Unterstützt von der University of Kentucky, Department of Biology, Office of Undergraduate Studies and College of Arts &amp; Sciences.

1. Einführung Die jüngsten umfassenden Überblick über die Krebse Enddarm wurde in einer Dissertation von Dr. Barbara E. Musolf (2007, Georgia State University, Atlanta, Georgia, USA), die in erster Linie auf serotonerge Modulation und Innervation (Musolf et al., 2009 konzentriert eingehalten ). Krustentier hindguts wurden erstmals vor über 100 Jahren von Alexandrowicz, ein Pionier in der vergleichenden Anatomie (Alexandrowicz, 1909), der die verschiedenen Aspekte ihrer Innervation beschrieben untersucht. Forschung weiterhin im Laufe der Jahre, die Identifizierung der Art der Muskelschichten und Architektur, Bewältigung der Gesamtfunktion der Enddarm in Osmoregulation für das ganze Tier, und die Prüfung modulatorische Kontrolle über Enddarm Kontraktilität durch verschiedene Verbindungen (siehe Review von Musolf, 2007). Es ist interessant festzustellen, dass die anale Teil der Enddarm wirkt nicht nur auf Kot zu vertreiben, sondern auch für die Aufnahme der Wasser aus der Umgebung für die Osmoregulation. Diese Region des Darms kann nach vorne zu unterziehen oder Reverse Peristaltik abhängig von dem Tier braucht. Alexandrowicz (1909) identifizierten zwei Nervengeflechte innervieren die Krustentier Enddarm, eine innere und eine äußere Plexus Plexus, die sich später als reiche Quellen werden zur Identifizierung und Charakterisierung Neurotransmitter. In den 1950er Jahren Dr. Ernst Florey begann eine Reihe von pharmakologischen Studien über die Krebse Enddarm und gezeigt, dass Kontraktionen moduliert durch Acetylcholin und seine verwandten Verbindungen und auch von Adrenalin und Noradrenalin (Florey, 1954) sind. Florey, der Entdecker der eine hemmende Substanz bekannt als &quot;Factor-I&quot;, untersuchten die Auswirkungen dieser Substanz auf verschiedene Präparate, darunter die GI-System in Krebsen (Florey, 1961). Factor-I wurde später gezeigt, dass GABA werden. So spielte die Krebse Enddarm eine wichtige Rolle in den frühen Studien der synaptischen Hemmung. Nach der Entdeckung von GABA, waren andere vermeintliche Sender auch gezeigt, dass mit dem Enddarm Plexus in Verbindung gebracht werden und physiologischen Reaktionen zu entlocken. Solche Sender enthalten Dopamin (Elekes et al 1988;. Elofsson et al 1968.) Proctolin (RYLPG-OH;. Mercier et al 1997) zwei orcokinin Peptide (NFDEIDRSGFGFN und AFDEIDRSGFGFN; Bungart et al 1994;.. Dircksen et al 2000) , orcomyotropin (FDAFTTGFamide; Dircksen et al 2000.) und eine myosuppressin Peptid (Mercier et al 1997;... wahrscheinlich pQDLDHVFLRFamide, vgl. Stemmler et al 2007). Jede dieser Substanzen moduliert spontane Enddarm Kontraktionen, und alle außer GABA zu sein scheinen exzitatorischen. Der Enddarm reagiert auch auf Glutamat und Quisqualat (Jones, 1962;. Wrong et al 2003), aber eindeutige Beweise für glutamatergen Innervation wurde nicht berichtet. Zelluläre Botenstoffe, die die Auswirkungen der verschiedenen Sender vermitteln, sind noch weitgehend unerforscht, aber es gibt Beweise für die Beteiligung von cAMP in Dopamin Fähigkeit, Kontraktionen (Knotz &amp; Mercier, 1995) zu erhöhen. Obwohl der Krebs Enddarm Verträge spontan folgende Denervierung sind solche Kontraktionen in der Regel schwach und unorganisiert (Wales, 1982; Winlow &amp; Laverack, 1972a). Peristaltische Bewegung erfordert ein abgestimmtes Motorleistung aus dem zentralen Nervensystem, offenbar mit Ursprung in der letzten Abdominalganglion (Winlow &amp; Laverack, 1972a, b, c). In Krebse, ist die Motorleistung auf den Enddarm durch die 7 th abdominale Wurzel, die 75 Axone, deren Zellkörper in den letzten Abdominalganglion (Kondoh &amp; Hisada, 1986) lokalisiert enthält, durchgeführt. Zumindest einige der Peptide scheinen auf den Enddarm Plexus von Neuronen mit Ursprung in der letzten Abdominalganglion (Dircksen et al 2000..; Mercier et al 1991b; Siwicki &amp; Bishop, 1986) geliefert werden, aber Dopamin wird durch Neuronen in mehr geliefert vorderen Ganglien (Mercier et al. 1991a). Da Motorleistung durch das 7. Abdominal Wurzel notwendig ist für große, koordinierte Kontraktionen, ist es wahrscheinlich, dass einige oder alle der vermeintlichen Sender oben aufgeführten in irgendeiner Weise die Peristaltik beitragen. Ihre relative Beiträge sind jedoch nicht bekannt. Einige Einblicke kann durch die Untersuchung ihrer Auswirkungen auf die Ring-und Längsmuskeln getrennt (Mercier &amp; Lee, 2002) gewonnen werden. Neben der Steuerung der Bewegung der unverdauten Nahrung, erscheint das Nervengeflecht mit dem Krustentier Enddarm verbunden, um eine wichtige endokrine Funktion mit Häutung verbundenen spielen. Der Enddarm der Taschenkrebs, Carcinus maenas, enthält endokrinen Zellen, die Krebs hyperglycemic Hormon und die damit verbundenen Vorläuferpeptid Freisetzung während ecdysis (Webster et al. 2000), was auf eine Rolle in Wasseraufnahme und Schwellungen im Zusammenhang mit der Häutung. So beteiligt sich das Krustentier Enddarm in mehreren wichtigen physiologischen Prozessen. Dieser Bericht ist in erster Linie ein Lehrmittel für fortgeschrittene Schüler und Studenten in Physiologie Kurse, die in Experimenten teilnehmen. Die Bedeutung sowie die möglichen Mechanismus hinter, wie der Enddarm Verträge und Funktionen können von den Schülern angesprochen werden. Pharmakologische Wirkstoffe, Neurotransmitter und Neurohormone wird verwendet werden, und Dosis-Wirkungs-Kurven konstruiert werden, die die Schüler, wie zu erwerben und zu interpretieren, physiologische und pharmakologische Daten zu engagieren. Ein allgemeines Verständnis der Rezeptor-Funktion im Hinblick auf Agonisten und Antagonisten können auch erreicht werden. Die Schüler lernen auch, um Daten in grafischer Form zur statistischen Analyse zu präsentieren. Es ist sehr leicht zu zerlegen und aufzeichnen Kontraktionen aus der Krebse Enddarm. In der sezierten Vorbereitung, ist der Darm leicht an körperfremde Substanzen ausgesetzt. Die Veränderung in peristaltische Aktivität kann visuell oder mit einem Kraftaufnehmer, die auch überwachen kann die Kraft der Kontraktionen beobachtet werden. Aufgrund seiner Einfachheit und Zuverlässigkeit als Bioassay Vorbereitung ist die Krebse Enddarm noch sehr nützlich für die Untersuchung von vielen Fragestellungen über die Mechanismen der Peristaltik, Modulation der Motorleistung und der Muskelkontraktion und-Rezeptor-Funktion. Der Enddarm ist auch für die Prüfung Insektizide, crustaceancides und Schadstoffe, für spezifische Mechanismen der Aktionen nützlich. 2. Methoden 2,1) Materialien <ul><li> Flusskrebs </li><li> Krebse Kochsalzlösung </li><li> Dissektion Instrumente (Grob-und einer feinen Schere, grob &amp; feinen Pinzette) </li><li> Sylgard-Talsohle Petrischale </li><li> Stahl Sezieren Pins </li><li> Becher (gegenüber chemischen Lösungen halten) </li><li> Parafilm (zum Abdecken &amp; Mischen von Lösungen) </li></ul> 2,2) Dissection <ol><li> Crayfish (Procambarus clarkii) messen 6-10 cm in Körperlänge sollte auf Eis 5 bis 10 Minuten gegeben werden, um das Tier zu betäuben, bevor Dissektion beginnt. </li><li> Halten Sie den narkotisierten Krebse hinter den Klauen mit einer Hand. Schnell, aus der Augenhöhle in die Mitte des Kopfes auf beiden Seiten abgeschnitten, und dann enthaupten die Krebse (Anmerkung: das Blut aus der Vorbereitung wird klebrig sein, wenn es trocknet, so waschen Sie die Werkzeuge, wenn abgeschlossen). <img src="/files/ftp_upload/2324/2324fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1: Enthauptung von Flusskrebsen </li><li> Schneiden Sie die chelipeds und Laufbeinen. </li><li> Schneiden Sie den linken und rechten Heckflossen, nur Verlassen der Mitte Heckflosse (uropod). </li><li> Auf der Rückenseite des Krebses Schnitt ventral an der linken und rechten Seite des dorsalen Kutikula. <img src="/files/ftp_upload/2324/2324fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2: Entfernen von Dorsal Cuticle </li><li> Cut quer auf der Rückenseite der Kutikula, um sicherzustellen, dass der Schnitt flach, um Schäden an der GI verhindern Dann entfernen Sie den unteren Abschnitt der dorsalen