéder à aiguiser le bord opposé en répétant les étapes ci-dessus. </li><li> Utilisez un marqueur indélébile pour dessiner une ligne circonférentielle tous les 4mm de départ où le cône de la pipette commence. Ces démarcations correspondent à 5uL de volume. </li></ol> 2. Transplantation in utero <ol><li> Après avoir préparé le matériel injectable (par exemple des cellules, virus, etc), vous pouvez mettre en place pour l&#39;injection. Nous utilisons un microinjecteur connecté à air comprimé avec les paramètres suivants: (réglages de pression: entrée 60-80 psi, remplir 40 psi, injecter 8-12 psi, de l&#39;équilibre 0 psi, maintenez 0 psi, le temps d&#39;injection de 100 millisecondes). </li><li> Pour stériliser la pipette d&#39;injection, nettoyez-le à deux reprises avec EtOH à 70%, suivi par deux fois avec du PBS 1X stériles. Comme l&#39;extrémité de la pipette est très fragile, nous ne recommandons pas l&#39;autoclavage des pipettes d&#39;injection. </li><li> Les injections peuvent être fait soit en utilisant des loupes de grossissement 2.5X-3.5x ou un microscope à dissection. Préparez votre région procédure avec une couverture chauffante, l&#39;éclairage et les instruments chirurgicaux nécessaires. </li><li> Anesthésier les souris enceintes (nous utilisons l&#39;isoflurane et oxygène délivré via une unité d&#39;anesthésie à débit continu). Placez la souris sur un coussin chauffant en position couchée et apposer chaque membre avec du ruban adhésif pour sécuriser la souris en place. </li><li> Clip de la fourrure. Ensuite, le port de gants chirurgicaux stériles, la préparation de l&#39;abdomen avec 10% de povidone-iode suivie par l&#39;alcool, et à injecter une telle analgésiques comme la buprénorphine. </li><li> Faire une incision de 1 cm dans le bas ventre (l&#39;aspect le plus inférieur de l&#39;incision doit être d&#39;environ 1 cm supérieur à l&#39;orifice vaginal). Inciser la peau et le fascia. Soyez prudent de ne pas blesser les organes abdominaux (intestins et la vessie), qui sont immédiatement sous la mince couche de fascia. </li><li> En utilisant des tampons de coton, étirer doucement le fascia et de livrer l&#39;utérus gravide à travers l&#39;incision. Compter le nombre total de fœtus en identifiant d&#39;abord les ovaires droit et gauche pour vous assurer que vous visualisez tout l&#39;utérus. Placez l&#39;utérus de retour dans la cavité abdominale avant de procéder pour que le fœtus restent au chaud pendant que vous préparez pour les injections. </li><li> Prélever le volume approprié de matériel pour le nombre de fœtus que vous prévoyez d&#39;injecter. Lors du remplissage de l&#39;aiguille avec votre échantillon, il est important de garder à l&#39;extrémité de la pipette pour éviter l&#39;aspiration submergée votre échantillon dans le tube microinjecteur. Comme les cellules sont généralement dans un petit volume, nous avons l&#39;habitude de les placer dans une micro-petits (ex: 0,5 mL) tube ou directement sur un morceau de parafilm pour être en mesure de combler l&#39;aiguille sans casser la pointe de la pipette. </li><li> Maintenez chaque fœtus et d&#39;identifier la partie du fœtus que vous prévoyez d&#39;injecter (par exemple le foie, la cavité péritonéale, une jambe, etc.) Avec votre pouce et votre index, vous devez stabiliser le foetus dans la cavité amniotique afin qu&#39;elle ne tourne pas pendant que vous effectuez l&#39;injection. Il est important de tenir le fœtus assez fermement pour le stabiliser, mais en douceur suffisant pour éviter de l&#39;endommager. </li><li> Insérez soigneusement la pipette dans l&#39;utérus, l&#39;amnios et la peau du fœtus, et dans l&#39;organe cible. Si la pipette est forte, elle devrait passer facilement à travers ces tissus. Si la pointe de la pipette est terne, vous wi<html> LL tentes avis de l&#39;utérus et les membranes amniotiques. Injecter le volume désiré dans chaque fœtus. Il est impératif que vos mouvements soient stables pendant le temps de l&#39;insertion, l&#39;injection et le retrait de la pipette. </li><li> Une fois le volume désiré est injecté, retirer la pipette soigneusement. Si c&#39;est fait correctement, le matériel ne doit pas s&#39;échapper de la cavité amniotique ou de l&#39;utérus. Si un grand trou est créée dans l&#39;amnios, dont on peut reconnaître par une fuite de liquide amniotique, puis la survie est compromise. Enfin, pour les études qui impliquent la récolte postnatale, tous les fœtus doivent recevoir des injections techniquement parfait car il n&#39;y a aucun moyen de discerner les fœtus et les non-injecté injecté après la naissance. </li><li> Si vous effectuez les injections dans le foie fœtal, vous pouvez parfois voir du sang dans l&#39;embout de la pipette est retirée après qu&#39;elle-ce qui confirme que vous êtes dans la position correcte et ne devrait pas affecter la survie. Si vous effectuez des injections intra-péritonéales, le but légèrement en dessous du foie fœtal. Pour les injections intramusculaires, vous pouvez la position du fœtus à identifier la hanche et du fémur et d&#39;injecter le muscle fessier. Enfin, pour les injections intra-ventriculaire, il est facile de voir les points de suture coronale pour diriger la pipette à la cible appropriée. Pour ces injections, des pipettes de calibre légèrement plus grandes sont nécessaires pour pénétrer le crâne sans casser la pipette. </li><li> Ensuite, placer soigneusement l&#39;utérus dans la cavité abdominale. Assurez-vous qu&#39;il n&#39;est pas tordu sur lui-même ou autour de son apport vasculaire. Livrer 1ml de solution stérile PBS 1X dans la cavité péritonéale de la mère pour remplacer le liquide qui a été perdu lors de la procédure. Fermer l&#39;incision en 2 couches avec une suture tressée 5-0 résorbables (ex: Vicryl). Fermez d&#39;abord le fascia sans blesser l&#39;intestin ou la vessie sous-jacente, puis fermez la peau. </li><li> A cette époque, post-opératoire des médicaments peuvent être administrés pour l&#39;analgésie. Retour chaque femelle injecte à sa cage individuelle propre et placer la cage sur une couverture chauffante. Surveiller la souris jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit en position verticale. Mettez la literie dans la cage et le lieu de la souris dans une zone calme de l&#39;installation de la souris où il ne devrait pas être dérangé (ie pas de nettoyage des cages) jusqu&#39;à plusieurs jours après l&#39;accouchement. Minimiser tout stress supplémentaire pour l&#39;animal va diminuer les chances d&#39;accouchement prématuré. </li><li> Lorsque vous avez terminé les injections, nettoyer votre pipette stérile, à deux reprises avec du PBS 1X et une fois avec EtOH 70%. </li><li> Femelles injectées doivent être observés quotidiennement afin de s&#39;assurer qu&#39;ils se remettent de la procédure sans difficulté. L&#39;incision doit être surveillée de gonflement, une inflammation des signes, la séparation des plaies, et d&#39;autres de