Ce travail a été financé en partie par la National Science Foundation Grant MCB-0718846 et de la Défense Advanced Research Projects Agency contrat N66001-12-C-4020 (à JDB). LAM a été financé par une bourse de recherche postdoctorale du Conseil de recherches en génie du Canada en sciences naturelles et. Publication de cet article est sponsorisé par Roche.

1. Préparer l&#39;ADN génomique de levure (ADNg) <ol><li> Préparer un stock de levure Lysis Buffer 9 qui contient 50 mM de Tris pH 8,0, NaCl 100 mM, SDS à 1% (p / v), 2% de Triton X-100 (v / v), EDTA 1 mM pH 8,0. </li><li> Comme l&#39;utilisation des matériaux à partir ~ 2 x 10 6 cellules, ce qui correspond généralement à ~ 100 ul de culture saturée pour les souches de laboratoire de la BY4741 10 arrière-plan. Les cellules cultivées sont collectés par centrifugation à 1000 g pendant 3 min à température ambiante dans un tube à microcentrifugation de 1,5 ml. Aspirer le surnageant. </li><li> Ajouter 200 ul de tampon de lyse levures et remettre en suspension le culot de cellules par pipetage. </li><li> Ajouter ~ 300 ul d&#39;acide lavé les billes de verre de telle sorte que le niveau de perles est d&#39;environ 1 mm en dessous du niveau de la suspension cellulaire. </li><li> Dans une hotte ajouter 200 ul de phénol / chloroforme / alcool isoamylique (25: 24: 1). Boucher le tube de centrifugeuse et veiller à ce qu&#39;aucun perles sont coincés entre le bouchon et le tube comme cela se traduira par des fuites pendant l&#39;agitation(Étape 1.6). Inversez 3 fois pour mélanger et vérifier le bouchon est scellé. </li><li> Agiter le tube pendant 10 min à température ambiante en utilisant un mélangeur de paillasse comme un Eppendorf 5432. </li><li> Centrifuger à 20 800 g pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Transfert 75 ul de la phase aqueuse dans un nouveau tube de microcentrifugation contenant 1 ml d&#39;éthanol à 100%. Inversez 10 fois pour mélanger. </li><li> Pellet l&#39;ADN par centrifugation à 20 800 g pendant 20 min à 4 ° C. </li><li> Aspirer le surnageant sans déloger le culot d&#39;ADN. Laver le culot avec 500 ul d&#39;éthanol à 70%. </li><li> Centrifuger à 20 800 g pendant 5 min à 4 ° C. </li><li> Aspirer le surnageant sans déloger le culot d&#39;ADN et sécher à l&#39;air le culot avec le bouchon de micro ouvert jusqu&#39;à excès d&#39;éthanol est évaporée, ce qui est généralement autour de 10 min. </li><li> Remettre en suspension le culot d&#39;ADN dans 75 ul de Tris à 10 mM pH 7,4 et vortex pour mélanger. Conserver l&#39;échantillon à -20 ° C indéfiniment. Mesurer la concentration de l&#39;ADN dans l&#39;échantillon en utilisant unpaillasse fluorimètre comme le qubit, qui distingue l&#39;ADN à partir d&#39;ARN. Assurez-vous que la concentration finale de ADNg est ~ 1-2 ng / ul. </li><li> Préparer une dilution 1:10 de l&#39;ADN génomique en utilisant de l&#39;eau et le vortex pour mélanger. </li><li> 30 ul d&#39;aliquote diluée ADNg dans le puits approprié d&#39;une plaque de source qui est compatible avec un distributeur de liquide à l&#39;échelle nanométrique acoustique (étape 3). Si vous utilisez un Labcyte Echo 550, utiliser une plaque de polypropylène de 384 puits (plaque 384PP). REMARQUE: Lorsque scellé convenablement cette plaque peut être conservé pendant au moins un mois à -20 ° C. </li></ol> 2. Préparer et de distribution qPCR Master Mix dans une plaque multipuits 1536 <ol><li> Préparer 850 pi de qPCR mélange maître, comme LightCycler 1536 ADN vert Maître, dans un tube de 1,5 ml et le vortex pour mélanger. Centrifuger le mélange maître qPCR pendant 2 min à 20 800 g à température ambiante pour éliminer les bulles. Les composants du mélange maître qPCR nécessaire pour une seule plaque multipuits 1536 sont les suivantss: <ol><li> Mélanger 170 pi de mélange maître enzyme (Master Green Tube 1, 5x concentré), 42,5 pi de SYBR (Tube Master Vert 4, 20x concentré), et 637,5 pi d&#39;eau. </li></ol></li><li> Distribuer 500 nl / puits dans une plaque multipuits 1536 en utilisant un distributeur de liquide en vrac telles que l&#39;Art Robbins Cobra. (Notez que les étapes 2.2.1-2.2.4 réfèrent spécifiquement à la Cobra.) <ol><li> Créer un programme de distribution avec les paramètres suivants: classe de liquide, de l&#39;eau; Aspirer le volume, 800 pi; passer le volume, 500 nl; le temps de lavage, 20 sec. Dans les paramètres de dépose, vérifier la vitesse de distribution est fixé à 49,6 mm / sec, le décalage distribution est de 0,25 mm, et l&#39;excès de liquide aspiré sera distribué retour dans la source ainsi. </li><li> Placez le tube de centrifugeuse contenant le mélange maître qPCR dans le puits A1 du support de tube de centrifugeuse, qui est situé en position de pont 1. Coupez le capuchon du tube de centrifugeuse ou simplement le laisser ouvert. Réglez le «Aspirer bien» à A1 en éditant le Aspiratparamètres e. </li><li> Effectuer une étape de lavage avant de distribuer qPCR mélange maître par les premiers de-sélectionnant l&#39;aspiration et de distribution étapes du programme mis en place à l&#39;étape 2.2.2, puis frapper &quot;run&quot;. Une fois terminé, re-sélectionnez le aspiration et de distribution étapes avant d&#39;exécuter le programme complet pour distribuer qPCR Master Mix. Si le Cobra a été assis inactif pendant moins de 10 minutes de l&#39;étape de lavage initial, qui sert à amorcer le système, est inutile. </li><li> Hit &#39;run&#39; pour distribuer qPCR mélange maître à chaque puits. </li></ol></li><li> Recueillir le master mix qPCR au fond de chaque puits par une brève centrifugation de la plaque multi-puits 1536 (30 secondes en utilisant une faible vitesse PCR plaque spinner). </li></ol> 3. Distribuer Patron de l&#39;ADN et des amorces dans le 1536 Multiwell Plate <ol><li> Distribuer 5 nl de diluée ADNg (étape 1.3) dans les puits souhaitées de la plaque multi-1536 en utilisant un système de transfert de liquide acoustique, telles que l&#39;Echo 550. <ol><li> Pour la Echo 550, utiliser le logiciel