Bauch-Kutikula. </li><li> Setzen Sie den sezierten Krebse in einen Sylgard gesäumten Gericht. </li><li> Pin die Krebse, die Schüssel an der Spitze der Heckflosse. Man kann mehrere Stifte auf beiden Seiten der GI als notwendig, um den Körper gedrückt. </li><li> Füllen Sie die Schale mit Flusskrebsen Kochsalzlösung für den GI Achten Sie darauf, immer wieder übergießen GI mit Kochsalzlösung mit einer Pipette. Saline ist eine modifizierte Van Harreveld-Lösung (1936), die mit 205 mM NaCl hergestellt wird, 5,3 mM KCl; 13,5 mm CaCl 2 · 2H 2 O, 2,45 mm MgCl 2 6H 2 O, 5 mM HEPES und auf pH 7,4 eingestellt. Die seziert Krebse sollte wie in Abbildung 3 dargestellt. <img src="/files/ftp_upload/2324/2324fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3: Dissected Flusskrebse mit GI intakt. </li></ol> 2,3) Experimente 2.3.1) Kontraktionen in der Tier- <ol><li> Haben Lösungen der zu testenden Verbindung bereit und bei der gleichen Temperatur wie die Bade-Kochsalzlösung. Am vielleicht nutzen individuelle Lösungen von Serotonin (100 nM, 1microM), Glutamat (1microM) und Dopamin (1microM) in Flusskrebse Kochsalzlösung als Ausgangspunkt zu testenden Substanzen hergestellt. </li><li> Lassen Sie den sezierten Krebse in die Krebse Lösung für ca. 10 Minuten sitzen, damit sie den Schock der Dissektion und Kochsalzlösung Belichtung einzustellen. Die langsame Peristaltik Kontraktionen aus dem Enddarm beginnen sollte, auftreten. </li><li> Sobald die Wehen beginnen, notieren Sie die Anzahl der Kontraktionen, die in 30 Sekunden (man beachte die Art der Kontraktionen, die auftreten, dh die Peristaltik Typ oder spastische, und die Richtung einer peristaltischen Wellen) auftreten. Tabelle 1: Die Kontraktionen in Crayfish Saline <table border="1"><tbody><tr><td> Anzahl der Kontraktionen </td><td> Art der Kontraktionen </td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table></li><li> Mit Hilfe eines piPette, entfernen Sie die Salzlösung in den Hohlraum der Krebse ist ausgesetzt Bauch, und wenden Salzlösung, die die Substanz direkt auf den Enddarm untersucht werden. </li><li> Unmittelbar nach Zugabe der Lösung, notieren Sie die Anzahl der Kontraktionen, die nach 30 Sekunden auftreten und notieren Sie die Art der Kontraktionen, (dh peristaltische oder spastische) auftreten. Tabelle 2: Die Kontraktionen mit der Exposition gegenüber Verbindungen <table border="1"><tbody><tr><td> Compound getestet </td><td> Konzentration </td><td> Anzahl der Kontraktionen </td><td> Art der Kontraktionen </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table></li><li> Unmittelbar nach der Aufnahme die Reaktion auf die Testsubstanz, spülen Sie die GI mehrmals mit normalen Krebse Kochsalzlösung. Lassen Sie die Vorbereitung für 5 Minuten stehen lassen, während Spülen etwa alle 30 Sekunden mit Flusskrebsen Kochsalzlösung. </li><li> Mit einer Pipette Ort einige Kochsalzlösung mit der nächsten Verbindung zu prüfende oder ein abwechslungsreiches Konzentration der letzten Substanz getestet direkt auf den Enddarm. Am besten ist es mit einer geringeren Konzentration und Arbeit seinen Weg zu höheren Konzentrationen zu starten. </li><li> Unmittelbar nach Zugabe von jedem neuen Stoff oder jede neue Konzentration, notieren Sie die Anzahl der Kontraktionen, die nach 30 Sekunden auftreten und notieren Sie die Art der Kontraktionen. </li></ol> 2.3.2) Recording Kräfte der Kontraktion in herausgeschnitten Vorbereitungen <img src="/files/ftp_upload/2324/2324fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4: Setup <ol><li> Bringen Sie den Schwinger an der Brücke pod. </li><li> Bringen Sie die Brücke pod auf die PowerLab 26T. </li><li> Bringen Sie die PowerLab 26T an den USB-Anschluss am Computer. </li><li> Öffnen LabChart7, indem Sie auf den labchart7 Symbol auf dem Desktop. <ul><li> Die LabChart Welcome Center-Box öffnet sich. Schließen Sie es. </li><li> Klicken Sie auf Setup </li><li> Klicken Sie auf Kanaleinstellungen. Ändern Sie die Anzahl der Kanäle auf 1 (unten Kasten links) drücken OK. </li><li> An der oberen linken Ecke des Diagramms stellen Sie den Zyklen pro Sekunde bis etwa 2k. Setzen Sie den Volt (y-Achse) bis etwa 500 oder 200 mV. </li><li> Klicken Sie auf Kanal 1 auf der rechten Seite des Diagramms. Klicken Sie auf Eingang Verstärker. Stellen Sie sicher, dass die Einstellungen: single-ended, AC-gekoppelt, und (invertiert das Signal bei Bedarf), Invertzucker und Anti-Aliasing, werden überprüft. </li><li> Um die Aufnahme zu starten drücken beginnen. </li></ul></li><li> Pick-up der Vorbereitung und schneiden Sie die GI-Trakt an der Nahtstelle zwischen dem Brustkorb und den Bauch. Dann vorsichtig um die telson Teil der Schwanz abgeschnitten. Nehmen Sie die GI-Trakt aus dem seziert Krebse und legen Sie sie in die Sylgard Gericht. Es ist ein Blutgefäß, das entlang der Dorsalseite des GI-Trakt führt. Ziehen Sie diese von der GI-Trakt. Füllen Sie frische Krebse Kochsalzlösung auf die Vorbereitung. </li><li> Legen Sie die Kraftaufnehmer in die Klemme in der Nähe des seziert Krebse. </li><li> Haken Sie die Kraftaufnehmer in die Krebse GI wie in Abbildung 5 dargestellt. <img src="/files/ftp_upload/2324/2324fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5: Isolierte Enddarm des Krebses in Kochsalzlösung an den Haken des Kraftaufnehmers </li><li> Warten Sie, bis die GI beginnt zu kontrahieren, und drücken Sie Start auf dem LabChart7. </li><li> Lassen Sie das Programm für etwa 20 Sekunden laufen. Drücken Sie &quot;Stop&quot;, und fügen Sie einen Kommentar gekennzeichnet, &quot;Saline only&quot;. Füllen Sie das Tabelle 4. Tabelle 4: Die Kontraktionen mit der Verbindung von Interesse <table border="1"><tbody><tr><td> Anzahl der Kontraktionen </td><td> Amplitude der Kontraktionen (mV) </td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table></li><li> Fügen Sie die Test-Verbindungen von Interesse, und sofort push &quot;start&quot; auf dem LabChart7. </li><li> Lassen Sie das Programm für etwa 20 Sekunden laufen. Drücken Sie &quot;Stop&quot; und fügen Sie einen Kommentar direkt im Diagramm-Datei, welche Substanz zugegeben und die Konzentration. Füllen Sie das untenstehende Tabelle. Tabelle 5: Die Kontraktionen mit _________ Verbindung <table border="1"><tbody><tr><td> Anzahl der Kontraktionen </td><td> Amplitude der Kontraktionen (mV) </td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table></li><li> Spülen Sie das Präparat mit Flusskrebsen Kochsalzlösung mit einer Pipette. </li><li> Fügen Sie andere Stoffe oder verschiedenen Konzentrationen in einer ähnlichen Weise. Unmittelbar push &quot;start&quot; auf dem LabChart7. </li><li> Lassen Sie das Programm für etwa 20 Sekunden laufen. Drücken Sie &quot;Stop&quot;, und fügen Sie einen Kommentar und Label direkt auf den Diagramm-Datei unter Angabe der compound verwendet und die Konzentration. </li></ol> 3. Data Analysis <ol><li> Von 2.3.1 des Experiments, Grafik die Anzahl der Kontraktionen aus jeder Lösung (Kochsalzlösung, Serotonin, Glutamat) gegen die Zeit. Erklären Sie keine Trends. </li><li> Von 2.3.2 des Experiments, Grafik die Anzahl der Kontraktionen aus jeder Lösung (Kochsalzlösung, Serotonin, Glutamat) vs die Amplitude der Kontraktionen in mV. Erklären Sie keine Trends. </li></ol> 3,1) messen die Geschwindigkeit und Kraft der Kontraktionen Zur Index der Preise von Kontraktionen auf die Zeit vom Beginn an einer Biegung an den Anfang des nächsten Taktes oder zählen die insgesamt Ausschläge über ein oder zwei Minuten. Die Werte können dann in Form von Kontraktionen pro Minute oder pro Sekunde, je nachdem wie schnell sie auftreten gestellt werden. Zur Index die Kraft der Kontraktionen ein relatives Maß verwendet werden, um unterschiedliche Bedingungen zu vergleichen. Auf die gespeicherte Datei kann man mit der Markierung &quot;M&quot; und bewegen Sie auf die Grundlinie. Dann nutzen Sie den Cursor und auf den Gipfel der Ablenkung bewegen und nehmen den Wert in der oberen rechten Ecke des Bildschirms als Delta-Wert (die Differenz von M bis zum Gipfel) notiert. Beachten Sie den Cursor muss stationär gehalten für das Maß der Veränderung werden. Dann bewegen Sie die M auf der nächsten Welle Form von Zinsen und wiederholen Sie die Messung.

