Les auteurs tiennent à remercier le Dr Steve Withers et Hong-Ming Chen pour fournir des DNP-cellobioside substrat.

Avant de commencer ce protocole, vous aurez besoin de votre banque métagénomique stockées dans un format de 384 plaque de bien. Dans notre étude, nous avons utilisé le vecteur pCC1 exemplaire de contrôle fosmide en combinaison avec le phage T1 résistant TransforMax EPI300-T1 R E. cellules coli comme hôte bibliothèque et stockées dans nos assiettes à -80 ° C 11. 1. La réplication des plaques banque métagénomique <ol><li> Décongeler les plaques contenant votre bibliothèque à 37 ° C pendant environ 20 minutes, ou jusqu&#39;à ce que tous les puits sont décongelés. </li><li> Utilisez la fonction de la lumière UV sur la stérilisation qPix2 pour stériliser le robot pendant 15 minutes. </li><li> Préparer le bouillon LB avec chloramphénicol à une concentration finale de 12.5ug/mL et arabinose au 100ug/mL dans un flacon de réactif 500 ml. Chaque plaque va utiliser environ 20 ml, ainsi que faire un 50mL supplémentaires pour permettre volume mort. </li><li> Mettre en place l&#39;qFill3 que les instructions du fabricant avec la bouteille des médias attachés à la tubulure par l&#39;intermédiaire du tube stérile. Il programme pour le montant approprié des médias, et le mettre pour remplir un volume 45uL dans chaque puits. </li><li> Purger l&#39;air du tube et le collecteur à l&#39;aide de la fonction de purge du robot jusqu&#39;à ce média est visible provenant de chaque broche du collecteur. </li><li> Remplissez le nombre désiré de plaques avec les médias LB utilisant le qFill3. Chaque plaque dure environ 20 secondes pour remplir. </li><li> Charger les plaques de bibliothèque et les plaques de frais dans les zones appropriées du robot qPix2. Remplissez les bains de nettoyage avec les réactifs appropriés; 2% Micro90 dans le bain à l&#39;arrière, autoclavés eau distillée dans la salle de bain moyenne, 80% d&#39;éthanol dans le bain avant. </li><li> Utilisez la fonction &quot;Réplication&quot; programme de la qPix2. Dans le logiciel, sélectionnez la tête appropriée, le nombre et les types de plaques de source et de destination des plaques. Également mis en place la tête pour nettoyer entre les réplications, habituellement 6 cycles dans chaque salle de bain est suffisant. Capacité de la machine est de 10 plaques à la fois, et cela prend environ 15 minutes pour se répliquer eux tous avec une tête de 384 broches (ou environ 50 minutes avec une tête de 96 broches). Note: Il ya une option &quot;Incorporer Source&quot; ou &quot;Stir Destination&quot;. Il est recommandé de ne pas utiliser ces options comme des problèmes ont déjà eu lieu avec nos robots de les utiliser. </li><li> Une fois les plaques sont répliqués, poussent les plaques à 37 ° C pendant 24 heures dans une boîte de l&#39;humidité. Parce que nous sommes induisant un nombre élevé de copies du fosmide avec addition d&#39;arabinose, les clones ont tendance à croître plus lentement que les non-induite clones. Retour des plaques bibliothèque à -80 ° C. Remarque: Incubation dans une boîte de l&#39;humidité assure l&#39;évaporation des médias ne se produit pas dans les puits sur le bord des plaques, en gardant un environnement uniforme pour tous les puits. </li><li> Nettoyer le robot qFill3 d&#39;abord qu&#39;il purge avec de l&#39;eau (~ 50 ml) puis 80% d&#39;éthanol (~ 50 ml). Démonter les composants, et nettoyer et autoclaver la bouteille, couvercle, et le tube enveloppé dans du papier aluminium. </li></ol> 2. Mesurer la croissance de E. Clones coli <ol><li> Retirer des plaques de 37 ° C incubateur. Retirer et réserver les couvercles et les plaques de placer sur la plate-forme de chargement fourni avec le magazine l&#39;RapidStak, jusqu&#39;à un maximum de 25 plaques. Remarque: La plaque au bas de la pile sera la première à être lu. Assurez-vous de garder une trace de l&#39;ordre des planches, comme le logiciel n&#39;enregistre pas présent. </li><li> Retirer un magazine de la Stak rapide, s&#39;assurer qu&#39;elle est vide, et le pousser sur la pile de plaques d&#39;être lu. Prenez par la poignée, et les plaques doivent tous être chargé dans le magasin. Chargez le chargeur dans le RapidStak. Remarque: Le magazine a une petite vis dans le coin dénotant quel coin du puits A1 des plaques devrait aller. Le magazine ne montez dans le RapidStak dans un sens. </li><li> Ouvrez le programme RE SkanIt sur l&#39;ordinateur connecté à la machine. Sélectionnez &quot;New Session&quot; et un nom approprié. Choisissez &quot;Corning à fond plat de 384 puits assiette» comme le type de plaque. </li><li> Dans la «disposition de la plaque», sélectionnez le &quot;Magicien&quot; bouton, et il choisir d&#39;ajouter 384 inconnues dans votre assiette. </li><li> Dans le «Protocole», sélectionnez la &quot;boucle bien&quot; option et entrez pour 384 puits. Une «boucle bien&quot; icône apparaîtra dans le flux d&#39;arbre sur le côté gauche de l&#39;écran. Sélectionnez l&#39;icône et cliquez pour ajouter &quot;Mesure photométrique». Réglez-le à lire à 600nm. </li><li> Enregistrer votre protocole avec un nom unique, et fermer le programme RE SkanIt. </li><li> Sur l&#39;ordinateur, ouvrez le programme PolaraRS. </li><li> Sur