l&#39;infection. Post-opératoire des analgésiques peuvent être administrés au besoin. </li></ol> 3. Les résultats représentatifs: La survie du fœtus injectés à la livraison terme est le principal facteur limitant pour atteindre le succès avec cette technique. Selon le matériau injecté et la souche de souris utilisée, les taux de survie peut varier. En général, les injections de cellules hématopoïétiques dans souris de type sauvage au E14 devrait se traduire par au moins 50% nés vivants chiots. Des taux plus élevés de survie sont possibles en fonction à la fois les aspects techniques de l&#39;injection ainsi que les caractéristiques de la souris étant injecté. Minimiser le traumatisme pour les membranes amniotiques utérus et est l&#39;aspect technique le plus important de ce protocole. Sharp, pipettes de petit calibre se traduira par un traumatisme minime utérine pendant l&#39;injection. Nous ne recommandons pas l&#39;utilisation d&#39;aiguilles d&#39;injection standard que le calibre des pré-fabriqués aiguilles est trop grand et donnerait lieu à un grand trou dans l&#39;utérus. Fait à la main pipettes d&#39;injection de verre sont les aiguilles de petit calibre ne peuvent être utilisées pour des injections intra-utérine. Complète et méticuleuse technique chirurgicale, y compris la manipulation douce de l&#39;utérus et une courte anesthésie est également cruciale pour des résultats optimaux. Caractéristiques spécifiques de la souris receveuses tels que le fond génétique, l&#39;âge gestationnel, et la taille des portées peut également affecter la survie. Certaines souches de souris sont plus sensibles à la perte de travail prématuré et la grossesse en fonction de leur bagage génétique. 15 animaux transgéniques avec des défauts musculaires ou neurodégénératives peuvent avoir une capacité réduite pour livrer des fœtus par voie vaginale après avoir subi une laparotomie médiane. Ces huit femelles gravides peut exiger la livraison par césarienne. Nous avons également constaté que l&#39;âge gestationnel au moment de l&#39;injection peut avoir un impact viabilité. Les fœtus qui sont plus jeunes que 12 jours embryonnaires ont des taux inférieurs de survie que les plus âgés fœtus. Enfin, nous avons constaté que la taille des portées importantes (&gt; 10 fœtus) ont tendance à avoir des taux élevés de mort fœtale après l&#39;injection. Attention à la fois les aspects techniques de cette technique et les caractéristiques spécifiques de la souris étant injecté peut maximiser la survie des foetus injectées. ve_content &quot;&gt; Quand ces méthodes sont exécutées correctement, on peut s&#39;attendre à ce que tous les foetus sont exposés à la matière injectée. Similaire à la mise en postnatale, cependant, la prestation réussie de cellules ou de virus in utero n&#39;a pas toujours lieu à des greffes de cellules ou un gène donateurs d&#39;expression, respectivement. La prise de greffe de cellules souches, par exemple, dépend de plusieurs facteurs tels que la dose et la source des cellules transplantées. De même, le succès de la transduction virale est, en partie, déterminé par le type de vecteur viral utilisé. Il faut comprendre les nombreux facteurs que la survie de l&#39;impact chiot, greffe cellulaire, et la transduction virale pour atteindre le succès avec ce protocole. <img src="/files/ftp_upload/2303/2303fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Diagramme montrant bon affûtage des pipettes d&#39;injection (étape 1.4)