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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocrine+cells+in+the+gut+of+the+shore+crab+Carcinus+maenas+immunoreactive+to+crustacean+hyperglycaemic+hormone+and+its+precursor-related+peptide.">Endocrine cells in the gut of the shore crab Carcinus maenas immunoreactive to crustacean hyperglycaemic hormone and its precursor-related peptide.</a> J. Exp. Biol. 300, 193-205 (2000).</li><li>Winlow, W., Laverack, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+control+of+hindgut+motility+in+the+lobster+Homarus+gammarus+(L.).+1.+Analysis+of+hindgut+movements+and+receptor+activity.">The control of hindgut motility in the lobster Homarus gammarus (L.). 1. Analysis of hindgut movements and receptor activity.</a> Mar. Behav. Physiol. 1, 1-28 (1972).</li><li>Winlow, W., Laverack, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+control+of+hindgut+motility+in+the+lobster+Homarus+gammarus+(L.).+2.+Motor+output.">The control of hindgut motility in the lobster Homarus gammarus (L.). 2. Motor output.</a> Mar. Behav. Physiol. 1, 29-47 (1972).</li><li>Winlow, W., Laverack, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+control+of+hindgut+motility+in+the+lobster+Homarus+gammarus+(L.).+3.+Structure+of+the+sixth+abdominal+ganglion+(6+A.G.)+and+associated+ablation+and+microelectrode+studies.">The control of hindgut motility in the lobster Homarus gammarus (L.). 3. Structure of the sixth abdominal ganglion (6 A.G.) and associated ablation and microelectrode studies.</a> Mar. Behav. Physiol. 1, 93-121 (1972).</li><li>Wrong, A. D., Sammahin, M., Richardson, R., Mercier, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+properties+of+glutamate+receptors+associated+with+the+crayfish+hindgut.">Pharmacological properties of glutamate receptors associated with the crayfish hindgut.</a> J. Comp. Physiol. 189, 371-378 (2003).</li></ol>