la page principale, il y aura tableau énumérant les instruments connectés à l&#39;appareil RapidStak. Le VarioSkan devrait être mis sur le côté gauche de ce tableau. Sous le titre VarioSkan, il y aura deux liens: «RunSession» et «Incuber&quot;. Cliquez sur le &quot;RunSession&quot; option. </li><li> Une nouvelle fenêtre, la fenêtre d&#39;analyse, apparaît avec un organigramme dans le milieu. Sélectionnez le &quot;RunSession&quot; item (il devrait être présent seul élément). Sur le côté droit de l&#39;écran un menu déroulantapparaîtra. Trouvez le nom de votre RE SkanIt sauvé lancer dans ce menu. Note: Il semble y avoir aucun ordre rationnel de ce menu. Il n&#39;est pas alphabétique, ou par date d&#39;ajout, ou liés à l&#39;emplacement sur l&#39;ordinateur que le protocole est sauvé. Cela signifie que vous devez regarder à travers tous les protocoles avant de trouver votre propre, qui est une douleur. </li><li> Une fois que vous avez sélectionné votre protocole, dans le coin supérieur droit cliquez sur &quot;Exécuter ce test&quot;. </li><li> Une boîte apparaît, vous demandant de désigner quel magazine à utiliser comme source, et qui chargeur est vide. La zone inférieure de l&#39;écran correspond à la revue avant. [Facultatif: Il vous demande d&#39;entrer le nombre de plaques chargées de déterminer une estimation de la quantité de temps qu&#39;il faudra. Cette estimation est normalement loin.] </li><li> Veiller à la fois l&#39;RapidStak et le VarioSkan sont allumés, et appuyez sur &quot;OK&quot;. </li><li> Le RapidStak se charge automatiquement vos assiettes dans le lecteur de plaque, permettant de mesurer en continu les plaques. Pour lire 25 plaques prend environ 50 minutes. Remarque: Il est recommandé d&#39;observer la première plaque de chargement dans le VarioSkan pour assurer le bon alignement des machines. Si le RapidStak ne charge pas le lecteur de plaque correctement, utilisez la &quot;Pause ce test&quot; bouton dans le coin en haut à droite de la fenêtre PolaraRS. </li><li> Une fois la lecture se fait VarioSkan toutes les assiettes, retirez le chargeur complet et le placer sur la plate-forme de chargement magazine. Soulevez le rectangle extérieur de la plateforme, et le magazine doit glisser, laissant les plaques debout dans une pile au milieu. Remplacer les couvercles sur les plaques appropriées. </li></ol> 3. Ajout de l&#39;Assay Mix à chaque plaque <ol><li> Préparer le mélange de dosage en utilisant premade stock de 10x de mélange de lyse (10% de Triton X-100, 100mm RIS, 10mM EDTA) dans un tampon d&#39;acétate de potassium 50 mM à pH 5,5. Préparer un stock de jusqu&#39;à 75mg/mL DNP-cellobioside substrat dans le DMSO, en s&#39;assurant que le substrat soit complètement dissous. Ajouter la solution stock de DNP-cellobioside de mélanger test à une concentration finale de 0.1mg/mL. Chaque plaque va utiliser environ 20 ml de la solution, ainsi que faire un 50mL supplémentaires pour permettre volume mort. Remarque: DNP-cellobioside n&#39;est pas soluble dans l&#39;eau, donc la dissolution dans le DMSO augmente la solubilité. La présence de DMSO dans la solution d&#39;analyse finale n&#39;a pas d&#39;effets observables. </li><li> Mettre en place l&#39;qFill3 que les instructions du fabricant avec la bouteille des médias attachés à la tubulure par l&#39;intermédiaire du tube stérile. Il programme pour le montant approprié des médias, et le mettre pour remplir un volume 45uL dans chaque puits. </li><li> Purger l&#39;air du tube et le collecteur à l&#39;aide de la fonction de purge du robot jusqu&#39;à ce média est visible provenant de chaque broche du collecteur. </li><li> Ajouter le mélange de dosage de chaque plaque à l&#39;aide de la qFill3. Chaque plaque dure environ 20 secondes pour remplir. </li><li> Une fois mélange de dosage est ajoutée, incuber les plaques à 37 ° C dans une boîte d&#39;humidité pour les 12-16 heures. Remarque: Plus-incubation des plaques fois le mélange d&#39;essai est ajouté provoquera l&#39;évaporation dans les puits extérieur de la plaque, ce qui donne des lectures d&#39;absorbance supérieur vu pour les puits à l&#39;intérieur. Cela peut être compensé par une incubation des plaques dans une chambre humide. </li></ol> 4. Absorbance des Clones Assayed <ol><li> Retirer des plaques de 37 ° C incubateur. Retirer et réserver les couvercles et les plaques de placer sur la plate-forme de chargement fourni avec le magazine l&#39;RapidStak, jusqu&#39;à un maximum de 25 plaques. Remarque: La plaque au bas de la pile sera la première à être lu. Assurez-vous de garder une trace de l&#39;ordre des planches, comme le logiciel n&#39;enregistre pas présent. </li><li> Retirer un magazine de la Stak rapide, s&#39;assurer qu&#39;elle est vide, et le pousser sur la pile de plaques d&#39;être lu. Prenez par la poignée, et les plaques doivent tous être chargé dans le magasin. Chargez le chargeur dans le RapidStak. Remarque: Le magazine a une petite vis dans le coin dénotant quel coin du puits A1 des plaques devrait aller. Le magazine ne montez dans le RapidStak dans un sens. </li><li> Ouvrez le programme RE SkanIt sur l&#39;ordinateur connecté à la machine. Sélectionnez &quot;New Session&quot; et un nom