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	<li>Flake, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+X-linked+severe+combined+immunodeficiency+by+in+utero+transplantation+of+paternal+bone+marrow.">Treatment of X-linked severe combined immunodeficiency by in utero transplantation of paternal bone marrow.</a> N Engl J Med. 335, 1806-1810 (1996).</li><li>Wengler, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-utero+transplantation+of+parental+CD34+haematopoietic+progenitor+cells+in+a+patient+with+X-linked+severe+combined+immunodeficiency+(SCIDXI).">In-utero transplantation of parental CD34 haematopoietic progenitor cells in a patient with X-linked severe combined immunodeficiency (SCIDXI).</a> Lancet. 348, 1484-1487 (1996).</li><li>Flake, A. W., Zanjani, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+utero+hematopoietic+stem+cell+transplantation:+ontogenic+opportunities+and+biologic+barriers.">in utero hematopoietic stem cell transplantation: ontogenic opportunities and biologic barriers.</a> Blood. 94, 2179-2191 (1999).</li><li>Merianos, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+alloantibodies+induce+a+postnatal+immune+response+that+limits+engraftment+following+in+utero+hematopoietic+cell+transplantation+in+mice.">Maternal alloantibodies induce a postnatal immune response that limits engraftment following in utero hematopoietic cell transplantation in mice.</a> J Clin Invest. 119, 2590-2600 (2009).</li><li>Peranteau, W. H., Endo, M., Adibe, O. O., Flake, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+an+immune+barrier+after+in+utero+hematopoietic-cell+transplantation.">Evidence for an immune barrier after in utero hematopoietic-cell transplantation.</a> Blood. 109, 1331-1333 (2007).</li><li>Kim, H. B., Shaaban, A. F., Yang, E. Y., Liechty, K. W., Flake, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microchimerism+and+tolerance+after+in+utero+bone+marrow+transplantation+in+mice.">Microchimerism and tolerance after in utero bone marrow transplantation in mice.</a> J Surg Res. 77, 1-5 (1998).</li><li>Durkin, E. T., Jones, K. A., Rajesh, D., Shaaban, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+chimerism+threshold+predicts+sustained+engraftment+and+NK-cell+tolerance+in+prenatal+allogeneic+chimeras.">Early chimerism threshold predicts sustained engraftment and NK-cell tolerance in prenatal allogeneic chimeras.</a> Blood. 112, 5245-5253 (2008).</li><li>Mackenzie, T. C., Shaaban, A. F., Radu, A., Flake, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engraftment+of+bone+marrow+and+fetal+liver+cells+after+in+utero+transplantation+in+MDX+mice.">Engraftment of bone marrow and fetal liver cells after in utero transplantation in MDX mice.</a> J Pediatr Surg. 37, 1058-1064 (2002).</li><li>Hayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixed+chimerism+following+in+utero+hematopoietic+stem+cell+transplantation+in+murine+models+of+hemoglobinopathy.">Mixed chimerism following in utero hematopoietic stem cell transplantation in murine models of hemoglobinopathy.</a> Exp Hematol. 31, 176-184 (2003).</li><li>Bouchard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+transgene+expression+in+cardiac+and+skeletal+muscle+following+fetal+administration+of+adenoviral+or+adeno-associated+viral+vectors+in+mice.">Long-term transgene expression in cardiac and skeletal muscle following fetal administration of adenoviral or adeno-associated viral vectors in mice.</a> J Gene Med. 5, 941-950 (2003).</li><li>Meza, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+pyruvate+kinase+deficiency+in+mice+by+gene+therapy+using+the+human+isoenzyme.">Rescue of pyruvate kinase deficiency in mice by gene therapy using the human isoenzyme.</a> Mol Ther. 17, 2000-2009 (2009).</li><li>MacKenzie, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transduction+of+liver+and+muscle+after+in+utero+injection+of+lentiviral+vectors+with+different+pseudotypes.">Efficient transduction of liver and muscle after in utero injection of lentiviral vectors with different pseudotypes.</a> Mol Ther. 6, 349-358 (2002).</li><li>MacKenzie, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transduction+of+satellite+cells+after+prenatal+intramuscular+administration+of+lentiviral+vectors.">Transduction of satellite cells after prenatal intramuscular administration of lentiviral vectors.</a> J Gene Med. 7, 50-58 (2005).</li><li>Sabatino, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+expression+of+hF.IX+After+tolerance+induction+by+in+utero+or+neonatal+administration+of+AAV-1-F.IX+in+hemophilia+B+mice.">Persistent expression of hF.IX After tolerance induction by in utero or neonatal administration of AAV-1-F.IX in hemophilia B mice.</a> Mol Ther. 15, 1677-1685 (2007).</li><li>Mellor, A. L., Munn, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunology+at+the+maternal-fetal+interface:+lessons+for+T+cell+tolerance+and+suppression.">Immunology at the maternal-fetal interface: lessons for T cell tolerance and suppression.</a> Annu Rev Immunol. 18, 367-391 (2000).</li><li>Billingham, R. E., Brent, L., Medawar, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actively+acquired+tolerance+of+foreign+cells.">Actively acquired tolerance of foreign cells.</a> Nature. 172, 603-606 (1953).</li><li>Endo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+to+ocular+stem+cells+by+early+gestational+intraamniotic+injection+of+lentiviral+vector.">Gene transfer to ocular stem cells by early gestational intraamniotic injection of lentiviral vector.</a> Mol Ther. 15, 579-587 (2007).</li><li>Waddington, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+transgene+expression+by+administration+of+a+lentivirus-based+vector+to+the+fetal+circulation+of+immuno-competent+mice.">Long-term transgene expression by administration of a lentivirus-based vector to the fetal circulation of immuno-competent mice.</a> Gene Ther. 10, 1234-1240 (2003).</li><li>Schachtner, S., Buck, C., Bergelson, J., Baldwin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+regulated+expression+patterns+following+in+utero+adenovirus-mediated+gene+transfer.">Temporally regulated expression patterns following in utero adenovirus-mediated gene transfer.</a> Gene Ther. 6, 1249-1257 (1999).</li></ol>