Die Angaben in den zugehörigen Film und Text versehen beschreiben die wichtigsten Schritte, um die Aktivität in den Enddarm des Krebses in situ sowie in vitro aufzunehmen. Ein Ziel unseres Berichts ist es, das Bewusstsein für das Potenzial dieses Präparats Anstieg der Studierendenzahlen-run investigative Labors, die grundlegende Konzepte in Physiologie und Pharmakologie zu lehren. Diese Zubereitungen können verwendet werden, um eine Reihe von experimentellen Fragen, die zu einem besseren Verständnis der physiologischen Funktionen der Enddarm führt zu untersuchen. Die zugrunde liegenden Mechanismen Regulierung der peristaltischen Wellen und ihre Umkehrung sind noch nicht bekannt. Die Mechanismen, die für eine höhere Kontrolle über den gesamten GI-Trakt sind auch nicht vollständig verstanden. Die Frage, wie höheren Zentren integrieren ihre Tätigkeit mit dem autonomen Ausgang, der direkt den GI-System bleibt eine offene Fläche von Ermittlungen (Shuranova et al., 2006). Darüber hinaus haben die osmoregulatorische Fähigkeiten des Krustentier Enddarm und die Funktionen der Osmoregulation während der Mauser und Umweltbelastungen nicht vollständig geklärt. Es gibt immer noch viele Fragen warten auf Antworten in dieser Zubereitung.