Plate reformatage ou encore fournir une feuille de calcul Excel personnalisé pour programmer le transfert. Assurer la source sélectionnée pour le bien ADNg dans le programme correspond à la source et dans lequel vous avez physiquement distribué l&#39;ADNg (étape 1.3). Choisir le type de plaque de source «384PP_AQ_BP2&quot;, qui indique le liquide dans la plaque 384PP est un tampon sans tensioactifs. </li></ol></li><li> Répartir 10 ni d&#39;amorces, de pré-mélangés avant et arrière à une concentration finale de 50 pM de chacun, dans les puits souhaitées de la plaque multi-puits 1536 en utilisant un système de transfert de liquide acoustique, tels que l&#39;Echo 550. <ol><li> Pour le système de transfert de liquide, utiliser le logiciel Plate reformatage ou encore fournir une feuille de calcul Excel personnalisé pour programmer le transfert. REMARQUE: Ici, il est possible de se passer des primaires tels que la disposition sur la plaque multipuits 1536 correspond à l&#39;ordre chromosomique des amorces il est donc facile d&#39;inspecter visuellement les résultats de la PCR en temps réelplus tard (étape 6). </li><li> Prémélange les amorces dans une plaque qui est compatible avec le distributeur de liquide acoustique. Pour l&#39;Echo 550, utiliser une plaque Labcyte 384LDV (faible volume mort) et de choisir le type de plaque de source »384LDV_AQ_B &#39;lors de la programmation de l&#39;Echo pour indiquer le liquide est un simple tampon sans protéines. </li></ol></li></ol> 4. Seal et Centrifugeuse 1536 Multiwell Plate <ol><li> Grâce à un système d&#39;étanchéité de microplaques comme le PlateLoc microplaques thermique Sealer, fermer immédiatement la plaque multipuits 1536 en utilisant joint optiquement clair qui est compatible avec l&#39;instrument d&#39;un scellant à la chaleur. Ne touchez pas la surface du joint pour éviter les traces de maculage. <ol><li> Si vous utilisez le PlateLoc thermique microplaques Sealer, utilisez les paramètres suivants: sceller temps 2.0 sec, la température d&#39;étanchéité 162 ° C, la pression d&#39;air de 82 psi. Cet instrument prend ~ 5 min à chauffer et ainsi doit être activé à l&#39;avance. </li><li> Si vous utilisez le PlateLoc microplaques thermique Sealer, un ADAPTEr doit être utilisé pour augmenter la hauteur de la plaque multipuits 1536 sur la scène de l&#39;instrument pour assurer une bonne étanchéité. REMARQUE: Bien qu&#39;il soit préférable d&#39;acheter une plaque de platine pour la PlateLoc microplaques thermique Sealer, une solution alternative consiste à insérer quatre ~ 2 mm rondelles standard épais disponibles à tout magasin de matériel dans les coins pour augmenter la hauteur de la plaque à puits multiples 1536. </li></ol></li><li> Centrifuger immédiatement la plaque 1536 multipuits scellé à 2000 g pendant 3 min à température ambiante pour recueillir tous les réactifs au fond de chaque puits. </li></ol> 5. PCR en temps réel <ol><li> Programme qPCR un instrument 1536, tel que le LightCycler 1536, avec un protocole d&#39;amplification en deux étapes suivi d&#39;une analyse de courbe de fusion. Utilisation du logiciel LightCycler 1536 a mis en place un programme comme suit: <ol><li> La pré-incubation: 95 ° C, 1 min attente, le taux de rampe de 4,8 ° C / s, aucune acquisition. </li><li> L&#39;amplification en deux étapes: 30 cycles de [95 ° C, pas de prise,Taux de rampe de 4,8 ° C / sec, pas d&#39;acquisition; 64 ° C, attente de 30 secondes, le taux de rampe de 2,5 ° C / sec, seule acquisition]. </li><li> Faire fondre la courbe: 95 ° C, 10 sec, le taux de rampe de 4,8 ° C / sec, pas d&#39;acquisition; 60 ° C, 1 min, le taux de rampe de 2,5 ° C / sec, pas d&#39;acquisition; 97 ° C, le taux de rampe de 0,1 ° C / sec, 5 acquisitions / ° C (continu). </li><li> Cool: 40 ° C, 30 sec, le taux de rampe de 2,5 ° C / s, aucune acquisition. </li></ol></li><li> Réglez le Format de détection de &#39;Green intercalant Dye »dans l&#39;onglet Run Définition. </li><li> Réglez la commande de pipetage pour &#39;Master Control&#39; dans l&#39;onglet Run Définition. Cette fonction sert de contrôle interne et détecte la présence de qPCR Master Mix dans chaque puits de la plaque à puits multiples 1536, ce qui est utile pour identifier les faux négatifs putatifs. </li><li> Insérez la plaque multipuits 1536 préparé dans les étapes 2-4 dans la qPCR instrument 1536 et exécuter le programme. </li></ol> 6. Analyse des données <ol><li> Perform inspection visuelle des données dans le logiciel qPCR. REMARQUE: Le logiciel 1536 permet de visualiser à la fois l&#39;amplification et la fonte des courbes, ainsi que d&#39;une carte de chaleur montrant l&#39;appel (positif, négatif, invalide, N / A; Figure 2), la valeur du point de passage (coulissant échelle de couleurs pour le positif ou gris pour le négatif; Figure 3), ou une fluorescence point final (EPF) valeur (échelle mobile de couleur). </li><li> Exporter des données à partir du logiciel 1536 sous la forme d&#39;un fichier .txt (les résultats de la table) ou un fichier .xml soit avec les données brutes ou des données calculées pour le traitement hors ligne à partir de l&#39;instrument. NOTE: Le point de passage automatisé propriétaire (Cp) algorithme appelant intégré dans le logiciel 1536 tient compte de la forme et la pente de la courbe d&#39;amplification tout en déterminant négatifs et Cp appels positifs / valeur avec une grande confiance, à faible sous des volumes de réaction de microlitre avec relativement faible valeurs de fluorescence. </li><li> Si le LightCycler ADN vert Maître était utilisationd pour qPCR, vérifier que tous les puits ont passé le «contrôle de maître». Un fail indique le bien n&#39;a pas reçu qPCR Master Mix et le point de données manquantes devrait être considéré comme un faux négatif potentiel. Vérifiez que tous les puits ont passé le «contrôle de maître». Un fail indique le bien n&#39;a pas reçu l&#39;ADN mastermix et examiner le point de données manquant un faux négatif potentiel. </li></ol>

