Soutenue par l&#39;Université du Kentucky, Département de biologie, Bureau des études de premier cycle et le Collège des Arts et des Sciences.

1. Présentation L&#39;aperçu plus récente de l&#39;intestin postérieur écrevisses a été respectée dans une dissertation par le Dr Barbara E. Musolf (2007, Georgia State University, Atlanta, Géorgie, USA), qui portait principalement sur ​​la modulation sérotoninergique et l&#39;innervation (Musolf et al., 2009 ). Hindguts crustacés ont d&#39;abord été étudiée il ya 100 ans par les Alexandrowicz, un pionnier dans l&#39;anatomie comparée (Alexandrowicz, 1909), qui a décrit les divers aspects de leur innervation. La recherche s&#39;est poursuivie au fil des années, d&#39;identifier les types de couches de muscles et de l&#39;architecture, s&#39;adressant à la fonction globale de l&#39;intestin postérieur dans l&#39;osmorégulation chez l&#39;animal entier, et en examinant le contrôle de modulation de la contractilité hindgut par divers composés (voir revue par Musolf, 2007). Il est intéressant de noter que la portion anale de l&#39;intestin postérieur agit non seulement à expulser les selles, mais aussi de prendre l&#39;eau de l&#39;environnement pour l&#39;osmorégulation. Cette région de l&#39;intestin peut subir avant ou arrière selon le péristaltisme besoins de l&#39;animal. Alexandrowicz (1909) ont identifié deux plexus nerveux innervant l&#39;intestin postérieur crustacé, une intérieure et une extérieure du plexus plexus, ce qui s&#39;avéra plus tard être de riches sources pour identifier et caractériser les neurotransmetteurs. Dans le Florey 1950, le Dr Ernst a commencé une série d&#39;études pharmacologiques sur l&#39;intestin postérieur écrevisses et a démontré que les contractions sont modulées par l&#39;acétylcholine et ses composés apparentés et aussi par l&#39;adrénaline et la noradrénaline (Florey, 1954). Florey, le découvreur d&#39;une substance inhibitrice connue comme «facteur-I&quot;, ont étudié les effets de cette substance sur diverses préparations, y compris le système gastro-intestinal chez les écrevisses (Florey, 1961). Facteur-I a été démontré plus tard à GABA. Ainsi, l&#39;intestin postérieur écrevisses joué un rôle important dans les premières études de l&#39;inhibition synaptique. Après la découverte du GABA, d&#39;autres émetteurs putatifs ont été également montré pour être associé à l&#39;intestin postérieur plexus et de susciter des réactions physiologiques. Émetteurs comprennent la dopamine (Elekes et al 1988;. Elofsson et al 1968.) Proctoline (RYLPG-OH;. Mercier et al 1997) deux peptides orcokinin (NFDEIDRSGFGFN et AFDEIDRSGFGFN; Bungart et al, 1994;.. Dircksen et al 2000) , orcomyotropin (FDAFTTGFamide; Dircksen et al 2000.) et un peptide myosuppressin (Mercier et al, 1997;... pQDLDHVFLRFamide plus probable, cf Stemmler et al 2007). Chacune de ces substances modulant les contractions spontanées hindgut, et tous sauf GABA semble être excitateurs. L&#39;intestin postérieur répond également aux glutamate et quisqualate (Jones, 1962;. Mauvaise et al 2003), mais des preuves claires pour l&#39;innervation glutamatergique n&#39;a pas été signalée. Messagers intracellulaires qui influent sur les effets des émetteurs différents sont en grande partie inexplorée, mais il ya des preuves de l&#39;implication de l&#39;AMPc dans la capacité de la dopamine pour améliorer les contractions (Knotz &amp; Mercier, 1995). Bien que l&#39;intestin postérieur crustacés contrats spontanément après dénervation, ces contractions sont généralement faibles et désorganisés (Pays de Galles, 1982; Winlow &amp; Laverack, 1972a). Le mouvement péristaltique de sortie du moteur nécessite coordonné à partir du système nerveux central, apparemment originaires du dernier ganglion abdominal (Winlow &amp; Laverack, 1972a, b, c). Dans les écrevisses, la puissance du moteur est effectué à l&#39;intestin postérieur par la racine 7 ème abdominale, qui contient 75 axones dont les corps cellulaires sont localisés dans le ganglion dernière abdominale (Kondoh &amp; Hisada, 1986). Au moins certains des peptides semblent être fournis au plexus hindgut à partir de neurones provenant du ganglion dernière abdominale (Dircksen et al 2000;.. Mercier et al, 1991b; Siwicki &amp; Bishop, 1986), mais la dopamine est fournie par les neurones dans plusieurs ganglions antérieure (Mercier et al. 1991a). Depuis la sortie du moteur grâce à la racine 7 ème abdominale est nécessaire pour les grands, les contractions coordonnées, il est probable que certains ou tous les émetteurs putatifs énumérés ci-dessus contribuent d&#39;une certaine façon de péristaltisme. Leur contribution relative, cependant, ne sont pas connus. Certains aperçu peut être acquise par l&#39;étude de leurs effets sur les muscles circulaires et longitudinaux séparément (Mercier &amp; Lee, 2002). En plus de contrôler le mouvement des aliments non digérés, le plexus nerveux associés à l&#39;intestin postérieur crustacés semble jouer une fonction endocrine associée à la mue. L&#39;intestin postérieur du crabe, Carcinus maenas, contient des cellules endocrines qui libèrent l&#39;hormone hyperglycémiques crustacés et de son peptide précurseur liées au cours ecdysis (Webster et al. 2000), suggérant un rôle dans l&#39;absorption d&#39;eau et de gonflement associés à la mue. Ainsi, l&#39;intestin postérieur crustacés participe à plusieurs processus physiologiques importants. Ce rapport est principalement un outil d&#39;enseignement pour l&#39;école secondaire de pointe et les étudiants de premier cycle en cours de physiologie qui participent à l&#39;expérimentation. L&#39;importance ainsi que le mécanisme potentiel derrière comment les contrats hindgut et les fonctions peuvent être abordées par les élèves. Les agents pharmacologiques, les neurotransmetteurs et neurohormones seront utilisés, et les courbes dose-réponse sera construite, ce qui va amener les élèves à la façon d&#39;acquérir et interpréter les données physiologiques et pharmacologiques. Une compréhension générale de la fonction du récepteur à l&#39;égard des agonistes et antagonistes peuvent aussi être atteints. Les étudiants apprendront aussi à présenter des données sous forme graphique pour l&#39;analyse statistique. Il est très facile de disséquer et d&#39;enregistrer les contractions de l&#39;intestin postérieur écrevisses. Dans la préparation disséquée, l&#39;intestin est facilement exposés à des substances exogènes. L&#39;altération de l&#39;activité péristaltique peut être contrôlé visuellement ou avec un capteur de force, qui peut aussi surveiller la force des contractions. En raison de sa simplicité et sa fiabilité en tant que préparation de bio-essais, l&#39;intestin postérieur écrevisses est encore très utile pour étudier les questions de recherche beaucoup sur les mécanismes de péristaltisme, la modulation de puissance du moteur et la contraction musculaire, et la fonction du récepteur. L&#39;intestin postérieur est également utile pour les insecticides tests, crustaceancides, et les polluants pour les mécanismes d&#39;actions spécifiques. 2. Méthodes 2.1) Matières <ul><li> écrevisse </li><li> écrevisses salines </li><li> instruments de dissection (ciseaux grossière et fine, grossière et une pince fine) </li><li> Sylgard à fond plat de Pétri </li><li> tiges d&#39;acier dissection </li><li> béchers (pour retenir des solutions chimiques) </li><li> parafilm (pour couvrir le mélange et solutions) </li></ul> 2.2) Dissection <ol><li> Ecrevisses (Procambarus clarkii) mesurant 6-10 cm de longueur du corps doit être placé sur la glace pendant 5 à 10 minutes à anesthésier l&#39;animal avant dissection débute. </li><li> Tenir les écrevisses anesthésiés par derrière les griffes d&#39;une seule main. Rapidement, coupé de la cavité de l&#39;œil au milieu de la tête sur les deux faces, puis décapiter les écrevisses (Remarque: le sang de la préparation sera collante quand elle sèche, donc lavez les outils une fois rempli). <img src="/files/ftp_upload/2324/2324fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1: Décapitation de l&#39;écrevisse </li><li> Coupez le chélipèdes et les jambes de marche. </li><li> Coupez les ailerons gauche et à droite, ne laissant que la nageoire caudale du milieu (uropode). </li><li> Sur la face dorsale de l&#39;écrevisse coupé ventralement la fois sur le côté gauche et à droite de la cuticule dorsale. <img src="/files/ftp_upload/2324/2324fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2: Retrait de cuticule dorsale </li><li> Couper transversalement sur la face dorsale de la cuticule, en s&#39;assurant que la coupe est peu profonde