<ol><li> Crayfish (Procambarus clarkii). Atchafalaya Biological Supply Co., Raceland, LA., USA. </li><li> Standard-Krebse Kochsalzlösung: Geändert von Van Harreveld-Lösung (1936). (In mm) 205 NaCl, 5,3 KCl, 13,5 CaCl 2 · 2H 2 O, 2,45 MgCl 2 6H 2 O, 5 HEPES und auf pH 7,4 eingestellt. Serotonin, Glutamat und Dopamin sind in Flusskrebse Kochsalzlösung. Alle Chemikalien sind von Sigma Chemical Company (St. Louis, MO) erhalten. </li><li> Dissection-Tools: Fine Nr. 5 Pinzette, feine Schere, Messer Messerhalter, # 26002-20 Insektennadeln (alle von Fine Science Tools (USA), Inc., 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139 erhalten) </li><li> Sylgard-Talsohle Petrischale </li><li> Becher (gegenüber chemischen Lösungen halten) </li><li> Elektrische Signale werden auf Linie zu einem PowerLab 26T-Schnittstelle an einen Computer (ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA) aufgezeichnet. Wir verwenden Standard-Software von ADInstruments namens Chart-oder Scope. <li> Brücke pod für den Kraftaufnehmer (unterschiedliche Brücke Hülsen sind für verschiedene Arten von Kraftaufnehmern erforderlich). </li><li> MLT0402 (2 Gramm) Kraftaufnehmer ist das Forschungs-Klasse wie im Video gezeigt. MLT 0210 / D (10 mg-25 Gramm) und der MLT 500 / A (0-500g) sind die pädagogischen Qualitäten Wandler (ADInstruments). </li></ol>

physiological experimentation with the crayfish hindgut: a student laboratory exercise

Der Zweck des Berichts ist es, Dissektion Techniken zur Herstellung der Krebse Enddarm zu beschreiben und zu demonstrieren, wie die physiologischen Aufnahmen mit einem Kraftaufnehmer machen, um die Stärke der Kontraktion zu überwachen. Darüber hinaus zeigen wir, wie man visuell überwachen peristaltische Aktivität, die als Bioassay für verschiedene Peptide, biogene Amine und Neurotransmitter verwendet werden können. Dieses Präparat ist zugänglich für Schülerlabore in Physiologie und für den Nachweis der pharmakologischen Konzepte für Studenten. Dieses Präparat wird seit über 100 Jahren, und es bietet immer noch soviel wie ein Modell für die Untersuchung der Entstehung und Regulation der Peristaltik Rhythmen und für die Beschreibung der zugrunde liegenden Mechanismen ihrer Modulation. Die pharmakologischen Untersuchungen und Rezeptor-Sub-Typisierung, die vor über 50 Jahren auf dem Enddarm gestartet wurden noch dazu beitragen, Forschung heute. Diese robuste Vorbereitung ist gut an Ausbildung von Studenten in Physiologie und Pharmakologie geeignet.

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Physiological Experimentation with the Crayfish Hindgut: A Student Laboratory Exercise

In diesem Bericht zeigen wir Techniken, die verwendet werden, um die Biologie des Krebses Enddarm untersuchen lassen. Wir zeigen, wie ein Krebs Bauch sezieren und untersuchen die damit verbundenen Anatomie, Physiologie und Modulation der Aktivität. Die peristaltische Aktivität und Stärke der Kontraktionen werden mit einem Kraftaufnehmer.

Physiologische Experimente mit den Crayfish Enddarm: Ein Schülerlabor Übung

The purpose of the report is to describe dissection techniques for preparing the crayfish hindgut and to demonstrate how to make physiological recordings ...

physiological-experimentation-with-crayfish-hindgut-student

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.7K Aufrufe.  University of Kentucky. In diesem Bericht zeigen wir Techniken, die verwendet werden, um die Biologie des Krebses Enddarm untersuchen lassen. Wir zeigen, wie ein Krebs Bauch sezieren und untersuchen die damit verbundenen Anatomie, Physiologie und Modulation der Aktivität. Die peristaltische Aktivität und Stärke der Kontraktionen werden mit einem Kraftaufnehmer.

Serie: Physiological Experimentation with the Crayfish Hindgut: A Student Laboratory Exercise

Recording Behavioral Responses to Reflection in Crayfish

Social behavior depends on sensory input from the visual, mechanical and olfactory systems. One important issue concerns the relative roles of each sensory modality in guiding behavior. The role of visual inputs has been examined by isolating visual stimuli from mechanical and chemosensory stimuli. In some studies (Bruski &amp; Dunham, 1987: Delgado-Morales et al., 2004) visual inputs have been removed with blindfolds or low light intensity, and effects of remaining sensory modalities have been elucidated. An alternative approach is to study the effects of visual inputs in the absence of any appropriate mechanical and chemosensory cues. This approach aims to identify the exclusive role of visual inputs. 
We have used two methods to provide visual stimuli to crayfish without providing chemical and mechanical cues. In one method, crayfish are videotaped in an aquarium where half of the walls are covered in mirrors to provide a reflective environment, and the other half are covered in a non-reflective (matte finish) plastic. This gives the crayfish a choice between reflective and non-reflective environments. The reflective environment provides visual cues in the form of reflected images of the crayfish as it moves throughout half of the tank; these visual cues are missing from the non-reflective half of the tank. An alternative method is to videotape the behavior of crayfish in an aquarium separated by a smaller chamber at each end, with a crayfish in one small chamber providing visual cues and an inert object in the opposite small chamber providing visual input from a non-moving, non-crayfish source. 
Our published results indicate that responses of crayfish to the reflective environment depend on socialization and dominance rank. Socialized crayfish spent more time in the reflective environment and exhibited certain behaviors more frequently there than in the non-reflective environment; isolated crayfish showed no such differences. Crayfish that were housed in same-sex pairs developed a social rank of either dominant or subordinate. Responses to reflection differed between dominant and subordinate crayfish (May &amp; Mercier, 2006; May &amp; Mercier, 2007). Dominant crayfish spent more time on the reflective side, entered reflective corners more frequently and spent more time in reflective corners compared to the non-reflective side. Subordinate crayfish walked in reverse more often on the reflective side than on the non-reflective side. Preliminary data suggest similar effects from visual cues provided by a crayfish in a small adjoining chamber (May et al., 2008).