approprié. Choisissez &quot;Corning à fond plat de 384 puits assiette» comme le type de plaque. </li><li> Dans la «disposition de la plaque», sélectionnez le &quot;Magicien&quot; bouton, et il choisir d&#39;ajouter 384 inconnues dans votre assiette. </li><li> Dans le «Protocole», sélectionnez la &quot;boucle bien&quot; option et entrez pour 384 puits. Une «boucle bien&quot; icône apparaîtra dans le flux d&#39;arbre sur le côté gauche de l&#39;écran. Sélectionnez l&#39;icône et cliquez pour ajouter &quot;Mesure photométrique». Réglez-le à lire à 400nm. </li><li> Enregistrer votre protocole avec un nom unique, et fermer le programme RE SkanIt. </li><li> Sur l&#39;ordinateur, ouvrez le programme PolaraRS. </li><li> Sur la page principale, il y aura tableau énumérant les instruments connectés à l&#39;appareil RapidStak. Le VarioSkan devrait être mis sur le côté gauche de ce tableau. Sous le titre VarioSkan, il y aura deux liens: «RunSession&quot; et &quot;Incubate &quot;. Cliquez sur le&quot; RunSession &quot;option. </li><li> Une nouvelle fenêtre, la fenêtre d&#39;analyse, apparaît avec un organigramme dans le milieu. Sélectionnez le &quot;RunSession&quot; item (il devrait être présent seul élément). Sur le côté droit de l&#39;écran un menu déroulant apparaîtra. Trouvez le nom de votre RE SkanIt sauvé lancer dans ce menu. </li><li> Une fois que vous avez sélectionné votre protocole, dans le coin supérieur droit cliquez sur &quot;Exécuter ce test&quot;. </li><li> Une boîte apparaît, vous demandant de désigner quel magazine à utiliser comme source, et qui chargeur est vide. La zone inférieure de l&#39;écran correspond à la revue avant. [Facultatif: Il vous demande d&#39;entrer le nombre de plaques chargées de déterminer une estimation de la quantité de temps qu&#39;il faudra. Cette estimation est normalement loin.] </li><li> Veiller à la fois l&#39;RapidStak et le VarioSkan sont allumés, et appuyez sur &quot;OK&quot; </li><li> Le RapidStak se charge automatiquement vos assiettes dans le lecteur de plaque, permettant de mesurer en continu les plaques. Remarque: Il est recommandé d&#39;observer la première plaque de chargement dans le VarioSkan pour assurer le bon alignement des machines. Si le RapidStak ne charge pas le lecteur de plaque correctement, utilisez la &quot;Pause ce test&quot; bouton dans le coin en haut à droite de la fenêtre PolaraRS. </li><li> Une fois la lecture se fait VarioSkan toutes les assiettes, retirez le chargeur complet et le placer sur la plate-forme de chargement magazine. Soulevez le rectangle extérieur de la plateforme, et le magazine doit glisser, laissant les plaques debout dans une pile au milieu. Les plaques peuvent être éliminés en fonction de vos procédures de laboratoire. </li><li> Pour exporter les résultats d&#39;absorbance, ouvrez le logiciel RE SkanIt, et choisissez &quot;Ouvrir un fichier existant&quot;. </li><li> Sélectionnez le répertoire où vous avez enregistré votre session, cliquez sur le icône «+» pour développer la liste et sous le titre rubrique sera options étiqueté «Container 1» à «Conteneur N» selon le nombre de plaques. Sélectionnez la première plaque d&#39;être analysés. </li><li> Dans la barre de menu en haut de la page, sélectionnez &quot;Data Processing&gt; Rapport / Export&quot; </li><li> Choisissez les options souhaitées pour l&#39;exportation. Note: Je typiquement sélectionnez «disposition de la plaque» et «photométrique» les données pour l&#39;exportation. </li><li> Cliquez sur «Afficher le rapport&quot; puis sur &quot;Fichier&gt; Enregistrer&quot;. Choisissez le répertoire désiré. Le format de sortie est une feuille de calcul Microsoft Excel </li></ol> 5. Les résultats représentatifs Un exemple de lectures d&#39;absorbance d&#39;une seule plaque de 384 puits contenant un clone positif est montré dans la figure 2. Les clones positifs montrent une nette augmentation de l&#39;absorbance par rapport à ceux n&#39;exprimant pas le activité cellulase. Les différences de temps de dosage, l&#39;emplacement ainsi sur la plaque, ou la concentration DNP (peut être introduite par filtrage non dissous DNP) peut affecter les lectures d&#39;absorbance absolue. Lectures d&#39;absorbance relative, tels que la différence d&#39;absorbance supérieure à la moyenne plaque ou moyenne colonne, sont une méthode plus robuste d&#39;identification des clones positifs cellulase. Suite à l&#39;identification des clones positifs de la bibliothèque de plaques, il est recommandé de reproduire tous les clones positifs dans une nouvelle plaque pour le dépistage secondaire. Ceci élimine les effets découlant de l&#39;emplacement ainsi la plaque ou la variation et permet la comparaison directe entre plusieurs clones positifs. <img src="/files/ftp_upload/2461/2461fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Organigramme de l&#39;analyse à haut débit pour une banque métagénomique clonée dans E. coli et conservés à -80 ° C. <img src="/files/ftp_upload/2461/2461fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Lectures d&#39;absorbance d&#39;une plaque de 384 puits contenant un clone positif. Clones positifs cellulase peuvent être identifiés par l&#39;absorbance sensiblement augmenté au cours des clones négatifs.