Plus il ya 50 ans, Billingham, Brent et Medawar utilisé dans la transplantation in utero chez la souris pour induire une tolérance immunitaire aux protéines étrangères. 16 Depuis ce temps, plusieurs variantes de cette technique ont été utilisés pour répondre aux questions en immunologie et en biologie des cellules souches. Le protocole détaillé ici est l&#39;une des méthodes les plus accessibles pour les IUT. Le foie fœtal offre une cible facile à v...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Pipettes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kimble</td>
<td>71900-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pipette puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments Company</td>
<td>Model P-30</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microinjector</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige</td>
<td>IM-300</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pipette sharpener</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments Company</td>
<td>Model BV-10</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

a mouse model of in utero transplantation

La transplantation de cellules souches et les virus in utero a un énorme potentiel pour le traitement des affections congénitales chez le fœtus humain. Par exemple, la transplantation in utero (IUT) de cellules souches hématopoïétiques a été utilisé avec succès pour traiter les patients souffrant d&#39;immunodéficience 1,2. Combinés dans plusieurs autres conditions, cependant, l&#39;IUT a été tentée sans succès. 3 Compte tenu de ces résultats mitigés, la disponibilité d&#39;une efficacité non-humain modèle pour étudier les séquelles biologiques de la transplantation de cellules souches et la thérapie génique est essentielle pour faire progresser ce domaine. Nous et d&#39;autres ont utilisé le modèle murin de l&#39;IUT d&#39;étudier les facteurs affectant la prise de greffe réussie d&#39;in utero transplanté des cellules souches hématopoïétiques dans les deux souris de type sauvage 4-7 et ceux avec les maladies génétiques. 8,9 L&#39;environnement fœtal offre également des avantages considérables pour la succès de la thérapie génique in utero. Par exemple, la livraison de 10 adénoviraux, adéno-associés virale 10, 11 rétroviraux et les vecteurs lentiviraux 12,13 dans le foetus a abouti à la transduction de multiples organes à distance du site d&#39;injection avec l&#39;expression des gènes à long terme. In utero la thérapie génique peut donc être considérée comme une stratégie de traitement possible pour des maladies monogéniques comme la dystrophie musculaire ou la fibrose kystique. Un autre avantage potentiel de l&#39;IUT est la capacité à induire une tolérance immunitaire à un antigène spécifique. Comme on le voit chez des souris atteintes d&#39;hémophilie, l&#39;introduction du facteur IX au début de résultats de développement dans la tolérance à cette protéine. 14 En plus de son utilisation dans les enquêtes sur d&#39;éventuelles thérapies humaines, le modèle murin de l&#39;IUT peut être un outil puissant pour étudier des questions fondamentales en biologie cellulaire du développement et de la tige. Par exemple, on peut offrir diverses petites molécules d&#39;induire ou d&#39;inhiber l&#39;expression génique spécifique à définir les étapes de gestation et de manipuler les voies de développement. L&#39;impact de ces modifications peut être évalué à différents points de temps après la transplantation initiale. Par ailleurs, on peut transplanter pluripotentes ou de la lignée des cellules progénitrices spécifiques dans l&#39;environnement du fœtus à l&#39;étude différenciation des cellules souches dans un milieu d&#39;accueil non irradiés et imperturbable. Le modèle de souris de l&#39;IUT a déjà fourni des indications nombreuses dans les domaines de l&#39;immunologie et la biologie cellulaire du développement et de la tige. Dans ce protocole basé sur la vidéo, nous décrivons une approche étape par étape pour effectuer IUT de fœtus de souris et un aperçu des étapes critiques et les pièges potentiels de cette technique.

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A Mouse Model of in Utero Transplantation

Le modèle murin de<em&gt; In utero</em&gt; La transplantation est un outil polyvalent qui peut être utilisée pour étudier les applications cliniques potentielles de la transplantation de cellules souches et la thérapie génique chez le fœtus. Dans ce protocole, nous présentons une approche générale de l&#39;exécution de cette technique de

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Transplantation of Pulmonary Valve Using a Mouse Model of Heterotopic Heart Transplantation

Tissue engineered heart valves, especially decellularized valves, are starting to gain momentum in clinical use of reconstructive surgery with mixed results. However, the cellular and molecular mechanisms of the neotissue development, valve thickening, and stenosis development are not researched extensively. To answer the above questions, we developed a murine heterotopic heart valve transplantation model. A heart valve was harvested from a valve donor mouse and transplanted to a heart donor mouse. The heart with a new valve was transplanted heterotopically to a recipient mouse. The transplanted heart showed its own heartbeat, independent of the recipient&#8217;s heartbeat. The blood flow was quantified using a high frequency ultrasound system with a pulsed wave Doppler. The flow through the implanted pulmonary valve showed forward flow with minimal regurgitation and the peak flow was close to 100 mm/sec. This murine model of heart valve transplantation is highly versatile, so it can be modified and adapted to provide different hemodynamic environments and/or can be used with various transgenic mice to study neotissue development in a tissue engineered heart valve.

In order to understand the cellular and molecular mechanisms underlying neotissue formation and stenosis development in tissue engineered heart valves, a murine model of heterotopic heart valve transplantation was developed. A pulmonary heart valve was transplanted to recipient using the heterotopic heart transplantation technique.

Transplantation de valve pulmonaire en utilisant un modèle de souris de transplantation cardiaque hétérotopique

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Médecine

Murine Corneal Transplantation: A Model to Study the Most Common Form of Solid Organ Transplantation

Corneal transplantation is the most common form of organ transplantation in the United States with between 45,000 and 55,000 procedures performed each year. While several animal models exist for this procedure and mice are the species that is most commonly used. The reasons for using mice are the relative cost of using this species, the existence of many genetically defined strains that allow for the study of immune responses, and the existence of an extensive array of reagents that can be used to further define responses in this species. This model has been used to define factors in the cornea that are responsible for the relative immune privilege status of this tissue that enables corneal allografts to survive acute rejection in the absence of immunosuppressive therapy. It has also been used to define those factors that are most important in rejection of such allografts. Consequently, much of what we know concerning mechanisms of both corneal allograft acceptance and rejection are due to studies using a murine model of corneal transplantation. In addition to describing a model for acute corneal allograft rejection, we also present for the first time a model of late-term corneal allograft rejection.

Mice have been used as a model for studying many forms of transplantation, including corneal transplantation. We describe in this report a murine model for both acute and late-term corneal transplantation.

Murin de transplantation de la cornée: Un modèle pour étudier la forme la plus courante de la transplantation d&#39;organes solides

Corneal transplantation is the most common form of organ transplantation in the United States with between 45,000 and 55,000 procedures performed each ...

Transplantation Into the Mouse Ovarian Fat Pad

Orthotopic transplantation assays in mice are invaluable for studies of cell regeneration and neoplastic transformation. Common approaches for orthotopic transplantation of ovarian surface and tubal epithelia include intraperitoneal and intrabursal administration of cells. The respective limitations of these methods include poorly defined location of injected cells and limited space volume. Furthermore, they are poorly suited for long-term structural preservation of transplanted organs. To address these challenges, we have developed an alternative approach, which is based on the introduction of cells and tissue fragments into the mouse fat pad. The mouse ovarian fat pad is located in the immediate vicinity of the ovary and uterine tube (aka oviduct, fallopian tube), and provides a familiar microenvironment for cells and tissues of these organs. In our approach fluorescence-labeled mouse and human cells, and fragments of the uterine tube are engrafted by using minimally traumatic dorsal incision surgery. Transplanted cells and their outgrowths are easily located in the ovarian fat pad for over 40 days. Long-term transplantation of the entire uterine tube allows correct preservation of all principle tissue components, and does not result in adverse side effects, such as fibrosis and inflammation. Our approach should be uniquely applicable for answering important biological questions such as differentiation, regenerative and neoplastic potential of specific cell populations. Furthermore, it should be suitable for studies of microenvironmental factors in normal development and cancer.

We describe an ovarian fad pad transplantation assay suitable for studies of normal and transformed epithelia of the female reproductive tract. The mouse fat pad allows transplantation of large tissue fragments, is easily accessible for surgery and imaging, and provides the most favorable native environment for tissues of M&#252;llerian origin.

Transplantation Dans le tapis de souris ovarien Fat

Orthotopic transplantation assays in mice are invaluable for studies of cell regeneration and neoplastic transformation. Common approaches for orthotopic ...

Using the Sleeve Technique in a Mouse Model of Aortic Transplantation - An Instructional Video

Orthotopic aortic transplantation using the sleeve technique reduces injury to the aorta with failure rate of only 10-20%. The time to anastomose the aorta in mice using the sleeve method was short and easy averaging 20 min, permitting studies of iso/allo grafts. The following article describes the aortic transplantation procedure used in our laboratory. The mice were anesthetized with a mixture of 1.5% volume isoflurane and 100% oxygen through a face mask. At this point, the segment of the aorta between the renal arteries and its bifurcation was separated from the vena cava, freely prepared and clampedat the proximal and distal segments with a single silk suture. Prior to the removal of the aorta, a saline solution containing heparin was injected into the inferior vena cava. Then the aorta was cut between the clamps and a saline heparin solution was used to flush the lumen. The sleeve technique with monofilament sutures was used in order to transplant the abdominal aorta in the orthotopic position.

We present an orthotopic aortic transplantation model using the sleeve technique in mice. It is a very rapid anastomosis method, which can be employed in studies of vascular disease.

Utilisant la Technique de la manche dans un modèle murin de la greffe aortique - une vidéo d’instruction

Orthotopic aortic transplantation using the sleeve technique reduces injury to the aorta with failure rate of only 10-20%. The time to anastomose the ...

Mouse Model for Pancreas Transplantation Using a Modified Cuff Technique

Mouse models have several advantages in transplantation research, including easy handling, a variety of genetically well-defined strains, and the availability of the widest range of molecular probes and reagents to perform in vivo as well as in vitro studies. Based on our experience with various murine transplantation models, we developed a heterotopic pancreas transplantation model in mice with the intent to analyze mechanisms underlying severe ischemia reperfusion injury-associated early graft damage. In contrast to previously described techniques using suture techniques, herein we describe a new procedure using a non-suture cuff technique. 
In recent years, we have performed more than 300 pancreas transplantations in mice with an overall success rate of &gt;90%, a success rate never described before in mouse pancreas transplantation. The backbone of this non-suture cuff technique for graft revascularization consists of two major steps: (I) pulling the recipient vessel over a polyethylene/polyamide cuff and fixing it with a circumferential ligature, and (II) placing the donor vessel over the everted recipient vessel and fixing it with a second circumferential ligature. The resultant continuity of the endothelial layer results in less thrombogenic lesions with high patency rates and, finally, high success rates.
In this model, arterial anastomosis is achieved by pulling the abdominal aorta of the donor graft over the everted common carotid artery of the recipient animal. Venous drainage of the graft is achieved by pulling the portal vein of the graft over the everted external jugular vein of the recipient. This manuscript provides details and crucial steps of the organ recovery and organ implantation procedures, which will allow researchers with microsurgical skills to perform the transplantation successfully in their laboratories.

Among abdominal solid organ transplantation, pancreatic grafts are prone to develop severe ischemia reperfusion injury-associated graft damage, leading eventually to early graft loss. This protocol describes a model of murine pancreas transplantation using a non-suture cuff technique, ideally suited for analyzing these early, deleterious damages.

Modèle de souris pour une Transplantation du pancréas en utilisant une Technique mis à jour le brassard

Mouse models have several advantages in transplantation research, including easy handling, a variety of genetically well-defined strains, and the ...

Intravital Microscopy and Thrombus Induction in the Earlobe of a Hairless Mouse

Thrombotic complications of vascular diseases are one leading cause of morbidity and mortality in industrial nations. Due to the complex interactions between cellular and non-cellular blood components during thrombus formation, reliable studies of the physiology and pathophysiology of thrombosis can only be performed in vivo. Therefore, this article presents an ear model in hairless mice and focuses on the in vivo analysis of microcirculation, thrombus formation, and thrombus evolution. By using intravital fluorescence microscopy and the intravenous (iv) application of the respective fluorescent dyes, a repetitive analysis of microcirculation in the auricle can easily be performed, without the need for surgical preparation. Furthermore, this model can be adapted for in vivo studies of different issues, including wound healing, reperfusion injury, or angiogenesis. In summary, the ear of hairless mice is an ideal model for the in vivo study of skin microcirculation in physiological or pathophysiological conditions and for the evaluation of its reaction to different systemic or topical treatments.

The ear model of the hairless SKH1-Hrhr mouse enables intravital fluorescence microscopy of microcirculation and phototoxic thrombus induction without prior surgical preparation in the examined microvascular bed. Therefore, the ear of the hairless mouse is an excellent in vivo model to study the complex interactions during microvascular thrombus formation, thrombus evolution, and thrombolysis.