We have developed two methods for studying effects of visual cues on behavior in the absence of tactile and chemical cues. One method involves videotaping responses of crayfish to reflective walls in an aquarium; the other examines effects of visual inputs provided by a live crayfish behind a transparent partition.

Recording Verhaltensreaktionen auf Reflection in Crayfish

Social behavior depends on sensory input from the visual, mechanical and olfactory systems.  One important issue concerns the relative roles of each ...

Forschung

Neurowissenschaften

A Procedure for Studying the Footshock-Induced Reinstatement of Cocaine Seeking in Laboratory Rats

The most insidious aspect of drug addiction is the high propensity for relapse. Animal models of relapse, known as reinstatement procedures, have been used extensively to study the neurobiology and phenomenology of relapse to drug use. Although procedural variations have emerged over the past several decades, the most conventional reinstatement procedures are based on the drug self-administration (SA) model. In this model, an animal is trained to perform an operant response to obtain drug. Subsequently, the behavior is extinguished by withholding response-contingent reinforcement. Reinstatement of drug seeking is then triggered by a discrete event, such as an injection of the training drug, re-exposure to drug-associated cues, or exposure to a stressor 1.
Reinstatement procedures were originally developed to study the ability of acute non-contingent exposure to the training drug to reinstate drug seeking in rats and monkeys 1, 2. Reinstatement procedures have since been modified to study the role of environmental stimuli, including drug-associated cues and exposure to various forms of stress, in relapse to drug seeking 1, 3, 4.
Over the past 15 years, a major focus of the reinstatement literature has been on the role of stress in drug relapse. One of the most commonly used forms of stress for studying this relationship is acute exposures to mild, intermittent, electric footshocks. The ability of footshock stress to induce reinstatement of drug seeking was originally demonstrated by Shaham and colleagues (1995) in rats with a history of intravenous heroin SA5. Subsequently, the effect was generalized to rats with histories of intravenous cocaine, methamphetamine, and nicotine SA, as well as oral ethanol SA 3, 6.
Although footshock-induced reinstatement of drug seeking can be achieved reliably and robustly, it is an effect that tends to be sensitive to certain parametrical variables. These include the arrangement of extinction and reinstatement test sessions, the intensity and duration of footshock stress, and the presence of drug-associated cues during extinction and testing for reinstatement. Here we present a protocol for footshock-induced reinstatement of cocaine seeking that we have used with consistent success to study the relationship between stress and cocaine seeking.

Animal models of relapse, known as reinstatement procedures, have been used extensively to study the role of stress in relapse to drug seeking. Here, we report on a method for inducing the reinstatement of cocaine seeking in laboratory rats via acute exposures to mild, intermittent electric footshock.

Ein Verfahren zur Untersuchung der Fußschock-Induced Wiedereinsetzung von Kokain suche in Laborratten

The most insidious aspect of drug addiction is the high propensity for relapse.  Animal models of relapse, known as reinstatement procedures, have been ...

Physiological Recordings of High and Low Output NMJs on the Crayfish Leg Extensor Muscle

We explain in detail how to expose and conduct electrophysiological recordings of synaptic responses for high (phasic) and low (tonic) output motor neurons innervating the extensor muscle in the walking leg of a crayfish. Distinct differences are present in the physiology and morphology of the phasic and tonic nerve terminals. The tonic axon contains many more mitochondria, enabling it to take a vital stain more intensely than the phasic axon. The tonic terminals have varicosities, and the phasic terminal is filiform. The tonic terminals are low in synaptic efficacy but show dramatic facilitated responses. In contrast, the phasic terminals are high in quantal efficacy but show synaptic depression with high frequency stimulation. The quantal output is measured with a focal macropatch electrode placed directly over the visualized nerve terminals. Both phasic and tonic terminals innervate the same muscle fibers, which suggests that inherent differences in the neurons, rather than differential retrograde feedback from the muscle, account for the morphological and physiological differentiation.

This article demonstrates how to conduct electrophysiological recordings of synaptic responses on the extensor muscle in the walking leg of a crayfish and how the nerve terminals are visualized to show the gross morphological differences of high- and low-output nerve terminals.

Physiologische Aufnahmen von High-und Low Output NMJs auf der Crayfish Leg Streckmuskel

We explain in detail how to expose and conduct electrophysiological recordings of synaptic responses for high (phasic) and low (tonic) output motor ...