<ol>
	<li>Annaluru, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+synthesis+of+a+functional+designer+eukaryotic+chromosome.">Total synthesis of a functional designer eukaryotic chromosome.</a> Science. 344 (6179), 55-58 (2014).</li><li>Dymond, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+chromosome+arms+function+in+yeast+and+generate+phenotypic+diversity+by+design.">Synthetic chromosome arms function in yeast and generate phenotypic diversity by design.</a> Nature. 477 (7365), 471-476 (2011).</li><li>Goffeau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+with+6000+genes.">Life with 6000 genes.</a> Science. 274 (5287), 546-547 (1996).</li><li>Dymond, J., Boeke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Saccharomyces+cerevisiae+SCRaMbLE+system+and+genome+minimization.">The Saccharomyces cerevisiae SCRaMbLE system and genome minimization.</a> Bioeng Bugs. 3 (3), 168-171 (2012).</li><li>Richardson, S. M., Nunley, P. W., Yarrington, R. M., Boeke, J. D., Bader, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GeneDesign+3.0+is+an+updated+synthetic+biology+toolkit.">GeneDesign 3.0 is an updated synthetic biology toolkit.</a> Nucleic Acids Res. 38 (8), 2603-2606 (2010).</li><li>Richardson, S. M., Liu, S., Boeke, J. D., Bader, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design-A-Gene+with+GeneDesign.">Design-A-Gene with GeneDesign.</a> Methods Mol Biol. 852, 235-247 (2012).</li><li>Lajoie, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+limits+of+genetic+recoding+in+essential+genes.">Probing the limits of genetic recoding in essential genes.</a> Science. 342 (6156), 361-363 (2013).</li><li>Jovicevic, D., Blount, B. A., Ellis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+synthesis+of+a+eukaryotic+chromosome:+Redesigning+and+SCRaMbLE-ing+yeast.">Total synthesis of a eukaryotic chromosome: Redesigning and SCRaMbLE-ing yeast.</a> Bioessays. 36 (9), 855-860 (2014).</li><li>Dymond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+genomic+DNA+from+Saccharomyces+cerevisiae.">Preparation of genomic DNA from Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Enzymol. 529, 153-160 (2013).</li><li>Brachmann, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+deletion+strains+derived+from+Saccharomyces+cerevisiae+S288C:+a+useful+set+of+strains+and+plasmids+for+PCR-mediated+gene+disruption+and+other+applications.">Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications.</a> Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).</li></ol>

LAM, NAP, JAM et JDB ont rien à révéler. RC et AL sont employés par Roche Life Science, des États-Unis et a travaillé sur le développement de l&#39;application avec LAM dans le cadre d&#39;une preuve de l&#39;expérience principe.