pour éviter d&#39;endommager l&#39;IG Ensuite, retirer la partie inférieure de la cuticule dorsale abdominale. </li><li> Placez les écrevisses disséqué dans un plat Sylgard fourrées. </li><li> Epingler les écrevisses à l&#39;antenne à la pointe de la nageoire caudale. On peut utiliser plusieurs broches de chaque côté de l&#39;IG en tant que nécessaire pour maintenir le corps vers le bas. </li><li> Remplir le plat avec une solution saline écrevisses couvrant l&#39;IG Assurez-vous de toujours éteindre le GI avec une solution saline à l&#39;aide d&#39;une pipette. Saline est une solution modifiés Van Harreveld (1936), ce qui est fait avec 205 mM de NaCl, 5,3 mM de KCl; 13,5 mM CaCl 2, 2H 2 O; 2,45 mM MgCl 2 6H 2 O, 5 mM d&#39;HEPES et ajusté à pH 7,4. L&#39;écrevisse disséqués doit apparaître comme le montre la figure 3. <img src="/files/ftp_upload/2324/2324fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3: écrevisses disséqué avec IG intactes. </li></ol> 2.3) Expériences 2.3.1) Les contractions de l&#39;animal <ol><li> Avez-solutions du composé à tester prêt et à la même température que la solution saline de bain. Sur pourraient utiliser des solutions individuelles de la sérotonine (100 nM, 1microM), le glutamate (1microM), et de la dopamine (1microM) faite dans une solution saline écrevisses comme substances de départ pour être testés. </li><li> Autoriser l&#39;écrevisse disséqués à s&#39;asseoir dans la solution des écrevisses pendant environ dix minutes pour lui permettre de s&#39;ajuster au choc de la dissection et l&#39;exposition saline. Les contractions lentes péristaltisme de l&#39;intestin postérieur devrait commencer à produire. </li><li> Une fois les contractions commencent, d&#39;enregistrer le nombre de contractions qui se produisent dans une trentaine de secondes (noter le type de contractions qui se produisent: Type péristaltisme-dire, ou spastique, et la direction de toute ondes péristaltiques). Tableau 1: Les contractions dans les écrevisses Saline <table border="1"><tbody><tr><td> Nombre de contractions </td><td> Type de contractions </td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table></li><li> L&#39;utilisation d&#39;un PIPette, enlever la solution saline dans la cavité de l&#39;abdomen de l&#39;écrevisse exposés, et appliquer une solution saline contenant la substance à examiner directement sur le postérieur. </li><li> Immédiatement après l&#39;ajout de la solution, enregistrer le nombre de contractions qui surviennent après trente secondes et noter le type de contractions qui se produisent (c.-péristaltique, ou spastique). Tableau 2: Contractions à l&#39;exposition aux composés <table border="1"><tbody><tr><td> Composé testé </td><td> Concentration </td><td> Nombre de contractions </td><td> Type de contractions </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table></li><li> Immédiatement après l&#39;enregistrement de la réponse à la substance d&#39;essai, rincer la fois de plusieurs GI avec une solution saline normale écrevisses. Laissez la préparation reposer pendant 5 minutes, tout en rinçant toutes les 30 secondes avec une solution saline écrevisses. </li><li> Avec une pipette, placer quelques saline contenant le composé suivant à examiner ou à une concentration de la substance variée derniers testés directement sur le postérieur. Il est préférable de commencer avec une concentration plus faible et la façon dont une œuvre à des concentrations plus élevées. </li><li> Immédiatement après l&#39;ajout de chaque nouvelle substance ou chaque nouvelle concentration, enregistrer le nombre de contractions qui surviennent après trente secondes et noter le type de contractions. </li></ol> 2.3.2) L&#39;enregistrement des forces de contraction dans les préparations excisées <img src="/files/ftp_upload/2324/2324fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4: Installation <ol><li> Fixez le transducteur à la nacelle du pont. </li><li> Fixez le pont à la gousse de 26T PowerLab. </li><li> Fixez le 26T PowerLab au port USB de l&#39;ordinateur. </li><li> Ouvrez LabChart7, en cliquant sur l&#39;icône labchart7 sur le bureau. <ul><li> La zone Centre LabChart Bienvenue apparaîtra ouvert. Fermez-le. </li><li> Cliquez sur Setup </li><li> Cliquez sur Paramètres canal. Changer le nombre de canaux à 1 (en bas à gauche de la boîte) Appuyer sur OK. </li><li> En haut à gauche de la carte de l&#39;ensemble de cycles par seconde à environ 2k. Réglez le volts (axe Y) à environ 500 ou 200 mV. </li><li> Cliquez sur le canal 1 sur la droite du graphique. Cliquez sur l&#39;amplificateur d&#39;entrée. Assurez-vous que les paramètres: single-ended, couplage AC, et inverser (inverse le signal si nécessaire), et d&#39;anti-alias, sont vérifiées. </li><li> Pour commencer l&#39;enregistrement appuyer sur start. </li></ul></li><li> Ramasser la préparation et couper le tube digestif à la jonction entre le thorax et l&#39;abdomen. Puis couper soigneusement autour de la partie telson de la queue. Retirer le tube digestif de l&#39;écrevisse disséqué et le placer dans le plat Sylgard. Il ya un vaisseau sanguin qui longe la face dorsale du tube digestif. Retirez soigneusement ce loin du tractus gastro-intestinal. Verser salines écrevisses fraîches sur la préparation. </li><li> Placez le capteur de force dans la pince à proximité de l&#39;écrevisse disséqués. </li><li> Accrocher le capteur de force dans l&#39;IG écrevisses comme dans la Figure 5. <img src="/files/ftp_upload/2324/2324fig5.jpg" alt="Figure 5" /> Figure 5: hindgut isolés de l&#39;écrevisse dans une solution saline attachée au crochet du capteur de force </li><li> Attendez jusqu&#39;à ce que l&#39;IG commence à se contracter, et appuyez sur Start sur la LabChart7. </li><li> Laissez le programme fonctionner pendant environ 20 secondes. Poussez &quot;stop&quot;, et ajouter un commentaire étiquetés », Saline seulement». Remplissez le tableau 4. Tableau 4: Les contractions avec un composé d&#39;intérêt <table border="1"><tbody><tr><td> Nombre de contractions </td><td> L&#39;amplitude des contractions (mV) </td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table></li><li> Ajouter les composés à tester d&#39;intérêt, et immédiatement push &quot;démarrer&quot; sur le LabChart7. </li><li> Laissez le programme fonctionner pendant environ 20 secondes. Poussez «stop» et d&#39;ajouter un commentaire directement sur le fichier graphique de ce que la substance a été ajoutée et sa concentration. Remplissez le tableau ci-dessous. Tableau 5: Les contractions avec le composé _________ <table border="1"><tbody><tr><td> Nombre de contractions </td><td> L&#39;amplitude des contractions (mV) </td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table></li><li> Rincer la préparation avec une solution saline d&#39;écrevisses à l&#39;aide d&#39;une pipette. </li><li> Ajouter d&#39;autres substances ou diverses concentrations d&#39;une manière semblable. Immédiatement push &quot;démarrer&quot; sur le LabChart7. </li><li> Laissez le programme fonctionner pendant environ 20 secondes. Poussez &quot;stop&quot;, et ajoutez un commentaire et l&#39;étiquette directement sur le fichier graphique indiquant le compound utilisé et la concentration. </li></ol> 3. Analyse des données <ol><li> De 2.3.1 de l&#39;expérience, un graphique le nombre de contractions de chaque solution (une solution saline, la sérotonine, glutamate) en fonction du temps. Expliquez toutes les tendances. </li><li> De 2.3.2 de l&#39;expérience, un graphique le nombre de contractions de chaque solution (une solution saline, la sérotonine, glutamate) vs l&#39;amplitude des contractions en mV. Expliquez toutes les tendances. </li></ol> 3.1) Mesure de la vitesse et la force des contractions Pour indexer les tarifs des contractions sur le pouvez mesurer le temps depuis le début sur une flèche au début de la prochaine ou compter les débattements total sur une ou deux minutes. Les valeurs peuvent ensuite être mis en termes de contractions par minute ou seconde par fonction de la rapidité de leur apparition. Pour indexer la force des contractions d&#39;une mesure relative pourrait être utilisé pour comparer différentes conditions. Sur le fichier enregistré, on peut utiliser le marqueur «M» et de passer à la ligne de base. Utilisez ensuite le curseur et de passer à l&#39;apogée de la déviation et prendre note de la valeur indiquée en haut à droite de l&#39;écran comme une valeur delta (la différence de M à la pointe). Notez le curseur doit être maintenu immobile pendant la mesure du changement. Puis déplacez le M de la forme la prochaine vague d&#39;intérêt et de répéter la mesure.