Membrane Potentials, Synaptic Responses, Neuronal Circuitry, Neuromodulation and Muscle Histology Using the Crayfish: Student Laboratory Exercises

The purpose of this report is to help develop an understanding of the effects caused by ion gradients across a biological membrane. Two aspects that influence a cell's membrane potential and which we address in these experiments are: (1) Ion concentration of K+ on the outside of the membrane, and (2) the permeability of the membrane to specific ions. The crayfish abdominal extensor muscles are in groupings with some being tonic (slow) and others phasic (fast) in their biochemical and physiological phenotypes, as well as in their structure; the motor neurons that innervate these muscles are correspondingly different in functional characteristics. We use these muscles as well as the superficial, tonic abdominal flexor muscle to demonstrate properties in synaptic transmission. In addition, we introduce a sensory-CNS-motor neuron-muscle circuit to demonstrate the effect of cuticular sensory stimulation as well as the influence of neuromodulators on certain aspects of the circuit. With the techniques obtained in this exercise, one can begin to answer many questions remaining in other experimental preparations as well as in physiological applications related to medicine and health. We have demonstrated the usefulness of model invertebrate preparations to address fundamental questions pertinent to all animals.

The experiments demonstrate an easy approach for students to gain experience in examining muscle structure, synaptic responses, the effects of ion gradients and permeability on membrane potentials. Also, a sensory-CNS-motor-muscle circuit is presented to show a means to test effects of compounds on a neuronal circuit.

Membranpotentiale, Synaptic Responses, neuronalen, Neuromodulation und Muscle Histologie Mit dem Crayfish: Schülerlabor Übungen

The purpose of this report is to help develop an understanding of the effects caused by ion gradients across a biological membrane. Two aspects that ...

Muscle Receptor Organs in the Crayfish Abdomen: A Student Laboratory Exercise in Proprioception

The primary purpose of this experiment is to demonstrate primary sensory neurons conveying information of joint movements and positions as proprioceptive information for an animal. An additional objective of this experiment is to learn anatomy of the preparation by staining, dissection and viewing of neurons and sensory structures under a dissecting microscope. This is performed by using basic neurophysiological equipment to record the electrical activity from a joint receptor organ and staining techniques. The muscle receptor organ (MRO) system in the crayfish is analogous to the intrafusal muscle spindle in mammals, which aids in serving as a comparative model that is more readily accessible for electrophysiological recordings. In addition, these are identifiable sensory neurons among preparations. The preparation is viable in a minimal saline for hours which is amenable for student laboratory exercises. The MRO is also susceptible to neuromodulation which encourages intriguing questions in the sites of modulatory action and integration of dynamic signals of movements and static position along with a gain that can be changed in the system.

The primary purpose of this experiment is to understand how primary sensory neurons convey information of joint movements and positions as proprioceptive information for an animal. An additional objective of this report is present the anatomy of the preparation by dissection and viewing of neurons under a dissecting microscope.

Muscle-Rezeptor-Organe in der Crayfish Abdomen: Ein Schülerlabor Übung in Propriozeption

The primary purpose of this experiment is to demonstrate primary sensory neurons conveying information of joint movements and positions as proprioceptive ...

VisualEyes: A Modular Software System for Oculomotor Experimentation

Eye movement studies have provided a strong foundation forming an understanding of how the brain acquires visual information in both the normal and dysfunctional brain.1 However, development of a platform to stimulate and store eye movements can require substantial programming, time and costs. Many systems do not offer the flexibility to program numerous stimuli for a variety of experimental needs. However, the VisualEyes System has a flexible architecture, allowing the operator to choose any background and foreground stimulus, program one or two screens for tandem or opposing eye movements and stimulate the left and right eye independently. This system can significantly reduce the programming development time needed to conduct an oculomotor study. The VisualEyes System will be discussed in three parts: 1) the oculomotor recording device to acquire eye movement responses, 2) the VisualEyes software written in LabView, to generate an array of stimuli and store responses as text files and 3) offline data analysis. Eye movements can be recorded by several types of instrumentation such as: a limbus tracking system, a sclera search coil, or a video image system. Typical eye movement stimuli such as saccadic steps, vergent ramps and vergent steps with the corresponding responses will be shown. In this video report, we demonstrate the flexibility of a system to create numerous visual stimuli and record eye movements that can be utilized by basic scientists and clinicians to study healthy as well as clinical populations.

Neural control and cognitive processes can be studied through eye movements. The VisualEyes software allows an operator to program stimuli on two computer screens independently using a simple, custom scripting language. The system can stimulate tandem eye movements (saccades and smooth pursuit) or opposing eye movements (vergence) or any combination.

Visualeyes: ein modulares Softwaresystem für oculomotorius Experimentieren

Eye movement studies have provided a strong foundation forming an understanding of how the brain acquires visual information in both the normal and ...

Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex behaviors such as food choice, predator, conspecific and mate recognition and other socially relevant cues. Olfactory receptor neurons (ORNs) are located in the dorsal part of the nasal cavity embedded in the olfactory epithelium. These bipolar neurons send an axon to the olfactory bulb (see Fig. 1, Reisert &amp; Zhao1, originally published in the Journal of General Physiology) and extend a single dendrite to the epithelial border from where cilia radiate into the mucus that covers the olfactory epithelium. The cilia contain the signal transduction machinery that ultimately leads to excitatory current influx through the ciliary transduction channels, a cyclic nucleotide-gated (CNG) channel and a Ca2+-activated Cl- channel (Fig. 1). The ensuing depolarization triggers action potential generation at the cell body2-4.
In this video we describe the use of the "suction pipette technique" to record odorant-induced responses from ORNs. This method was originally developed to record from rod photoreceptors5 and a variant of this method can be found at jove.com modified to record from mouse cone photoreceptors6. The suction pipette technique was later adapted to also record from ORNs7,8. Briefly, following dissociation of the olfactory epithelium and cell isolation, the entire cell body of an ORN is sucked into the tip of a recording pipette. The dendrite and the cilia remain exposed to the bath solution and thus accessible to solution changes to enable e.g. odorant or pharmacological blocker application. In this configuration, no access to the intracellular environment is gained (no whole-cell voltage clamp) and the intracellular voltage remains free to vary. This allows the simultaneous recording of the slow receptor current that originates at the cilia and fast action potentials fired by the cell body9. The difference in kinetics between these two signals allows them to be separated using different filter settings. This technique can be used on any wild type or knockout mouse or to record selectively from ORNs that also express GFP to label specific subsets of ORNs, e.g. expressing a given odorant receptor or ion channel.