Incorporation de détection de PCR en temps réel dans le test de génotypage PCRTag est un développement important pour le projet Sc2.0 car elle permet un débit nettement plus élevé. Le workflow précédente spécifié 2,5 réactions ul dans des plaques de 384 puits PCR, 1,5 heures de temps d&#39;exécution de cyclage thermique, électrophorèse sur gel d&#39;agarose, et d&#39;annotation manuelle du gel. Le flux de travail présenté ici, appelée analyse qPCRTag, surmonte plusieurs principaux goulets d&#39;étranglement. Tout d&#39;abord, une course de qPCRTag condense 4 x 384 plaques ainsi dans une expérience unique qui peut être traitée, début à la fin (plaque mis en place, plus le temps de fonctionner), en une heure environ. Il est important de noter que le coût de réactif par puits pour l&#39;analyse qPCRTag est à égalité avec l&#39;approche inférieure à base de gel agarose-débit. Cependant, en contournant électrophorèse sur gel et annotation manuelle, le workflow qPCRTag offre des économies substantielles de temps et de travail, qui sont les principaux avantages. Surtout le flux de travail est en qPCRTagtièrement compatible avec l&#39;automatisation. Une préoccupation majeure avec l&#39;utilisation de la détection réelle de temps que la sortie de l&#39;essai PCRTag est le taux de faux positifs et de faux négatifs. Depuis les amorces PCRTag ont pas été initialement conçus pour une utilisation dans la PCR en temps réel, il est prévu que tous les couples d&#39;amorces seront appropriées pour une utilisation avec cette sortie. A cette fin, il est important de valider la fonction et la spécificité de toutes les paires d&#39;amorces PCRTag à exclure le sous-ensemble qui ne fonctionne pas dans le dosage réel basé sur le temps à l&#39;avant. Par exemple, chromosome 3 PCRTag faux positifs et négatifs sont des sous-grand-et reproductible dans la PCR en temps réel des données (figures 2 et 3) et ceux-ci peuvent être exclues d&#39;autres analyses. En outre, les paires d&#39;amorces connues à l&#39;échec (évalués par électrophorèse sur gel et présentés dans les figures S6 et S7 de Annaluru et al. 1) peuvent également être exclus. Ceci est facilement accompli simplement excluding les paires d&#39;amorces défectueux lors de la mise en place du protocole de transfert acoustique. Comme la plupart des analyses à haut débit, nous avons l&#39;intention d&#39;utiliser la détection de PCRTag en temps réel comme un écran primaire pour identifier les transformants qui méritent une validation supplémentaire en aval. Par la suite, l&#39;étalon-or pour le dépistage secondaire restera analyse PCRTag avec électrophorèse sur gel que la lecture. Au-delà de l&#39;application de l&#39;analyse PCRTag pour Sc2.0, combinant des systèmes de manipulation des liquides à l&#39;échelle nanométrique état-of-the-art avec la technologie haut débit de PCR en temps réel permet une analyse rapide et automatisé et a le potentiel d&#39;avoir un impact de nombreux domaines. Par exemple, ce flux de travail pourrait être appliquée à de dépistage grande capacité de la bibliothèque, le diagnostic des maladies infectieuses, l&#39;analyse sur le microbiome, et pointe édition du génome approches tentant de modifier loci multiples simultanément.

Sc2.0, ou le projet de génome de la levure synthétique ( <a href="http://www.syntheticyeast.org" target="_blank">www.syntheticyeast.org</a> ), a fixé l&#39;objectif de concevoir et de construire un génome eucaryote entièrement synthétique. Utilisation de la séquence du génome hautement organisée de Saccharomyces cerevisiae 3 comme point de départ, chacun des chromosomes linéaires seize a été re-conçu pour répondre à un ensemble de principes de conception qui spécifient maintien de la forme des cellules, l&#39;amélioration de la stabilité du génome, et accroître la flexibilité génétique. Par exemple, des éléments de déstabilisation tels que les répétitions sont supprimés de chromosomes Sc2.0. Toutes les instances de codons stop TAG sont re-codés pour TAA à &#39;libérer&#39; un codon dans la souche finale pour l&#39;introduction d&#39;un acide aminé non génétiquement codé. En outre, un système d&#39;évolution inductible, Scramble, permis par le système Cre-lox, permet une capacité sans précédent de générer des génomes dérivés avec 4 nouvelles structures. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Un autre élément de conception majeur dans le génome de Sc2.0 est l&#39;introduction de PCRTags, qui servent de filigranes ADN pour permettre le suivi de l&#39;ADN de type synthétique et sauvage. PCRTags sont courts segments de re-codées dans les ORF sur les chromosomes synthétiques; tandis que les séquences PCRTag diffèrent au niveau de l&#39;ADN entre les chromosomes de type sauvage et synthétiques, les protéines codées sont identiques à la séquence d&#39;acides aminés et, par conséquent, probablement, de la fonction. PCRTag séquences sont spécifiquement conçus comme des sites de liaison d&#39;amorces pour faciliter l&#39;amplification sélective (Figure 1A). PCRTag conception est effectuée en utilisant l&#39;algorithme &quot;le plus différent» dans GeneDesign 5,6, donnant recodé séquences synthétiques qui sont typiquement ~ 60% différente de celle des séquences natives (minimum 33%) avec des températures de fusion entre 58 ° C et 60 ° C et amplicon longueurs entre 200-500 paires de base 2. Recodage est interdit dans le premier 100 pb de chaque ORF, que ces régions sont connues pouravoir des préférences particulières en termes d&#39;utilisation de codon 7. Ensemble, ces règles de conception favorisent haute performance de presque tous PCRTags sous un seul ensemble de conditions de PCR lequel paires d&#39;amorces de type PCRTag synthétiques et sauvages se lient exclusivement et amplifier l&#39;ADN synthétique et native, respectivement (figure 1B). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52941/52941fig1.jpg" /> Figure 1:. PCRTag schématique (A) PCRTags sont séquences à l&#39;intérieur des cadres de lecture ouverts (ORF) des gènes sur les chromosomes Sc2.0 recodées. (B) synthétique (SYN) et de type sauvage (WT) amorces PCRTag lient exclusivement et amplifient l&#39;ADN génomique de type synthétique et sauvage (ADNg), respectivement. On voit ici une analyse d&#39;un segment du bras gauche du chromosome six ~ 30 kb, tester treize PCRTag paires d&#39;amorces utilisant soit WT ou semi-synVIL2 gDNA comme modèle. Dans de nombreux cas, une seule ORF code plus d&#39;un PCRTag. Présence / absence d&#39;amplicons PCRTag est évaluée par électrophorèse sur gel d&#39;agarose. Amplicons PCRTag varient en taille de 200 pb à 500 pb. Les espèces migrant plus vite dans le bas des panneaux sont des dimères d&#39;amorces. PCRTag analyse a prouvé être un outil important dans l&#39;assemblage de chromosomes Sc2.0. Dans une expérience typique de 30 à 50 kb de l&#39;ADN synthétique, codant pour 20 à 30 PCRTags, est transformé dans des cellules de levure pour remplacer le type sauvage correspondant ADN 1,2,8. PCRTag analyse est ensuite utilisée pour identifier les transformants qui codent synthétiques mais pas sauvage PCRTags de type couvrant ce segment d&#39;ADN, ou soi-disant «gagnants». Il est généralement nécessaire de tester plusieurs transformants d&#39;identifier les «gagnants», de sorte débit et le coût de l&#39;analyse PCRTag sont des considérations importantes. Actuellement deux chromosomes Sc2.0 ont été réalisées (une synIII et synIXR 2), ce qui représente moins de 10% du génome de Sc2.0, altHough plus de la moitié des chromosomes restants sont actuellement en cours de synthèse et l&#39;assemblage. L&#39;échelle d&#39;analyse PCRTag requis pour ce projet est plus rapide que rapide la possibilité d&#39;exécuter manuellement les gels et marquer la présence de l&#39;ADN synthétique et l&#39;absence d&#39;ADN de type sauvage. Pour améliorer le débit de l&#39;essai PCRTag nous avons développé un flux de travail en utilisant la PCR en temps réel pour contourner l&#39;utilisation d&#39;une électrophorèse sur gel d&#39;agarose. Le workflow permet l&#39;utilisation d&#39;un distributeur de liquide en vrac à distribuer qPCR mastermix dans chaque puits d&#39;une plaque multipuits 1536, un distributeur de liquide acoustique échelle nanométrique pour transférer l&#39;ADN de matrice et des amorces, et un cycleur thermique 1536 qPCR, ce qui nous permet de miniaturiser les réactions à 500 nl et maximiser le débit. En outre l&#39;analyse peut être automatisée. Ce type de haut débit protocole de génotypage devrait être généralisables à tout projet nécessitant l&#39;analyse de nombreux clones à des loci multiples.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Yeast gDNA prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yeast gDNA</td>
			<td>custom</td>
			<td>custom</td>
			<td>template for real time PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid-washed glass beads (0.5mm)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8772</td>
			<td>yeast cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15593-031</td>
			<td>yeast cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5432 Mixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5432</td>
			<td>yeast cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge 5417R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22621807</td>
			<td>yeast cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q33216</td>
			<td>gDNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32850</td>
			<td>gDNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labcyte 384PP plate</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td>P-05525</td>
			<td>gDNA source plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>DNA Green Mastermix prep and dispensing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 1536 DNA Green</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5573092001</td>
			<td>real time PCR mastermix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5mL Microfuge Tube Holder</td>
			<td>ARI</td>
			<td>EST BD060314-1</td>
			<td>microfuge tube holder for deck of Cobra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 1536 Multiwell Plate</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5358639001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobra liquid handling system</td>
			<td>Art Robbins Instruments</td>
			<td>630-1000-10</td>
			<td>dispense qPCR master mix into 1536 plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Plate Spinner</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89184-608</td>
			<td>cenrifugation of 1536 plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Template and primer dispensing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCRTag primers</td>
			<td>IDT</td>
			<td>custom</td>
			<td>premixed forward and reverse, [50uM] each</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TempPlate pierceable sealing foil, sterile</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2923-0110</td>
			<td>temporary seal for PCRTag primer plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labcyte LDV 384 well plate</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td>LP-0200</td>
			<td>pre-mixed primer source plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Echo 550 Liquid Handler</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td></td>
			<td>transfer 2.5nL drops of primer and template DNA into 1536 plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plateloc Thermal Microplate Sealer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G5402-90001</td>
			<td>heat seal for 1536 plate prior to LC1536 run</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Permanent Seal</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>24212-001</td>
			<td>optically clear heat seal for LC1536 multiwell plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlateLoc Roche/LightCycler 1536 Plate Stage</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G5402-20008</td>
			<td>can substitute ~2mm thick washers&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend XTR</td>
			<td>Thermo Scientfic</td>
			<td>75-004-521</td>
			<td>centrifuge heat sealed 1536 plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Industrial Air Compressor</td>
			<td>Jun Air</td>
			<td>1795011</td>
			<td>to run the Echo and Heat Sealer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Real Time PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 1536</td>
			<td>Roche</td>
			<td></td>
			<td>requires 220V outlet</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

qpcrtag analysis - a high throughput, real time pcr assay for sc2.0 genotyping

Le projet de génome de la levure synthétique (Sc2.0) vise à construire 16 concepteur chromosomes de levure et les combiner en une cellule de levure seule. A ce jour, un chromosome synthétique, synIII 1, et un bras de chromosome synthétique, synIXR 2, ont été construits et leur fonction in vivo validé en l&#39;absence des chromosomes de type sauvage correspondantes. Une importante caractéristique de conception de chromosomes Sc2.0 est l&#39;introduction de PCRTags, qui sont courtes, recodé séquences au sein des cadres de lecture ouverts (ORF) qui permettent la différenciation des chromosomes synthétiques de leurs homologues de type sauvage. PCRTag amorces hybrident sélectivement soit à des chromosomes de type sauvage ou de synthèse et la présence / absence de chaque type d&#39;ADN peuvent être testés en utilisant un dosage PCR simple. La lecture de la norme d&#39;essai est d&#39;évaluer PCRTag présence / absence d&#39;amplicons par électrophorèse sur gel d&#39;agarose. Cependant, avec une densité de PCRTag amplicon une moyenne de 1,5 kb et par agenome taille de ~ 12 Mo, le génome de Sc2.0 complété va encoder environ 8.000 PCRTags. Pour améliorer le débit, nous avons développé un test de détection basé sur la PCR en temps réel pour le génotypage PCRTag que nous appelons analyse qPCRTag. Le flux de travail spécifie 500 réactions nl dans une plaque multipuits 1536, ce qui nous permet de tester jusqu&#39;à 768 PCRTags avec les deux paires synthétiques et sauvages de type amorce dans une seule expérience.

Nous avons testé synthétique et sauvage de type chromosome 3 PCRTag des paires d&#39;amorces 1 avec l&#39;ADN génomique de levure (de ADNg) extraite de quatre souches différentes. Chromosome 3 dispose de 186 PCRTag paires d&#39;amorces qui couvrent la longueur du chromosome (synIII est ~ 270 kb et de type sauvage chromosome 3 est ~ 315 ko). Pour tester chacune des quatre souches avec deux jeux d&#39;amorces, nous avons divisé la plaque multi-puits en quatre quadrants, un pour chaque type de ADNg, attribuant amorces PCRTag synthétiques à la moitié supérieure de chaque quadrant et de type sauvage à la moitié inférieure. L&#39;ADN génomique a été extrait à partir des souches de levure, dont deux codent type sauvage chromosome 3 (de type sauvage, synIXR 2), tandis que les deux codent chromosome restant synthétique 3 (synIII 1, synIII synIXR). qPCR Master Mix a été distribué dans chaque puits d&#39;une plaque multipuits 1536 en utilisant un distributeur de liquide en vrac, suivie par ADNg et PCRTag amorces en utilisant les Echo 550. amorces étaient vêtus à l&#39;identique danschaque quadrant de la plaque multi-puits pour la comparaison visuelle facile. La plaque multi-puits a ensuite été scellé à chaud avec joint optiquement clair et soumis à une analyse PCR en temps réel. Dans cette expérience, nous avons observé qPCRTag, pour la plupart, l&#39;amplification comme prévu, de sorte que des amorces de synthèse exclusivement amplifiés de l&#39;ADN synthétique et vice versa (figures 2 et 3). Cependant, nous avons également observé plusieurs écarts par rapport à la tendance, ce qui suggère des faux négatifs et de faux positifs dans l&#39;ensemble de données. Dans cette expérience, le contrôle de maître a été détecté dans 100% des puits, indiquant le distributeur de vrac liquide distribué avec succès mastermix dans tous les puits sur la plaque (données non présentées). Cela exclut une source potentielle de faux négatifs. En outre, certains chromosomes 3 PCRTags sont connus à l&#39;échec (représenté sur les figures S6 et S7 de Annaluru et al. 1), comprenant au moins deux SYN et une WTdes paires d&#39;amorces; Ainsi, ces puits peuvent être ignorés dans chaque quadrant. Les vrais faux négatifs pourraient découler d&#39;un manque de transfert de ADNg de modèle ou amorces, cependant, dans notre expérience, compte tenu de la calibration correcte de l&#39;Echo 550 ainsi que la préparation d&#39;ADNg et des amorces telles que décrites, cela n&#39;a pas été une source importante d&#39;erreur. Globalement dans cette expérience le taux de faux négatifs était extrêmement faible pour les amorces WT avec WT gabarit (~ 2%), même si un peu plus élevé pour les amorces SYN SYN avec l&#39;ADN (~ 8%). Les faux positifs, la détection du signal dans les puits où les amorces sont mélangées avec SYN WT ADNg (et vice versa), peuvent résulter de l&#39;amplification croix ou des dimères d&#39;amorces. En effet, les dimères d&#39;amorces sont souvent visibles par électrophorèse sur gel (figure 1B) et représentent une source d&#39;erreur raisonnable. Pour l&#39;application de qPCR, l&#39;examen des courbes de fusion peut être utile pour déterminer si les différentes espèces, telles que des dimères d&#39;amorces, peuvent contribuer à un signal. En outre, performer une expérience de contrôle dans lequel les amorces sont distribués en l&#39;absence de matrice d&#39;ADN peuvent aider à identifier les amorces avec une propension à se dimériser. Cross amplification peut être observée par électrophorèse sur gel, en particulier si un trop grand nombre de cycles de PCR sont réalisées ou si la température de recuit est trop faible. Nous avons essayé de minimiser le nombre de faux positifs en raison de l&#39;amplification croix en optimisant ces deux paramètres pour le protocole qPCRTag. Enfin, en examinant les valeurs point de passage (Cp) pour chaque puits peut aider à identifier des amorces qui ne sont pas adaptés à la détection en temps réel sur la base (Figure 3, par exemple, BB22, FB22, Bb46, FB46). Globalement dans cette expérience le taux de faux positifs était faible pour les amorces SYN avec WT gabarit (~ 5%) et plus élevé pour les amorces WT avec SYN gabarit (~ 10%). <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52941/52941fig2.jpg" /> Figure 2: Plaque carte de chaleur figurent présence / abappel sence d&#39;une expérience qPCRTag. Quatre types différents de l&#39;ADN génomique (quadrants séparés par des lignes blanches continues) ont été soumis à une analyse PCRTag utilisant synthétique (SYN) et de type sauvage (WT) chromosome 3 amorces PCRTag (pointillés lignes blanches pour séparer SYN (en haut ) et WT (en bas) dans chaque quadrant). WT et synIXR gDNA codent type sauvage chromosome 3, ce qui donne une amplification avec des amorces WT PCRTag. SynIII et synIII synIXR gDNA codent chromosome synthétique 3, ce qui donne une amplification avec des amorces SYN PCRTag. Amorces sont disposées selon leur positionnement chromosomique de gauche à droite et positionnés de manière identique dans les quatre quadrants pour la comparaison. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52941/52941fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52941/52941fig3.jpg" /> Figure 3: chaleur à plaquescarte affichant point de passage (Cp) valeur pour une expérience qPCRTag. Ceci est le même ensemble de données comme dans la figure 2 et le plan de plaque est donc identique. N / A se réfère à «pas d&#39;amplification. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52941/52941fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

Watch this Scientific Journal Video about qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping at JoVE.com

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

Analyse qPCRTag - un débit élevé, PCR temps réel pour Sc2.0 Génotypage

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

qpcrtag-analysis-high-throughput-real-time-pcr-assay-for-sc20

Research

JoVE Journal

Biology

16.8K vues.  Institute for Systems Genetics. Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

Vidéo: qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Un neuronale et astrocytes de co-culture de dosage pour l&#39;analyse du contenu haute de la neurotoxicité

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Recherche

Biologie

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

Quantitative PCR en temps réel utilisant le Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB continues to spread rapidly and attacks ash trees of different ages, from saplings to mature trees. However, to date very little or no molecular knowledge exists for EAB. We are interested in deciphering the molecular-based physiological processes at the tissue level that aid EAB in successful colonization of ash trees. In this report we show the effective use of quantitative real-time PCR (qRT-PCR) to ascertain mRNA levels in different larval tissues (including midgut, fat bodies and cuticle) and different developmental stages (including 1st-, 2nd-, 3rd-, 4th-instars, prepupae and adults) of EAB. As an example, a peritrophin gene (herein named, AP-PERI1) is exemplified as the gene of interest and a ribosomal protein (AP-RP1) as the internal control. Peritrophins are important components of the peritrophic membrane/matrix (PM), which is the lining of the insect gut. The PM has diverse functions including digestion and mechanical protection to the midgut epithelium.

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) is an effective tool to diagnose mRNA levels in different insect tissues and developmental stages. In this report we show the use of qRT-PCR to ascertain mRNA levels in different larval tissues and developmental stages of the invasive insect species, emerald ash borer.

Analyse de l&#39;expression génique dans l&#39;agrile du frêne ( Agrilus planipennis) En utilisant quantitative en temps réel-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower detection limit compared to other methods of gene expression profiling while using smaller amounts of input for each assay.  Automated qPCR setup has improved this field by allowing for greater reproducibility.  Its convenient and rapid setup allows for high-throughput experiments, enabling the profiling of many different genes simultaneously in each experiment.  This method along with internal plate controls also reduces experimental variables common to other techniques.  
We recently developed a qPCR assay for profiling of pre-microRNAs  (pre-miRNAs) using a set of 186 primer pairs.  MicroRNAs have emerged as a novel class of small, non-coding RNAs with the ability to regulate many mRNA targets at the post-transcriptional level.  These small RNAs are first transcribed by RNA polymerase II as a primary miRNA (pri-miRNA) transcript, which is then cleaved into the precursor miRNA (pre-miRNA).  Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm where Dicer cleaves the hairpin loop to yield mature miRNAs.  Increases in miRNA levels can be observed at both the precursor and mature miRNA levels and profiling of both of these forms can be useful.  There are several commercially available assays for mature miRNAs; however, their high cost may deter researchers from this profiling technique.  Here, we discuss a cost-effective, reliable, SYBR-based qPCR method of profiling pre-miRNAs.  Changes in pre-miRNA levels often reflect mature miRNA changes and can be a useful indicator of mature miRNA expression.  However, simultaneous profiling of both pre-miRNAs and mature miRNAs may be optimal as they can contribute nonredundant information and provide insight into microRNA processing.  Furthermore, the technique described here can be expanded to encompass the profiling of other library sets for specific pathways or pathogens.

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

We will demonstrate the setup and analysis of pre-microRNA 96-well arrays for QPCR using a robot as well as by hand with a Thermo Scientific Matrix multichannel pipette.

Profilage de la pré-micro ARNs et micro-ARN en utilisant quantitative PCR en temps réel (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing a biorefinery. These raw materials would constitute a new industrial platform, which is both sustainable and carbon neutral, to replace 
the current dependency on fossil fuel. The recalcitrance to deconstruction observed in lignocellulosic materials is produced by several intrinsic properties 
of plant cell walls. Crystalline cellulose is embedded in matrix polysaccharides such as xylans and arabinoxylans, and the whole structure is encased by the 
phenolic polymer lignin, that is also difficult to digest 1. In order to improve the digestibility of plant materials we need to discover the main bottlenecks 
for the saccharification of cell walls and also screen mutant and breeding populations to evaluate the variability in saccharification 2. These tasks require 
a high throughput approach and here we present an analytical platform that can perform saccharification analysis in a 96-well plate format. This platform has 
been developed to allow the screening of lignocellulose digestibility of large populations from varied plant species. We have scaled down the reaction volumes 
for gentle pretreatment, partial enzymatic hydrolysis and sugar determination, to allow large numbers to be assessed rapidly in an automated system.
This automated platform works with milligram amounts of biomass, performing ball milling under controlled conditions to reduce the plant 
materials to a standardised particle size in a reproducible manner. Once the samples are ground, the automated formatting robot dispenses specified and recorded 
amounts of material into the corresponding wells of 96 deep well plate (Figure 1). Normally, we dispense the same material into 4 wells to have 4 replicates for 
analysis. Once the plates are filled with the plant material in the desired layout, they are manually moved to a liquid handling station (Figure 2). In this 
station the samples are subjected to a mild pretreatment with either dilute acid or alkaline and incubated at temperatures of up to 90&deg;C. The pretreatment solution 
is subsequently removed and the samples are rinsed with buffer to return them to a suitable pH for hydrolysis. The samples are then incubated with an enzyme
mixture for a variable length of time at 50&deg;C. An aliquot is taken from the hydrolyzate and the reducing sugars are automatically determined by the MBTH 
colorimetric method.

A simple, rapid method for determining the saccharification potential of large numbers of plant biomass samples is described. The automated platform for this analysis involves the preparation of the plant biomass for analysis in 96 well plates and the subsequent performance of pretreatment, hydrolysis and quantification of the sugars released.