<ol>
	<li>Rubin, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomics+of+cellulosic+biofuels.">Genomics of cellulosic biofuels.</a> Nature. 454, 841-845 (2008).</li><li>Voget, S., Steele, H. L., Streit, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+metagenome+derived+halotolerant+cellulase.">Characterization of a metagenome derived halotolerant cellulase.</a> J. Biotechnol. 126, 26-36 (2006).</li><li>Duan, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+partial+characterization+of+novel+genes+encoding+acidic+cellulases+from+metagenomes+of+buffalo+rumens.">Isolation and partial characterization of novel genes encoding acidic cellulases from metagenomes of buffalo rumens.</a> J. Appl. Microbiol. 107, 245-256 (2009).</li><li>Zhang, Y. H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outlook+for+cellulase+improvement:+Screening+and+selection+strategies.">Outlook for cellulase improvement: Screening and selection strategies.</a> Biotech. Advances. 24, 452-481 (2006).</li><li>Teather, R. M., Wood, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+congo+red-polysaccharide+interactions+in+enumeration+and+characterization+of+cellulolytic+bacteria+from+the+bovine+rumen.">Use of congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen.</a> Appl. And Environ. Microbiol. 43, 777-780 (1982).</li><li>Sharrock, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulase+assay+methods:+a+review.">Cellulase assay methods: a review.</a> J. Biochem and Biophys Methods. 17, 81-106 (1988).</li><li>Kasana, R. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cellulases+and+xylanases:+A+detailed+kinetic+study+of+the+exo-beta-1,4-glycanase+from+Cellulomonas+fimi.">Mechanisms of cellulases and xylanases: A detailed kinetic study of the exo-beta-1,4-glycanase from Cellulomonas fimi.</a> Biochemistry. 33, 6363-6370 (1994).</li><li>Martinez, A., Bradley, A. S., Waldbauer, J. R., Summons, R. E., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteorhodopsin+photosystem+gene+expression+enables+photophosphorylation+in+a+heterologous+host.">Proteorhodopsin photosystem gene expression enables photophosphorylation in a heterologous host.</a> PNAS. 104, 5590-5595 (2007).</li><li>Taupp, M., Lee, S., Hawley, A., Yang, J., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+Insert+Environmental+Genomic+Library+Production.">Large Insert Environmental Genomic Library Production.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Martinez, A., Tyson, G. W., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+known+and+novel+phosphonate+utilization+pathways+in+marine+bacteria+revealed+by+functional+screening+and+metagenomic+analyses.">Widespread known and novel phosphonate utilization pathways in marine bacteria revealed by functional screening and metagenomic analyses.</a> Environ Microbiol. 12, 222-238 (2010).</li><li>Wild, J., Hradecna, Z., Szybalski, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditionally+amplifiable+BACs:+Switching+from+single-copy+to+high-copy+vectors+and+genomic+clones.">Conditionally amplifiable BACs: Switching from single-copy to high-copy vectors and genomic clones.</a> Genome Research. 12, 1434-1444 (2002).</li><li>Johnson, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sacchirification+of+complex+cellulosic+substrates+by+the+cellulase+system+from+Clostridium+thermocellum.">Sacchirification of complex cellulosic substrates by the cellulase system from Clostridium thermocellum.</a> Appl Environ Microbiology. 43, 1125-1132 (1982).</li><li>Stutzenberger, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulase+Production+by+Thermomonospora+curvata+isolated+from+municipal+solid+waste+compost.">Cellulase Production by Thermomonospora curvata isolated from municipal solid waste compost.</a> Appl Environ Microbiol. 22, 147-152 (1971).</li></ol>