Olfactory receptor neurons (ORNs) convert odor signals first into a receptor current that in turn triggers action potentials that are conveyed to second order neurons in the olfactory bulb. Here we describe the suction pipette technique to record simultaneously the odorant-induced receptor current and action potentials from mouse ORNs.

Odorant-induzierten Reaktionen aus olfaktorischen Rezeptor-Neuronen mit der Saugpipette Technik aufgenommen

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex ...

Proprioception and Tension Receptors in Crab Limbs: Student Laboratory Exercises

The primary purpose of these procedures is to demonstrate for teaching and research purposes how to record the activity of living primary sensory neurons responsible for proprioception as they are detecting joint position and movement, and muscle tension. Electrical activity from crustacean proprioceptors and tension receptors is recorded by basic neurophysiological instrumentation, and a transducer is used to simultaneously measure force that is generated by stimulating a motor nerve. In addition, we demonstrate how to stain the neurons for a quick assessment of their anatomical arrangement or for permanent fixation. Staining reveals anatomical organization that is representative of chordotonal organs in most crustaceans. Comparing the tension nerve responses to the proprioceptive responses is an effective teaching tool in determining how these sensory neurons are defined functionally and how the anatomy is correlated to the function. Three staining techniques are presented allowing researchers and instructors to choose a method that is ideal for their laboratory.

Physiological and anatomical techniques are demonstrated to address function and structure for joint proprioceptors and muscle tension receptors in crustacean walking limbs.

Propriozeption und Spannungsrezeptoren in Crab Gliedmassen: Schülerlabor Übungen

The primary purpose of these procedures is to demonstrate for teaching and research purposes how to record the activity of living primary sensory neurons ...

Measuring Oral Fatty Acid Thresholds, Fat Perception, Fatty Food Liking, and Papillae Density in Humans

Emerging evidence from a number of laboratories indicates that humans have the ability to identify fatty acids in the oral cavity, presumably via fatty acid receptors housed on taste cells. Previous research has shown that an individual&#39;s oral sensitivity to fatty acid, specifically oleic acid (C18:1) is associated with body mass index (BMI), dietary fat consumption, and the ability to identify fat in foods. We have developed a reliable and reproducible method to assess oral chemoreception of fatty acids, using a milk and C18:1 emulsion, together with an ascending forced choice triangle procedure. In parallel, a food matrix has been developed to assess an individual&#39;s ability to perceive fat, in addition to a simple method to assess fatty food liking. As an added measure tongue photography is used to assess papillae density, with higher density often being associated with increased taste sensitivity.

Oral chemoreception of fatty acids and the association with diet and fatty food preferences may enable the identification of mechanisms involved with the development of obesity and why dietary changes may be difficult for many individuals.

Mess Oral-Fettsäure-Schwellenwerte, Fett Wahrnehmung, Fatty Essen gefallen, und Papillen Dichte in Humans

Emerging evidence from a number of laboratories indicates that humans have the ability to identify fatty acids in the oral cavity, presumably via fatty ...

The Swimmeret System of Crayfish: A Practical Guide for the Dissection of the Nerve Cord and Extracellular Recordings of the Motor Pattern

Here we demonstrate the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. The preparation comprises the last two thoracic ganglia (T4, T5) and the chain of abdominal ganglia (A1 to A6). This chain of ganglia includes the part of the central nervous system (CNS) that drives coordinated locomotion of the pleopods (swimmerets): the swimmeret system. It is known for over five decades that in crayfish each swimmeret is driven by its own independent pattern generating kernel that generates rhythmic alternating activity 1-3. The motor neurons innervating the musculature of each swimmeret comprise two anatomically and functionally distinct populations 4. One is responsible for the retraction (power stroke, PS) of the swimmeret. The other drives the protraction (return stroke, RS) of the swimmeret. Motor neurons of the swimmeret system are able to produce spontaneously a fictive motor pattern, which is identical to the pattern recorded in vivo 1.
The aim of this report is to introduce an interesting and convenient model system for studying rhythm generating networks and coordination of independent microcircuits for students&#8217; practical laboratory courses. The protocol provided includes step-by-step instructions for the dissection of the crayfish&#8217;s abdominal nerve cord, pinning of the isolated chain of ganglia, desheathing the ganglia and recording the swimmerets fictive motor pattern extracellularly from the isolated nervous system.
Additionally, we can monitor the activity of swimmeret neurons recorded intracellularly from dendrites. Here we also describe briefly these techniques and provide some examples. Furthermore, the morphology of swimmeret neurons can be assessed using various staining techniques. Here we provide examples of intracellular (by iontophoresis) dye filled neurons and backfills of pools of swimmeret motor neurons. In our lab we use this preparation to study basic functions of fictive locomotion, the effect of sensory feedback on the activity of the CNS, and coordination between microcircuits on a cellular level.

Here we describe the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. We also demonstrate an electrophysiological technique to record fictive locomotion from swimmeret motor neurons.

Die swimmeret System der Crayfish: Ein praktischer Leitfaden für die Dissektion der Nervenstrang und extrazellulären Recordings der Motor Pattern

Here we demonstrate the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. The preparation comprises the last two thoracic ganglia (T4, T5) and the chain of ...