Assay saccharification haut débit pour les matériaux lignocellulosiques

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in 73 different countries throughout Africa, Asia, Europe, New Zealand, Oceania and the Americas1-2. Cogongrass forms rapidly-spreading, monodominant stands that displace a large variety of native plant species and in turn threaten the native animals that depend on the displaced native plant species for forage and shelter. To add to the problem, an ornamental variety [I. cylindrica var. koenigii (Retzius)] is widely marketed under the names of Imperata cylindrica 'Rubra', Red Baron, and Japanese blood grass (JBG). This variety is putatively sterile and noninvasive and is considered a desirable ornamental for its red-colored leaves. However, under the correct conditions, JBG can produce viable seed (Carol Holko, 2009 personal communication) and can revert to a green invasive form that is often indistinguishable from cogongrass as it takes on the distinguishing characteristics of the wild-type invasive variety4 (Figure 1). This makes identification using morphology a difficult task even for well-trained plant taxonomists. Reversion of JBG to an aggressive green phenotype is also not a rare occurrence. Using sequence comparisons of coding and variable regions in both nuclear and chloroplast DNA, we have confirmed that JBG has reverted to the green invasive within the states of Maryland, South Carolina, and Missouri. JBG has been sold and planted in just about every state in the continental U.S. where there is not an active cogongrass infestation. The extent of the revert problem in not well understood because reverted plants are undocumented and often destroyed.
Application of this molecular protocol provides a method to identify JBG reverts and can help keep these varieties from co-occurring and possibly hybridizing. Cogongrass is an obligate outcrosser and, when crossed with a different genotype, can produce viable wind-dispersed seeds that spread cogongrass over wide distances5-7. JBG has a slightly different genotype than cogongrass and may be able to form viable hybrids with cogongrass. To add to the problem, JBG is more cold and shade tolerant than cogongrass8-10, and gene flow between these two varieties is likely to generate hybrids that are more aggressive, shade tolerant, and cold hardy than wild-type cogongrass. While wild-type cogongrass currently infests over 490 million hectares worldwide, in the Southeast U.S. it infests over 500,000 hectares and is capable of occupying most of the U.S. as it rapidly spreads northward due to its broad niche and geographic potential3,7,11. The potential of a genetic crossing is a serious concern for the USDA-APHIS Federal Noxious Week Program. Currently, the USDA-APHIS prohibits JBG in states where there are major cogongrass infestations (e.g., Florida, Alabama, Mississippi). However, preventing the two varieties from combining can prove more difficult as cogongrass and JBG expand their distributions. Furthermore, the distribution of the JBG revert is currently unknown and without the ability to identify these varieties through morphology, some cogongrass infestations may be the result of JBG reverts. Unfortunately, current molecular methods of identification typically rely on AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms) and DNA sequencing, both of which are time consuming and costly. Here, we present the first cost-effective and reliable PCR-based molecular genotyping method to accurately distinguish between cogongrass and JBG revert.

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

We provide a cost-effective and rapid molecular genotyping protocol that employs variety-specific PCR primers that target DNA sequence differences within the chloroplast trnL-F spacer region to differentiate between varieties of Imperata cylindrica (cogongrass) that cannot be distinguished by morphology alone. These varieties include the federally listed noxious weed, cogongrass and closely-related, wide-spread ornamental variety, I. cylindrica var. koenigii (Japanese blood grass).

Une méthode de génotypage basé sur la PCR pour distinguer les variétés de type sauvage et les plantes ornementales de Imperata cylindrica</em

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in ...

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping project is to collect a tissue sample from each individual plant. The traditional approach to this task is to sample plants one-at-a-time. If one wishes to genotype hundreds or thousands of individuals, however, using this strategy results in a significant bottleneck in the genotyping pipeline. The Ice-Cap method that we describe here provides a high-throughput solution to this challenge by allowing one scientist to collect tissue from several thousand seedlings in a single day 1,2. This level of throughput is made possible by the fact that tissue is harvested from plants 96-at-a-time, rather than one-at-a-time.
The Ice-Cap method provides an integrated platform for performing seedling growth, tissue harvest, and DNA extraction. The basis for Ice-Cap is the growth of seedlings in a stacked pair of 96-well plates. The wells of the upper plate contain plugs of agar growth media on which individual seedlings germinate. The roots grow down through the agar media, exit the upper plate through a hole, and pass into a lower plate containing water. To harvest tissue for DNA extraction, the water in the lower plate containing root tissue is rapidly frozen while the seedlings in the upper plate remain at room temperature. The upper plate is then peeled away from the lower plate, yielding one plate with 96 root tissue samples frozen in ice and one plate with 96 viable seedlings. The technique is named "Ice-Cap" because it uses ice to capture the root tissue. The 96-well plate containing the seedlings can then wrapped in foil and transferred to low temperature. This process suspends further growth of the seedlings, but does not affect their viability. Once genotype analysis has been completed, seedlings with the desired genotype can be transferred from the 96-well plate to soil for further propagation. We have demonstrated the utility of the Ice-Cap method using Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings. We expect that the method should also be applicable to other species of plants with seeds small enough to fit into the wells of 96-well plates.

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

The Ice-Cap method allows one to grow plants in 96-well plates and non-destructively harvest root tissue from each seedling. DNA extracted from this root tissue can be used for genotyping reactions. We have found that Ice-Cap works well for Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings.

Ice-Cap: un procédé de croissance Arabidopsis Et plants de tomates dans des plaques à 96 puits pour génotypage à haut débit

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

Le poisson zèbre rapide et efficace génotypage utilisant la PCR avec haute résolution Melt analyse

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design1,2. Here, a peptide-MHC II binding assay is scaled to 384-well format. The scaled down protocol reduces reagent costs by 75% and is higher throughput than previously described 96-well protocols1,3-5. Specifically, the experimental design permits robust and reproducible analysis of up to 15 peptides against one MHC II allele per 384-well ELISA plate. Using a single liquid handling robot, this method allows one researcher to analyze approximately ninety test peptides in triplicate over a range of eight concentrations and four MHC II allele types in less than 48 hr. Others working in the fields of protein deimmunization or vaccine design and development may find the protocol to be useful in facilitating their own work. In particular, the step-by-step instructions and the visual format of JoVE should allow other users to quickly and easily establish this methodology in their own labs.

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design. &#160;Here, a peptide-MHC II binding assay scaled to 384-well plates is described. This cost effective format should prove useful in the fields of protein deimmunization and vaccine design and development.

Un essai de liaison à haut débit CMH II pour l&#39;analyse quantitative du peptide épitopes

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Haut-débit criblage de modulateurs chimique des gènes post-transcriptionnelle réglementées

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...