Un écran à haut débit pour la détection rapide de l&#39;activité cellulolytique partir d&#39;une bibliothèque génomique insérez métagénomique grandes ADN exprimée dans E. coli est décrite dans ce protocole. Cette méthode est une amélioration par rapport au dosage de CMC / rouge Congo couramment utilisé dans la littérature. C&#39;est une solution basée, et permet pour un pot de dépistage chimie en plaques 384 puits, avec la sortie finale lectures d&#39;absorbance à partir d&#39;un lecteur de p...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>qPix2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Genetix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>With 384-pin gridding head</td>
</tr>
<tr>
<td>qFill3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Genetix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>With 384-well manifold</td>
</tr>
<tr>
<td>Varioskan</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RapidStak</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Connected to Varioskan</td>
</tr>
<tr>
<td>Micro90 Detergent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cole-Parmer</td>
<td>18100-00</td>
<td>Diluted to 2% in water</td>
</tr>
<tr>
<td>Ethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Major Lab Supplier</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Diluted to 80% in water</td>
</tr>
<tr>
<td>Chloramphenicol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C0378</td>
<td>12.5mg/mL in ethanol</td>
</tr>
<tr>
<td>LB broth, Miller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP1426-2</td>
<td>25g/L, autoclaved</td>
</tr>
<tr>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>384-well flat bottom plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>3680</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-(+)-Arabinose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A3256</td>
<td>100mg/mL in water</td>
</tr>
<tr>
<td>Potassium Acetate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>P171</td>
<td>50mM in water, autoclaved, adjusted to pH 5.5 with HCl</td>
</tr>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP151</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trizma hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T3253</td>
<td>In TE buffer solution, 100mM</td>
</tr>
<tr>
<td>EDTA disodium salt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>E5134</td>
<td>In TE buffer solution, 10mM</td>
</tr>
<tr>
<td>2,4-dinitrophenyl cellobioside</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Provided by Dr. Steve Withers, UBC</td>
</tr>
<tr>
<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D8418</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