<ol>
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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-mass-resolution+direct-tissue+MALDI-FTMS+reveals+broad+conservation+of+three+neuropeptides+(APSGFLGMRamide,+GYRKPPFNGSIFamide+and+pQDLDHVFLRFamide)+across+members+of+seven+decapod+crustaean+infraorders.">High-mass-resolution direct-tissue MALDI-FTMS reveals broad conservation of three neuropeptides (APSGFLGMRamide, GYRKPPFNGSIFamide and pQDLDHVFLRFamide) across members of seven decapod crustaean infraorders.</a> Peptides. 28, 2104-2115 (2007).</li><li>Wales, W., Sandeman, D. C., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+mouthparts+and+gut.">Control of mouthparts and gut.</a> The Biology of Crustacea. 4, 165-191 (1982).</li><li>Webster, S. G., Dircksen, H., Chung, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocrine+cells+in+the+gut+of+the+shore+crab+Carcinus+maenas+immunoreactive+to+crustacean+hyperglycaemic+hormone+and+its+precursor-related+peptide.">Endocrine cells in the gut of the shore crab Carcinus maenas immunoreactive to crustacean hyperglycaemic hormone and its precursor-related peptide.</a> J. Exp. Biol. 300, 193-205 (2000).</li><li>Winlow, W., Laverack, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+control+of+hindgut+motility+in+the+lobster+Homarus+gammarus+(L.).+1.+Analysis+of+hindgut+movements+and+receptor+activity.">The control of hindgut motility in the lobster Homarus gammarus (L.). 1. Analysis of hindgut movements and receptor activity.</a> Mar. Behav. Physiol. 1, 1-28 (1972).</li><li>Winlow, W., Laverack, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+control+of+hindgut+motility+in+the+lobster+Homarus+gammarus+(L.).+2.+Motor+output.">The control of hindgut motility in the lobster Homarus gammarus (L.). 2. Motor output.</a> Mar. Behav. Physiol. 1, 29-47 (1972).</li><li>Winlow, W., Laverack, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+control+of+hindgut+motility+in+the+lobster+Homarus+gammarus+(L.).+3.+Structure+of+the+sixth+abdominal+ganglion+(6+A.G.)+and+associated+ablation+and+microelectrode+studies.">The control of hindgut motility in the lobster Homarus gammarus (L.). 3. Structure of the sixth abdominal ganglion (6 A.G.) and associated ablation and microelectrode studies.</a> Mar. Behav. Physiol. 1, 93-121 (1972).</li><li>Wrong, A. D., Sammahin, M., Richardson, R., Mercier, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+properties+of+glutamate+receptors+associated+with+the+crayfish+hindgut.">Pharmacological properties of glutamate receptors associated with the crayfish hindgut.</a> J. Comp. Physiol. 189, 371-378 (2003).</li></ol>

Les détails fournis dans le film et le texte associé décrivent les étapes clés nécessaires pour enregistrer l&#39;activité dans l&#39;intestin postérieur de l&#39;écrevisse in situ ainsi que in vitro. Un des objectifs de notre rapport est d&#39;augmenter la sensibilisation au potentiel de cette préparation dans gérée par des étudiants des laboratoires d&#39;investigation qui enseigner les concepts fondamentaux en physiologie et pharmacologie. Ces préparations peuvent être utilisées pour enquêter sur un certain nombre de questions expérimentales qui mèneront à une meilleure compréhension des fonctions physiologiques de l&#39;intestin postérieur. Les mécanismes sous-jacents réglementation des ondes péristaltiques et de son retournement ne sont pas encore connues. Les mécanismes de renforcement du contrôle sur l&#39;ensemble du tractus gastro-intestinal sont également pas entièrement comprise. La question de savoir comment les centres supérieurs d&#39;intégrer leurs activités avec la sortie nerveux autonome qui contrôle directement le système gastro-intestinal reste un espace ouvert d&#39;enquête (Shuranova et al., 2006). En outre, les capacités de l&#39;intestin postérieur osmorégulation crustacés et les fonctions d&#39;osmorégulation au cours du stress mue et l&#39;environnement n&#39;ont pas été complètement élucidée. Il ya encore beaucoup de questions en attente de réponses dans cette préparation.

<ol><li> Ecrevisses (Procambarus clarkii). Atchafalaya biologique Supply Co., Raceland, LA., USA. </li><li> Standard écrevisses salin: modification de la solution Van Harreveld (1936). (En mm) 205 NaCl, 5,3 KCl; 13,5 CaCl 2, 2H 2 O; 2,45 MgCl 2 6H 2 O; HEPES 5 et ajusté à pH 7,4. La sérotonine, glutamate et la dopamine sont faites dans une solution saline écrevisses. Tous les produits chimiques sont obtenus chez Sigma Chemical Company (St. Louis, MO). </li><li> Des outils de dissection: Beaux # 5 pinces, ciseaux fins, porte-lame de couteau, des broches # 26002-20 insectes (tous obtenus à partir des outils Fine Science (USA), Inc, 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139) </li><li> Sylgard à fond plat de Pétri </li><li> Béchers (pour retenir des solutions chimiques) </li><li> Les signaux électriques sont enregistrées sur la ligne à une interface PowerLab 26T à un ordinateur (ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA). Nous utilisons un logiciel standard de ADInstruments nommé Chart ou la portée. <li> Pont pod pour le capteur de force (gousses Pont différentes sont nécessaires pour différents types de capteurs de force). </li><li> MLT0402 transducteur force (deux grammes) est le grade de recherche comme le montre la vidéo. MLT 0210 / D (10 mg-25 grammes) et la MLT 500 / A (0-500g) sont les transducteurs éducatif grades (ADInstruments). </li></ol>

physiological experimentation with the crayfish hindgut: a student laboratory exercise

Le but du rapport est de décrire les techniques de dissection pour la préparation de l&#39;intestin postérieur écrevisses et pour montrer comment faire des enregistrements physiologiques avec un capteur de force pour contrôler la force de contraction. En outre, nous démontrons comment surveiller visuellement l&#39;activité péristaltique, qui peut être utilisé comme un test biologique pour les différents peptides, amines biogènes et des neurotransmetteurs. Cette préparation se prête à des laboratoires étudiant la physiologie et de démontrer des concepts pharmacologiques pour les étudiants. Cette préparation a été en usage depuis plus de 100 ans, et il offre encore beaucoup comme un modèle pour étudier la génération et la régulation des rythmes péristaltique et pour décrire les mécanismes sous-jacents de leur modulation. Les essais pharmacologiques et des récepteurs de sous-typage qui ont commencé il ya 50 ans sur le hindgut contribuent toujours à la recherche d&#39;aujourd&#39;hui. Cette préparation robuste est bien adapté à la formation des étudiants en physiologie et pharmacologie.

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Physiological Experimentation with the Crayfish Hindgut: A Student Laboratory Exercise

Dans ce rapport, nous démontrons techniques qui peuvent être utilisées pour étudier la biologie de l&#39;intestin postérieur écrevisses. Nous montrons comment disséquer un abdomen écrevisses et étudier l&#39;anatomie associés, la physiologie et la modulation de l&#39;activité. L&#39;activité péristaltique et la force des contractions sont mesurées en utilisant un capteur de force.

L&#39;expérimentation physiologique avec l&#39;intestin postérieur écrevisses: un exercice de laboratoire étudiant

The purpose of the report is to describe dissection techniques for preparing the crayfish hindgut and to demonstrate how to make physiological recordings ...

physiological-experimentation-with-crayfish-hindgut-student

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.7K vues.  University of Kentucky. Dans ce rapport, nous démontrons techniques qui peuvent être utilisées pour étudier la biologie de l'intestin postérieur écrevisses. Nous montrons comment disséquer un abdomen écrevisses et étudier l'anatomie associés, la physiologie et la modulation de l'activité. L'activité péristaltique et la force des contractions sont mesurées en utilisant un capteur de force.

Vidéo: Physiological Experimentation with the Crayfish Hindgut: A Student Laboratory Exercise

Recording Behavioral Responses to Reflection in Crayfish

Social behavior depends on sensory input from the visual, mechanical and olfactory systems. One important issue concerns the relative roles of each sensory modality in guiding behavior. The role of visual inputs has been examined by isolating visual stimuli from mechanical and chemosensory stimuli. In some studies (Bruski &amp; Dunham, 1987: Delgado-Morales et al., 2004) visual inputs have been removed with blindfolds or low light intensity, and effects of remaining sensory modalities have been elucidated. An alternative approach is to study the effects of visual inputs in the absence of any appropriate mechanical and chemosensory cues. This approach aims to identify the exclusive role of visual inputs. 
We have used two methods to provide visual stimuli to crayfish without providing chemical and mechanical cues. In one method, crayfish are videotaped in an aquarium where half of the walls are covered in mirrors to provide a reflective environment, and the other half are covered in a non-reflective (matte finish) plastic. This gives the crayfish a choice between reflective and non-reflective environments. The reflective environment provides visual cues in the form of reflected images of the crayfish as it moves throughout half of the tank; these visual cues are missing from the non-reflective half of the tank. An alternative method is to videotape the behavior of crayfish in an aquarium separated by a smaller chamber at each end, with a crayfish in one small chamber providing visual cues and an inert object in the opposite small chamber providing visual input from a non-moving, non-crayfish source. 
Our published results indicate that responses of crayfish to the reflective environment depend on socialization and dominance rank. Socialized crayfish spent more time in the reflective environment and exhibited certain behaviors more frequently there than in the non-reflective environment; isolated crayfish showed no such differences. Crayfish that were housed in same-sex pairs developed a social rank of either dominant or subordinate. Responses to reflection differed between dominant and subordinate crayfish (May &amp; Mercier, 2006; May &amp; Mercier, 2007). Dominant crayfish spent more time on the reflective side, entered reflective corners more frequently and spent more time in reflective corners compared to the non-reflective side. Subordinate crayfish walked in reverse more often on the reflective side than on the non-reflective side. Preliminary data suggest similar effects from visual cues provided by a crayfish in a small adjoining chamber (May et al., 2008).

We have developed two methods for studying effects of visual cues on behavior in the absence of tactile and chemical cues. One method involves videotaping responses of crayfish to reflective walls in an aquarium; the other examines effects of visual inputs provided by a live crayfish behind a transparent partition.

Enregistrement des réponses comportementales à la réflexion chez les écrevisses

Social behavior depends on sensory input from the visual, mechanical and olfactory systems.  One important issue concerns the relative roles of each ...

Recherche

Neurosciences

A Procedure for Studying the Footshock-Induced Reinstatement of Cocaine Seeking in Laboratory Rats

The most insidious aspect of drug addiction is the high propensity for relapse. Animal models of relapse, known as reinstatement procedures, have been used extensively to study the neurobiology and phenomenology of relapse to drug use. Although procedural variations have emerged over the past several decades, the most conventional reinstatement procedures are based on the drug self-administration (SA) model. In this model, an animal is trained to perform an operant response to obtain drug. Subsequently, the behavior is extinguished by withholding response-contingent reinforcement. Reinstatement of drug seeking is then triggered by a discrete event, such as an injection of the training drug, re-exposure to drug-associated cues, or exposure to a stressor 1.
Reinstatement procedures were originally developed to study the ability of acute non-contingent exposure to the training drug to reinstate drug seeking in rats and monkeys 1, 2. Reinstatement procedures have since been modified to study the role of environmental stimuli, including drug-associated cues and exposure to various forms of stress, in relapse to drug seeking 1, 3, 4.
Over the past 15 years, a major focus of the reinstatement literature has been on the role of stress in drug relapse. One of the most commonly used forms of stress for studying this relationship is acute exposures to mild, intermittent, electric footshocks. The ability of footshock stress to induce reinstatement of drug seeking was originally demonstrated by Shaham and colleagues (1995) in rats with a history of intravenous heroin SA5. Subsequently, the effect was generalized to rats with histories of intravenous cocaine, methamphetamine, and nicotine SA, as well as oral ethanol SA 3, 6.
Although footshock-induced reinstatement of drug seeking can be achieved reliably and robustly, it is an effect that tends to be sensitive to certain parametrical variables. These include the arrangement of extinction and reinstatement test sessions, the intensity and duration of footshock stress, and the presence of drug-associated cues during extinction and testing for reinstatement. Here we present a protocol for footshock-induced reinstatement of cocaine seeking that we have used with consistent success to study the relationship between stress and cocaine seeking.

Animal models of relapse, known as reinstatement procedures, have been used extensively to study the role of stress in relapse to drug seeking. Here, we report on a method for inducing the reinstatement of cocaine seeking in laboratory rats via acute exposures to mild, intermittent electric footshock.

Une procédure pour l&#39;étude de l&#39;Rétablissement choc électrique induite par la cocaïne d&#39;Cherchant des rats de laboratoire

The most insidious aspect of drug addiction is the high propensity for relapse.  Animal models of relapse, known as reinstatement procedures, have been ...

Physiological Recordings of High and Low Output NMJs on the Crayfish Leg Extensor Muscle

We explain in detail how to expose and conduct electrophysiological recordings of synaptic responses for high (phasic) and low (tonic) output motor neurons innervating the extensor muscle in the walking leg of a crayfish. Distinct differences are present in the physiology and morphology of the phasic and tonic nerve terminals. The tonic axon contains many more mitochondria, enabling it to take a vital stain more intensely than the phasic axon. The tonic terminals have varicosities, and the phasic terminal is filiform. The tonic terminals are low in synaptic efficacy but show dramatic facilitated responses. In contrast, the phasic terminals are high in quantal efficacy but show synaptic depression with high frequency stimulation. The quantal output is measured with a focal macropatch electrode placed directly over the visualized nerve terminals. Both phasic and tonic terminals innervate the same muscle fibers, which suggests that inherent differences in the neurons, rather than differential retrograde feedback from the muscle, account for the morphological and physiological differentiation.

This article demonstrates how to conduct electrophysiological recordings of synaptic responses on the extensor muscle in the walking leg of a crayfish and how the nerve terminals are visualized to show the gross morphological differences of high- and low-output nerve terminals.

Enregistrements physiologiques des NMJs rendement élevé et faible sur le muscle extenseur écrevisses jambe

We explain in detail how to expose and conduct electrophysiological recordings of synaptic responses for high (phasic) and low (tonic) output motor ...

Membrane Potentials, Synaptic Responses, Neuronal Circuitry, Neuromodulation and Muscle Histology Using the Crayfish: Student Laboratory Exercises

The purpose of this report is to help develop an understanding of the effects caused by ion gradients across a biological membrane. Two aspects that influence a cell's membrane potential and which we address in these experiments are: (1) Ion concentration of K+ on the outside of the membrane, and (2) the permeability of the membrane to specific ions. The crayfish abdominal extensor muscles are in groupings with some being tonic (slow) and others phasic (fast) in their biochemical and physiological phenotypes, as well as in their structure; the motor neurons that innervate these muscles are correspondingly different in functional characteristics. We use these muscles as well as the superficial, tonic abdominal flexor muscle to demonstrate properties in synaptic transmission. In addition, we introduce a sensory-CNS-motor neuron-muscle circuit to demonstrate the effect of cuticular sensory stimulation as well as the influence of neuromodulators on certain aspects of the circuit. With the techniques obtained in this exercise, one can begin to answer many questions remaining in other experimental preparations as well as in physiological applications related to medicine and health. We have demonstrated the usefulness of model invertebrate preparations to address fundamental questions pertinent to all animals.

The experiments demonstrate an easy approach for students to gain experience in examining muscle structure, synaptic responses, the effects of ion gradients and permeability on membrane potentials. Also, a sensory-CNS-motor-muscle circuit is presented to show a means to test effects of compounds on a neuronal circuit.

Potentiels de membrane, les réponses synaptiques, circuits neuronaux, neuromodulation et histologie muscle en utilisant l&#39;écrevisse: des exercices de laboratoire étudiant

The purpose of this report is to help develop an understanding of the effects caused by ion gradients across a biological membrane. Two aspects that ...

Muscle Receptor Organs in the Crayfish Abdomen: A Student Laboratory Exercise in Proprioception

The primary purpose of this experiment is to demonstrate primary sensory neurons conveying information of joint movements and positions as proprioceptive information for an animal. An additional objective of this experiment is to learn anatomy of the preparation by staining, dissection and viewing of neurons and sensory structures under a dissecting microscope. This is performed by using basic neurophysiological equipment to record the electrical activity from a joint receptor organ and staining techniques. The muscle receptor organ (MRO) system in the crayfish is analogous to the intrafusal muscle spindle in mammals, which aids in serving as a comparative model that is more readily accessible for electrophysiological recordings. In addition, these are identifiable sensory neurons among preparations. The preparation is viable in a minimal saline for hours which is amenable for student laboratory exercises. The MRO is also susceptible to neuromodulation which encourages intriguing questions in the sites of modulatory action and integration of dynamic signals of movements and static position along with a gain that can be changed in the system.

The primary purpose of this experiment is to understand how primary sensory neurons convey information of joint movements and positions as proprioceptive information for an animal. An additional objective of this report is present the anatomy of the preparation by dissection and viewing of neurons under a dissecting microscope.

Organes récepteurs musculaires à l&#39;abdomen des écrevisses: un exercice de laboratoire étudiant de la proprioception

The primary purpose of this experiment is to demonstrate primary sensory neurons conveying information of joint movements and positions as proprioceptive ...

VisualEyes: A Modular Software System for Oculomotor Experimentation

Eye movement studies have provided a strong foundation forming an understanding of how the brain acquires visual information in both the normal and dysfunctional brain.1 However, development of a platform to stimulate and store eye movements can require substantial programming, time and costs. Many systems do not offer the flexibility to program numerous stimuli for a variety of experimental needs. However, the VisualEyes System has a flexible architecture, allowing the operator to choose any background and foreground stimulus, program one or two screens for tandem or opposing eye movements and stimulate the left and right eye independently. This system can significantly reduce the programming development time needed to conduct an oculomotor study. The VisualEyes System will be discussed in three parts: 1) the oculomotor recording device to acquire eye movement responses, 2) the VisualEyes software written in LabView, to generate an array of stimuli and store responses as text files and 3) offline data analysis. Eye movements can be recorded by several types of instrumentation such as: a limbus tracking system, a sclera search coil, or a video image system. Typical eye movement stimuli such as saccadic steps, vergent ramps and vergent steps with the corresponding responses will be shown. In this video report, we demonstrate the flexibility of a system to create numerous visual stimuli and record eye movements that can be utilized by basic scientists and clinicians to study healthy as well as clinical populations.

Neural control and cognitive processes can be studied through eye movements. The VisualEyes software allows an operator to program stimuli on two computer screens independently using a simple, custom scripting language. The system can stimulate tandem eye movements (saccades and smooth pursuit) or opposing eye movements (vergence) or any combination.

Visualeyes: un système logiciel modulaire pour l&#39;expérimentation oculomoteurs

Eye movement studies have provided a strong foundation forming an understanding of how the brain acquires visual information in both the normal and ...

Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex behaviors such as food choice, predator, conspecific and mate recognition and other socially relevant cues. Olfactory receptor neurons (ORNs) are located in the dorsal part of the nasal cavity embedded in the olfactory epithelium. These bipolar neurons send an axon to the olfactory bulb (see Fig. 1, Reisert &amp; Zhao1, originally published in the Journal of General Physiology) and extend a single dendrite to the epithelial border from where cilia radiate into the mucus that covers the olfactory epithelium. The cilia contain the signal transduction machinery that ultimately leads to excitatory current influx through the ciliary transduction channels, a cyclic nucleotide-gated (CNG) channel and a Ca2+-activated Cl- channel (Fig. 1). The ensuing depolarization triggers action potential generation at the cell body2-4.
In this video we describe the use of the "suction pipette technique" to record odorant-induced responses from ORNs. This method was originally developed to record from rod photoreceptors5 and a variant of this method can be found at jove.com modified to record from mouse cone photoreceptors6. The suction pipette technique was later adapted to also record from ORNs7,8. Briefly, following dissociation of the olfactory epithelium and cell isolation, the entire cell body of an ORN is sucked into the tip of a recording pipette. The dendrite and the cilia remain exposed to the bath solution and thus accessible to solution changes to enable e.g. odorant or pharmacological blocker application. In this configuration, no access to the intracellular environment is gained (no whole-cell voltage clamp) and the intracellular voltage remains free to vary. This allows the simultaneous recording of the slow receptor current that originates at the cilia and fast action potentials fired by the cell body9. The difference in kinetics between these two signals allows them to be separated using different filter settings. This technique can be used on any wild type or knockout mouse or to record selectively from ORNs that also express GFP to label specific subsets of ORNs, e.g. expressing a given odorant receptor or ion channel.

Olfactory receptor neurons (ORNs) convert odor signals first into a receptor current that in turn triggers action potentials that are conveyed to second order neurons in the olfactory bulb. Here we describe the suction pipette technique to record simultaneously the odorant-induced receptor current and action potentials from mouse ORNs.

Odorant induites réponses enregistrées à partir de neurones récepteurs olfactifs en utilisant la technique de la pipette d&#39;aspiration

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex ...

Proprioception and Tension Receptors in Crab Limbs: Student Laboratory Exercises

The primary purpose of these procedures is to demonstrate for teaching and research purposes how to record the activity of living primary sensory neurons responsible for proprioception as they are detecting joint position and movement, and muscle tension. Electrical activity from crustacean proprioceptors and tension receptors is recorded by basic neurophysiological instrumentation, and a transducer is used to simultaneously measure force that is generated by stimulating a motor nerve. In addition, we demonstrate how to stain the neurons for a quick assessment of their anatomical arrangement or for permanent fixation. Staining reveals anatomical organization that is representative of chordotonal organs in most crustaceans. Comparing the tension nerve responses to the proprioceptive responses is an effective teaching tool in determining how these sensory neurons are defined functionally and how the anatomy is correlated to the function. Three staining techniques are presented allowing researchers and instructors to choose a method that is ideal for their laboratory.

Physiological and anatomical techniques are demonstrated to address function and structure for joint proprioceptors and muscle tension receptors in crustacean walking limbs.

Proprioception et tension récepteurs en crabe Membres: Exercices de laboratoire étudiant

The primary purpose of these procedures is to demonstrate for teaching and research purposes how to record the activity of living primary sensory neurons ...

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The serotonergic feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of critical importance during the development of the circuit. Using the functional output of the circuit, feeding, changes in the neuronal architecture of the stomatogastric system can be visualized. Feeding behavior can be recorded by observing the rate of retraction of the mouth hooks, which receive innervation from the brain. Locomotor behavior is used as a physiological control for feeding, since larvae use their mouth hooks to traverse across an agar substrate. Changes in feeding behavior can be correlated with the axonal architecture of the neurites innervating the gut. Using immunohistochemistry it is possible to visualize and quantitate these changes. Improper handling of the larvae during behavior paradigms can alter data as they are very sensitive to manipulations. Proper imaging of the neurite architecture innervating the gut is critical for precise quantitation of number and size of varicosities as well as the extent of branch nodes. Analysis of most circuits allow only for visualization of neurite architecture or behavioral effects; however, this model allows one to correlate the functional output of the circuit with the impairments in neuronal architecture.

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae serves a simple yet powerful model that allows changes in feeding rate to be correlated with alterations in the stomatogastric neural circuitry. This circuit is composed of central serotonergic neurons that send projections to the mouth hooks as well as the foregut.

Analyse fonctionnelle du circuit d&#39;alimentation des larves dans Drosophila</i

The serotonergic  feeding circuit in Drosophila  melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of  critical importance during the ...

Measuring Oral Fatty Acid Thresholds, Fat Perception, Fatty Food Liking, and Papillae Density in Humans

Emerging evidence from a number of laboratories indicates that humans have the ability to identify fatty acids in the oral cavity, presumably via fatty acid receptors housed on taste cells. Previous research has shown that an individual&#39;s oral sensitivity to fatty acid, specifically oleic acid (C18:1) is associated with body mass index (BMI), dietary fat consumption, and the ability to identify fat in foods. We have developed a reliable and reproducible method to assess oral chemoreception of fatty acids, using a milk and C18:1 emulsion, together with an ascending forced choice triangle procedure. In parallel, a food matrix has been developed to assess an individual&#39;s ability to perceive fat, in addition to a simple method to assess fatty food liking. As an added measure tongue photography is used to assess papillae density, with higher density often being associated with increased taste sensitivity.

Oral chemoreception of fatty acids and the association with diet and fatty food preferences may enable the identification of mechanisms involved with the development of obesity and why dietary changes may be difficult for many individuals.

Mesure orale d&#39;acides gras seuils, Fat Perception, gras alimentaire Aimer, et Papilles densité chez les humains

Emerging evidence from a number of laboratories indicates that humans have the ability to identify fatty acids in the oral cavity, presumably via fatty ...