Microscopie intravitale et thrombus induction dans le lobe de l&#39;oreille d&#39;une souris sans poils

Thrombotic complications of vascular diseases are one leading cause of morbidity and mortality in industrial nations. Due to the complex interactions ...

Cardiopulmonary Bypass in a Mouse Model: A Novel Approach

As prolonged cardiopulmonary bypass becomes more essential during cardiac interventions, an increasing clinical demand arises for procedure optimization and for minimizing organ damage resulting from prolonged extracorporal circulation. The goal of this paper was to demonstrate a fully functional and clinically relevant model of cardiopulmonary bypass in a mouse. We report on the device design, perfusion circuit optimization, and microsurgical techniques. This model is an acute model, which is not compatible with survival due to the need for multiple blood drawings. Because of the range of tools available for mice (e.g., markers, knockouts, etc.), this model will facilitate investigation into the molecular mechanisms of organ damage and the effect of cardiopulmonary bypass in relation to other comorbidities.

This paper describes how to perform cardiopulmonary bypass in mice. This novel model will facilitate the investigation of the molecular mechanisms involved in organ damage.

Circulation extracorporelle dans un modèle murin : une nouvelle approche

As prolonged cardiopulmonary bypass becomes more essential during cardiac interventions, an increasing clinical demand arises for procedure optimization ...

Intraportal Transplantation of Pancreatic Islets in Mouse Model

Pancreatic islet transplantation to reduce hyperglycemia is highly successful in rodents with chemically-induced diabetes. The most common transplantation site in experimental islet transplantation is the kidney capsule. However, as less is known about the interaction of pancreatic islets with blood constituents, it also makes sense to utilize the portal vein approach in experimental islet transplantation.
This protocol demonstrates an intraportal islet transplantation technique in NMRI nude mice. Streptozotocin (180 mg/kg) is injected intraperitoneally to induce hyperglycemia in recipient mice. They are considered as diabetic at a non-fasting blood glucose level greater than 20 mmol/L. One day prior to transplantation, mouse pancreatic islets are isolated from the donor pancreas by collagenase digestion; a minimum of 350 islets are utilized per diabetic recipient. Depending upon the islet isolation yield, two or more donor mice are utilized per recipient. After overnight culture at 37 &#176;C, islets are administered into the recipient liver via the portal vein. After surgery, the mice are protected in red Makrolon houses and observed until are awake. This protocol maintains glycemic control for 120 days in syngeneic mice and 15 days in allogeneic mice.

Pancreatic islet transplantation is a way to achieve normoglycemia in type 1 diabetes. This article focuses on the transplantation technique through the intraportal route to maintain normal glucose levels in diabetic mice.

Intraporte Transplantation d’îlots pancréatiques dans le modèle murin

Pancreatic islet transplantation to reduce hyperglycemia is highly successful in rodents with chemically-induced diabetes. The most common transplantation ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Mesure de la contractilité isométrique de l’artère mésentérique de souris à l’aide de fil myographie

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Veno-Venous Extracorporeal Membrane Oxygenation in a Mouse

The use of extracorporeal membrane oxygenation (ECMO) has increased substantially in recent years. ECMO has become a reliable and effective therapy for acute as well as end-stage lung diseases. With the increase in clinical demand and prolonged use of ECMO, procedural optimization and prevention of multi-organ damage are of critical importance. The aim of this protocol is to present a detailed technique of veno-venous ECMO in a non-intubated, spontaneously breathing mouse. This protocol demonstrates the technical design of the ECMO and surgical steps. This murine ECMO model will facilitate the study of pathophysiology related to ECMO (e.g., inflammation,bleeding and thromboembolic events). Due to the abundance of genetically modified mice, the molecular mechanisms involved in ECMO-related complications can also be dissected.

Here we present a protocol describing the technique of veno-venous extracorporeal membrane oxygenation (ECMO) in a non-intubated, spontaneously breathing mouse. This murine model of ECMO can be effectively implemented in experimental studies of acute and end-stage lung diseases.

Oxygénation par Membrane extracorporelle veino-veineuse chez une souris

The use of extracorporeal membrane oxygenation (ECMO) has increased substantially in recent years. ECMO has become a reliable and effective therapy for ...