a high throughput screen for biomining cellulase activity from metagenomic libraries

La cellulose, la source la plus abondante de carbone organique sur la planète, possède une vaste applications industrielles avec un accent croissant sur ​​la production de biocarburants 1. Les méthodes chimiques de modifier ou de dégrader la cellulose exigent généralement les acides forts et des températures élevées. En tant que tel, les méthodes enzymatiques sont devenus importants dans le processus de bioconversion. Alors que l&#39;identification des cellulases actifs à partir d&#39;isolats bactériens et fongiques a été quelque peu efficaces, la grande majorité des microbes dans la nature résister à la culture en laboratoire. Génomique environnementale, aussi connu comme des approches métagénomique, de dépistage ont un grand potentiel pour combler le fossé de culture dans la recherche d&#39;enzymes de bioconversion roman. Approches de dépistage métagénomique ont réussi à récupérer les cellulases roman d&#39;environnements aussi variés que les sols 2, 3 buffles du rumen et l&#39;intestin postérieur des termites 4 en utilisant des plaques d&#39;agar carboxyméthylcellulose (CMC) tachés avec le Congo colorant rouge (basé sur la méthode de Teather et Wood 5). Cependant, la méthode MCC est limité dans le débit, n&#39;est pas quantitatif et manifeste un signal faible à 6 bruit. D&#39;autres méthodes ont été signalés, mais 7,8 chacun utiliser une plaque de gélose de base de test, qui est indésirable pour criblage à haut débit des grandes banques génomiques d&#39;insertion. Nous présentons ici une solution à base d&#39;écran pour l&#39;activité cellulase en utilisant un dinitrophénol chromogène (DNP)-cellobioside substrat 9. Notre bibliothèque a été cloné dans le contrôle pCC1 copie fosmide pour augmenter la sensibilité du dosage par induction du nombre de copies 10. La méthode utilise un pot de chimie en microplaques 384 puits avec la lecture finale fournie comme une mesure d&#39;absorbance. Cette lecture est quantitative, sensible et automatisé avec un débit allant jusqu&#39;à 384 plaques 100X-même par jour en utilisant un gestionnaire de liquide et de lecteur de plaque avec le système d&#39;empilage ci-joint.

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A High Throughput Screen for Biomining Cellulase Activity from Metagenomic Libraries

Ce protocole décrit un écran haut débit pour l&#39;activité cellulolytique d&#39;une banque métagénomique exprimé dans Escherichia coli. L&#39;écran est la solution basée et hautement automatisé et utilise un pot de chimie dans des microplaques 384 puits avec la lecture finale comme une mesure d&#39;absorbance.

Un écran à haut débit pour la bioprospection minière activité cellulase à partir des bibliothèques métagénomique

Cellulose, the most abundant source of organic carbon on the planet, has wide-ranging industrial applications with increasing emphasis on biofuel ...

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Research

JoVE Journal

Biology

15.0K vues.  University of British Columbia - UBC. Ce protocole décrit un écran haut débit pour l'activité cellulolytique d'une banque métagénomique exprimé dans Escherichia coli. L'écran est la solution basée et hautement automatisé et utilise un pot de chimie dans des microplaques 384 puits avec la lecture finale comme une mesure d'absorbance.

Vidéo: A High Throughput Screen for Biomining Cellulase Activity from Metagenomic Libraries

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation. Generating a streamlined procedure for creating and screening metagenomic libraries is therefore useful for efficient high-throughput investigations into the genetic and metabolic properties of uncultured microbial assemblages. Here, key protocols are presented on video, which we propose is the most useful format for accurately describing a long process that alternately depends on robotic instrumentation and (human) manual interventions. First, we employed robotics to spot library clones onto high-density macroarray membranes, each of which can contain duplicate colonies from twenty-four 384-well library plates. Automation is essential for this procedure not only for accuracy and speed, but also due to the miniaturization of scale required to fit the large number of library clones into highly dense spatial arrangements. Once generated, we next demonstrated how the macroarray membranes can be screened for genes of interest using modified versions of standard protocols for probe labeling, membrane hybridization, and signal detection. We complemented the visual demonstration of these procedures with detailed written descriptions of the steps involved and the materials required, all of which are available online alongside the video.

Grands écrans des banques métagénomiques

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

Recherche

Biologie

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

Haut débit écran surexpression plasmide de levure

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

Criblage à haut débit activité endoglucanase fongique dans les Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing a biorefinery. These raw materials would constitute a new industrial platform, which is both sustainable and carbon neutral, to replace 
the current dependency on fossil fuel. The recalcitrance to deconstruction observed in lignocellulosic materials is produced by several intrinsic properties 
of plant cell walls. Crystalline cellulose is embedded in matrix polysaccharides such as xylans and arabinoxylans, and the whole structure is encased by the 
phenolic polymer lignin, that is also difficult to digest 1. In order to improve the digestibility of plant materials we need to discover the main bottlenecks 
for the saccharification of cell walls and also screen mutant and breeding populations to evaluate the variability in saccharification 2. These tasks require 
a high throughput approach and here we present an analytical platform that can perform saccharification analysis in a 96-well plate format. This platform has 
been developed to allow the screening of lignocellulose digestibility of large populations from varied plant species. We have scaled down the reaction volumes 
for gentle pretreatment, partial enzymatic hydrolysis and sugar determination, to allow large numbers to be assessed rapidly in an automated system.
This automated platform works with milligram amounts of biomass, performing ball milling under controlled conditions to reduce the plant 
materials to a standardised particle size in a reproducible manner. Once the samples are ground, the automated formatting robot dispenses specified and recorded 
amounts of material into the corresponding wells of 96 deep well plate (Figure 1). Normally, we dispense the same material into 4 wells to have 4 replicates for 
analysis. Once the plates are filled with the plant material in the desired layout, they are manually moved to a liquid handling station (Figure 2). In this 
station the samples are subjected to a mild pretreatment with either dilute acid or alkaline and incubated at temperatures of up to 90&deg;C. The pretreatment solution 
is subsequently removed and the samples are rinsed with buffer to return them to a suitable pH for hydrolysis. The samples are then incubated with an enzyme
mixture for a variable length of time at 50&deg;C. An aliquot is taken from the hydrolyzate and the reducing sugars are automatically determined by the MBTH 
colorimetric method.

A simple, rapid method for determining the saccharification potential of large numbers of plant biomass samples is described. The automated platform for this analysis involves the preparation of the plant biomass for analysis in 96 well plates and the subsequent performance of pretreatment, hydrolysis and quantification of the sugars released.

Assay saccharification haut débit pour les matériaux lignocellulosiques

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA

Whole transcriptome sequencing by mRNA-Seq is now used extensively to perform global gene expression, mutation, allele-specific expression and other genome-wide analyses. mRNA-Seq even opens the gate for gene expression analysis of non-sequenced genomes. mRNA-Seq offers high sensitivity, a large dynamic range and allows measurement of transcript copy numbers in a sample. Illumina&#x2019;s genome analyzer performs sequencing of a large number (&gt; 107) of relatively short sequence reads (&lt; 150 bp).The &quot;paired end&quot; approach, wherein a single long read is sequenced at both its ends, allows for tracking alternate splice junctions, insertions and deletions, and is useful for de novo transcriptome assembly.
One of the major challenges faced by researchers is a limited amount of starting material. For example, in experiments where cells are harvested by laser micro-dissection, available starting total RNA may measure in nanograms. Preparation of mRNA-Seq libraries from such samples have been described1, 2 but involves significant PCR amplification that may introduce bias. Other RNA-Seq library construction procedures with minimal PCR amplification have been published3, 4 but require microgram amounts of starting total RNA.
Here we describe a protocol for the Illumina Genome Analyzer II platform for mRNA-Seq sequencing for library preparation that avoids significant PCR amplification and requires only 10 nanograms of total RNA. While this protocol has been described previously and validated for single-end sequencing5, where it was shown to produce directional libraries without introducing significant amplification bias, here we validate it further for use as a paired end protocol. We selectively amplify polyadenylated messenger RNAs from starting total RNA using the T7 based Eberwine linear amplification method, coined &quot;T7LA&quot; (T7 linear amplification). The amplified poly-A mRNAs are fragmented, reverse transcribed and adapter ligated to produce the final sequencing library. For both single read and paired end runs, sequences are mapped to the human transcriptome6 and normalized so that data from multiple runs can be compared. We report the gene expression measurement in units of transcripts per million (TPM), which is a superior measure to RPKM when comparing samples7.

Here we describe a method for preparation of both single read and paired end Illumina mRNA-Seq sequencing libraries for gene expression analysis based on T7 linear RNA amplification. This protocol requires only 10 nanograms of starting total RNA and generates highly consistent libraries representing whole transcripts.

Simple Lire et jumelés bibliothèques Fin Illumina ARNm-Seq de 10 nanogrammes d&#39;ARN total

Whole transcriptome sequencing by mRNA-Seq is now used extensively to perform global gene expression, mutation, allele-specific expression and other ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

À haut débit microinjections oursins zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology due to their considerable degree of genetic conservation with humans. Chemical genetics entails testing the effect that small molecules have on a biological process and is becoming a popular translational research method to identify therapeutic compounds. Zebrafish are specifically appealing to use for chemical genetics because of their ability to produce large clutches of transparent embryos, which are externally fertilized. Furthermore, zebrafish embryos can be easily drug treated by the simple addition of a compound to the embryo media. Using whole-mount in situ hybridization (WISH), mRNA expression can be clearly visualized within zebrafish embryos. Together, using chemical genetics and WISH, the zebrafish becomes a potent whole organism context in which to determine the cellular and physiological effects of small molecules. Innovative advances have been made in technologies that utilize machine-based screening procedures, however for many labs such options are not accessible or remain cost-prohibitive. The protocol described here explains how to execute a manual high-throughput chemical genetic screen that requires basic resources and can be accomplished by a single individual or small team in an efficient period of time. Thus, this protocol provides a feasible strategy that can be implemented by research groups to perform chemical genetics in zebrafish, which can be useful for gaining fundamental insights into developmental processes, disease mechanisms, and to identify novel compounds and signaling pathways that have medically relevant applications.

The zebrafish is an excellent experimental organism to study vertebrate developmental processes and model human disease. Here, we describe a protocol on how to perform a manual high-throughput chemical screen in zebrafish embryos with a whole-mount in situ hybridization (WISH) read-out.

Un petit écran Molecule Manuel approchant à haut débit utilisant embryons de poissons zèbres

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Haut-débit criblage de modulateurs chimique des gènes post-transcriptionnelle réglementées

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

Analyse qPCRTag - un débit élevé, PCR temps réel pour Sc2.0 Génotypage

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

A Protocol for Functional Assessment of Whole-Protein Saturation Mutagenesis Libraries Utilizing High-Throughput Sequencing

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel sequencing technology have opened up the possibility of assessing the functional or fitness effects of large numbers of mutations simultaneously. Here, we present a protocol for experimentally determining the effects of all possible single amino acid mutations in a protein of interest utilizing high-throughput sequencing technology, using the 263 amino acid antibiotic resistance enzyme TEM-1 &#946;-lactamase as an example. In this approach, a whole-protein saturation mutagenesis library is constructed by site-directed mutagenic PCR, randomizing each position individually to all possible amino acids. The library is then transformed into bacteria, and selected for the ability to confer resistance to &#946;-lactam antibiotics. The fitness effect of each mutation is then determined by deep sequencing of the library before and after selection. Importantly, this protocol introduces methods which maximize sequencing read depth and permit the simultaneous selection of the entire mutation library, by mixing adjacent positions into groups of length accommodated by high-throughput sequencing read length and utilizing orthogonal primers to barcode each group. Representative results using this protocol are provided by assessing the fitness effects of all single amino acid mutations in TEM-1 at a clinically relevant dosage of ampicillin. The method should be easily extendable to other proteins for which a high-throughput selection assay is in place.

We present a protocol for the functional assessment of comprehensive single-site saturation mutagenesis libraries of proteins utilizing high-throughput sequencing. Importantly, this approach uses orthogonal primer pairs to multiplex library construction and sequencing. Representative results using TEM-1 &#946;-lactamase selected at a clinically relevant dosage of ampicillin are provided.

Un protocole pour l&#39;évaluation fonctionnelle de Whole-Protein Saturation mutagenèse Bibliothèques Utilisant à haut débit de séquençage

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel ...