We thank the Italian Neuroblastoma Foundation for the full financial support to this project.

NOTE: Le débit de ces systèmes de dosage dépend de l&#39;équipement de laboratoire HTS disponibles. Ce protocole est facilitée par une EVO 200 robots Tecan Freedom, qui effectue la manipulation de liquides en format 96 puits. Miniaturisation au format 384 puits est également possible. Le système de manipulation de liquide robotisé est positionné sous une hotte à flux laminaire afin de maintenir des conditions aseptiques au cours de toutes les mesures expérimentales. Si aucune automatisation de liquide de traitement est disponible, le protocole peut être facilement adapté au format à faible débit. Dépistage primaire 1. Jour 1: Préparer et cellules de semences REMARQUE: Les cellules de semences à un rendement de 80% de confluence au moment de dosage de l&#39;activité de la luciférase, ce est à dire, 48 h après l&#39;ensemencement. <ol><li> Remettre en suspension les cellules de neuroblastome trypsinisées CHP134-mycn3UTR à une concentration de 2 x 10 5 cellules / ml dans du milieu RPMI contenant 10% de FBS et 1% de L-glutamine. Pour 27 plaques préparer au moins 250 ml de<html> suspension cellulaire en tenant manipulation de liquides de compte, rigoles volumes morts et les étapes de pipetage répétées. Verser la suspension cellulaire dans le réservoir stérile et placez-le sur le bureau de robot. </li><li> Placez 9 à code-barres blanches plaques à 96 puits à fond plat et une boîte de 200 pi embouts de pipette stériles sur le bureau de robot. Mélanger la suspension de cellules par pipetage avant chaque étape de distribution pour éviter des cellules de décantation par gravité. Distribuer 75 pi de cellules dans chaque puits de plaques 9 pour obtenir une densité finale de 1,5 x 10 4 cellules par puits. </li><li> Couvrir les plaques avec les couvercles et les laisser à l&#39;extérieur de l&#39;incubateur pendant 30 minutes pour permettre aux cellules de sédimenter au fond du puits. Ceci permet de minimiser les effets de bord. </li><li> Répétez les étapes 1.2 et 1.3 à deux reprises afin de préparer un nombre total de 27 plaques. </li><li> Placer les plaques à 37 ° C et 5% de CO 2 et incuber pendant 24 heures. </li></ol> 2. Jour 2: traiter les cellules avec des composés Bibliothèque MÉNAGEMENT &quot;&gt; Remarque: La petite bibliothèque de molécules de spectre Collection consiste en 2000 composés disposées en 8 rangées et 10 colonnes de 25 plaques à 96 puits à la concentration de 10 mM dans le DMSO Les puits sur les première et dernière colonnes sont laissés vides pour les contrôles. . essais de criblage de composés sont généralement effectuées à 1-10 uM concentration du composé 8. Le protocole de dépistage décrit ici fixe 2 uM que la concentration de travail et 24 heures que le point de fin de dosage. <ol><li> Décongeler neuf plaques de bibliothèque composé à la température ambiante. </li><li> Préparer deux creux avec du PBS stérile et% des solutions de DMSO-0,5 PBS et placez-les sur le bureau de robot. Pour chaque plaque bibliothèque, préparer et marquer en conséquence une plaque de dilution - d&#39;un polypropylène de plaque à 96 puits à fond en U avec un volume de travail d&#39;au moins 400 ul. Remplir chaque puits de colonnes 2-11 de plaques de dilution avec 398 pi de PBS stérile en utilisant les conseils fixes du gestionnaire liquide. Remplir les colonnes 1 et 12 avec 50 pi de PBS stérileavec 0,5% de DMSO de façon à reproduire la concentration en véhicule dans les puits témoins (0,02%). </li><li> Placez deux plaques bibliothèque, les plaques de dilution étiquetés en conséquence, deux boîtes de 50 ul embouts de pipette stérile et six cellules plaques sur le bureau de robot. Découvrez cellules plaques. </li><li> Pipet 2 ul de la solution mère 10 mM de l&#39;une des deux plaques de la bibliothèque dans la plaque de dilution correspondant et bien mélanger. Cela se traduira par une concentration des composés intermédiaires de 50 uM. En utilisant la même série de conseils, passer 3 pi de la dilution de 50 uM dans 3 plaques à 96 puits avec des cellules blanches à code-barres. Cette dilution des résultats du régime en deux uM concentration de chaque composé testé de travail. REMARQUE: Pour éviter les manipulations inutiles avec les conseils, utilisez un ensemble complet de 96 conseils dès le début, même si les plaques de la bibliothèque ne contiennent que 80 composés. Ceci est possible car la première et la dernière colonne des plaques de bibliothèques sont vides. </li><li> Remplacez les embouts de pipette et répéter Step 2,4 pour la deuxième plaque de bibliothèque. </li><li> Couvrir les plaques de cellules et de les retourner à l&#39;incubateur pendant 24 heures. </li><li> Répéter les étapes 2.3 à 2.6 plus deux fois pour les plaques de bibliothèque restantes. </li></ol> 3. Jour 3: Effectuez Luciferase Assay REMARQUE: Avant d&#39;effectuer le dosage de la luciférase, il est possible de multiplexer avec un dosage de viabilité cellulaire basé sur la réduction de la résazurine pour obtenir un indice de la viabilité des cellules de chaque puits 9. Multiplexage luciférase et test de viabilité résultats d&#39;analyses dans une réduction de signal de la luciférase qui, cependant, peut être ignoré si les cellules fournissent de haut niveau de l&#39;activité luciférase assez. L&#39;activité luciférase peut être détectée par une variété de réactifs de dosage de luciférase 10,11 commerciales et artisanales avec signal luminescent stable. <ol><li> Équilibrer le réactif de luciférase de choix reconstitué à température ambiante. Assurez-vous que le volume est suffisant pour toutes les plaques dosées. Pour 27 plaques 170 ml de réactif de luciférase devront tenant manipulation de liquide de compte, auges volume mort et des étapes répétées de pipetage. Verser le réactif de luciférase dans un réservoir et placez-le sur le bureau de robot. </li><li> Retirer neuf plaques avec des cellules de l&#39;incubateur, placez-les sur le bureau de robot, découvrir et attendre équilibrée à la température ambiante. Ajouter 50 ul du réactif de luciférase par plaque et par la plaque. Entre les plaques, introduire un retard égal au temps de lecture de la luminescence une plaque. Ceci garantit que toutes les plaques sont mesurées à l&#39;intérieur de l&#39;intervalle de temps égal à partir de l&#39;addition des réactifs. </li><li> Après une incubation de 30 min, placer la première plaque dans le luminomètre et mesurer la luminescence après une brève étape secouant. Répétez l&#39;opération pour toutes les plaques. Enregistrer le code-barres de chaque plaque et l&#39;associer au fichier de données correspondant pour éviter les erreurs résultant d&#39;un grand nombre de plaques traitées. </li><li> Répétez les étapes 3.2 à 3.3 deux fois pour les 18 autres plaques avec des cellules. </li&gt; <li> Recueillir le réactif de luciférase restant et le stocker à -20 ° C. </li></ol> 4. Jour 4: Analyse des données <ol><li> Processus données expérimentales en utilisant la normalisation de tous les échantillons à la moyenne des contrôles sur plaque traités avec le véhicule. Pour chaque composé bibliothèque, calculer la valeur moyenne de x et SD sur triple. </li><li> Sélectionnez jusqu&#39;à-régulation et la régulation négative de résultats en fixant un seuil de X ± k × SD, où le X de valeur moyenne et SD sont calculés sur toutes les valeurs d&#39;essai transformé, et k est une constante définie. </li><li> Sélectionnez un seuil arbitraire de coupure &lt;20% des témoins traités avec le véhicule quand une réduction de signal de la luciférase est probablement associée à la toxicité de composé. Jeter les résultats ci-dessous de ce seuil permettra de réduire considérablement un certain nombre de hits faux-positifs dans le contre-dépistage. REMARQUE: Au lieu de normalisation axée sur le contrôle, les données expérimentales peuvent être traitées application score Z ou son analogue robuste B snoyau 12. En outre, les approches statistiques alternatives pour la sélection de succès sont disponibles 12. </li></ol> 5. Contre-dépistage NOTE: Les composés identifiés dans l&#39;écran primaire (étiquetés «hits») sont confirmées et évalués pour la spécificité par une contre-dépistage. <ol><li> Cerise choisir les résultats sélectionnés des aliquotes stockées dans des tubes à code-barres 2D simples et créer de nouveaux &quot;a frappé plaques&quot;, sauvant la mise en page correspondante. Ne oubliez pas de laisser positions libres pour les contrôles. NOTE: En l&#39;absence d&#39;un système picorage efficace, on pourrait tester à la fois le contrôle et la 3 &#39;UTR cellules porteuses en parallèle dans le dépistage primaire. Dans ce cas, la sélection spécifique de composés ayant des effets sur la charge seulement introduit 3 &#39;UTR sera possible après la projection primaire qui élimine la nécessité de contre-dépistage. Cependant, la projection parallèle dans deux lignées cellulaires doublera le dosagecoûts. </li><li> En suivant le protocole pour le dépistage primaire (section &quot;Jour 1: Préparer et cellules de semences»), pour chaque «plaque hit&quot; préparer trois plaques à 96 puits de chaque cellules stables CHP134-mycn3UTR et CHP134-CTRL. </li><li> En suivant le protocole pour le dépistage primaire (section «Jour 2: traiter les cellules avec Bibliothèque composés&quot;), utiliser chaque plaque de succès pour traiter trois CHP134-mycn3UTR et trois plaques CHP134-CTRL à 2 uM concentration de travail. NOTA: L&#39;écran du compteur décrit ici est réalisée en triple à la dose unique de 2 uM, il pourrait être avantageux de remplacer les répétitions standard et tester les résultats dans trois concentrations aussi des dilutions de 10 fois allant de 2 pM à 20 nM. L&#39;application de cette approche permettrait non seulement de confirmer les données de l&#39;écran primaire, mais aussi d&#39;obtenir des données préliminaires dose-réponse sur les résultats primaires, en minimisant les taux de faux-positifs. Dans ce cas, un pipeline d&#39;analyse différente doit être applied pour traiter les données expérimentales et confirmer les résultats. </li><li> En suivant le protocole pour le dépistage primaire (section «Jour 3: Effectuez Luciferase Assay&quot;), mesurer l&#39;activité de la luciférase dans toutes les plaques CHP134-mycn3UTR et CHP134-CTRL. </li><li> En suivant le protocole pour le dépistage primaire (section «Jour 4: Analyse des données&quot;), normaliser les données expérimentales de puits traités à la moyenne des sur-plaque contrôles traités avec le véhicule et calculer la moyenne et l&#39;écart par rapport aux répétitions. Pour chaque composé testé, calculer le facteur de variation de l&#39;activité luciférase dans CHP134-mycn3UTR vs cellules CHP134-CTRL. Sélectionnez arbitraire changement fois les seuils de&gt; 1,5 et la signification des valeurs p de &lt;0,01. NOTE: Dans les paramètres de dosage décrites le paramètre déterminant pour la spécificité de succès est un facteur de variation significative de l&#39;activité luciférase dans CHP134-mycn3UTR vs cellules CHP134-CTRL. Si nécessaire, on peut également évaluer la toxicité composé en effectuant en même temps un test de viabilité cellulaire sur la SEcomposés tionné. Cela pourrait être particulièrement bénéfique si les résultats primaires sont contre-examinés dans une analyse dose-réponse. Pour une dose unique, notre expérience indique une forte corrélation de l&#39;activité luciférase réduite à une diminution de la viabilité des cellules 6. Par conséquent, une diminution de l&#39;activité luciférase dans les cellules cibles ainsi que des cellules de commande peut être considérée comme un indicateur de la toxicité du composé à la concentration testée. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

This protocol describes a cell-based reporter-gene assay aiming at the identification of modulators that target 3&#8217; UTR-dependent post-transcriptional processes. It encompasses the primary screening and the counter-screen and, if needed, can be accompanied by a cytotoxicity assay. The outcome of the primary screening is a number of valuable candidate compounds, whose reproducibility and specificity is further validated in the counter-screening.
The identification of primary hits is based ...

Pendant une longue période régulation transcriptionnelle de l&#39;expression génique a été pensé pour jouer un rôle majeur si ce ne est le rôle exclusif dans le contrôle de la production de protéines. L&#39;accumulation de preuves, cependant, indique que régulation post-transcriptionnelle contribue autant, sinon plus, que, la régulation transcriptionnelle de déterminer protéine cellulaire abondance 1,2. Contrôle post-transcriptionnelle de l&#39;expression génique est beaucoup plus complexe et élaborée que fut d&#39;abord pensée. En fait, toutes les différentes étapes de contrôle post-transcriptionnel ont émergé pour être réglementés, y compris le traitement de l&#39;ARNm, la localisation, le chiffre d&#39;affaires, la traduction 3 ainsi que l&#39;ARN réversible méthylation 4 nouvellement décrit. De nombreux processus de régulation post-transcriptionnels potentiellement affectés, le dosage décrit ci-dessous se concentre sur celles impliquant &#39;non traduite (3&#39; UTR de l&#39;ARNm 3). 3 &#39;UTR affecte globalement ARNm sort principalement par interaction spécifique de pr liaison à l&#39;ARNoteins et ARN non-codants à ses séquences régulatrices et / ou structures secondaires 5. Par conséquent, de petites molécules qui modifient ces interactions ou interfèrent avec en amont des voies de transduction du signal se déplacera l&#39;équilibre qui régit abondance des protéines. Cette approche thérapeutique est d&#39;une importance particulière pour les pathologies humaines pour lesquelles la preuve existe montrant que des gènes de maladies pertinents sont soumis à régulation post-transcriptionnelle, qui représente ainsi une cible potentielle pour une intervention pharmacologique. Par conséquent, les systèmes permettant le dépistage des modulateurs de niveaux d&#39;ARNm par interférence avec les mécanismes de contrôle post-transcriptionnel dans un format à haut débit peuvent devenir des outils précieux dans l&#39;identification de nouveaux traitements potentiels. Le dosage de gène rapporteur à base de cellules décrit permet l&#39;identification de composés capables de moduler l&#39;ARNm sort par des mécanismes dépendant de son extrémité 3 &#39;UTR. Il se compose de plusieurs c principaleomposantes (Figure 1) et nécessite quelques étapes préliminaires pour valider la faisabilité de l&#39;essai. Tout d&#39;abord, la construction de rapporteur est conçu pour inclure l&#39;UTR en 3 &#39;d&#39;un gène d&#39;intérêt. La 3 &#39;UTR est fusionnée à l&#39;extrémité d&#39;un gène rapporteur tel que la luciférase de luciole (figure 1). Tout changement dans les mécanismes de contrôle post-transcriptionnel exercées par la inséré 3 &#39;UTR vont modifier la stabilité et / ou l&#39;efficacité de traduction de ce transcrit chimérique, résultant en des niveaux de luciférase variés. Par conséquent, des changements dans l&#39;activité de luciférase servent comme mesure indirecte de la régulation post-transcriptionnelle affectée du gène d&#39;intérêt. Le deuxième composant du système est une construction rapporteur témoin, un plasmide d&#39;expression qui exprime identique le même gène rapporteur, mais ne contient pas de 3 &#39;UTR. Les deux plasmides rapporteurs peuvent être conçus dans le laboratoire en utilisant les protocoles classiques de biologie moléculaire ou achetés auprès de sources commerciales. La sélection d&#39;une lignée cellulaire appropriée est essentielle pour la construction de dosage. Quelle ligne de cellule est le modèle optimal dépend de nombreux facteurs, allant des exigences cliniques comme ressemblance maximale à la pathologie à des questions pratiques comme juste caractéristiques disponibilité, transfectabilité, et de croissance. Il est important, avant de procéder il faut se assurer que la fusion des 3 &#39;UTR du gène rapporteur a un effet attendu sur le niveau de la transcription chimérique. L&#39;absence de différence significative dans le signal de la luciférase à partir de la 3 &#39;UTR-palier et le contrôle constructions rapporteurs transfecté de manière transitoire dans les cellules sélectionnées indiquerait que la 3&#39; UTR ne est pas fonctionnelle dans ce modèle cellulaire, ce qui incite à rechercher d&#39;autres possibles. Pour le format à haut débit, les 3 &#39;UTR-porteurs et de contrôle luciférase constructions rapporteurs devraient être intégrés de manière stable dans la lignée cellulaire choisie. Utilisation d&#39;un intégré de manière stable sur transitoirement transfectéeslignée cellulaire est préférable pour plusieurs raisons. Cela élargira le choix d&#39;un modèle cellulaire incluant des lignées cellulaires difficiles à transfecter, diminuer la variabilité dans les données découlant des fluctuations de l&#39;efficacité de transfection, calmer les coûts. En outre, sur les cellules de transfection transitoire sont très souvent surchargé avec un plasmide d&#39;ADN qui conduit à la saturation du système. Dans ces paramètres une nouvelle augmentation de l&#39;expression de journaliste peut être difficile, entraînant une diminution de sensibilité à l&#39;égard des composés de régulation positive potentiels. Enfin, lorsque tous les composants d&#39;analyse sont mis en place, il est essentiel avant de passer au format à haut débit afin de déterminer la faisabilité de l&#39;essai, ce est à dire, si l&#39;activité luciférase peut être fait en amont et en réglementation spécifique via le inséré 3 &#39; UTR. Les meilleurs contrôles seraient rapportés de petites molécules pour moduler la stabilité de l&#39;ARNm ou traduisibilité par UTR en 3 &#39;d&#39;intérêt. Si ceux-ci est ayantpas possible, les contrôles de substitution imitant l&#39;effet désiré sont acceptées. Il peut se agir miARN ou des protéines liant l&#39;ARN connus pour exercer leurs effets en se liant à la 3 &#39;UTR de l&#39;intérêt. L&#39;évaluation de ces contrôles avant la projection primaire indique non seulement la fonctionnalité de l&#39;essai développé, mais permet également à l&#39;estimation de sa gamme dynamique, la sensibilité et la performance dans le format à haut débit. En utilisant le protocole décrit nous avons criblé une bibliothèque composé 6-2000. Neuroblastome, la tumeur solide extra plus courante de l&#39;enfance, a été utilisé comme un modèle biologique et 3 &#39;UTR de l&#39;oncogène MYCN, dont l&#39;amplification prédit fortement issue défavorable du neuroblastome, comme un gène cible 7. La figure 2 présente les dispositif expérimental. La projection a été divisée en trois courses avec la taille du lot de 27 plaques projetés en une seule fois. Le lot de 27 plaques inclus bibliothèque Spectrum Collectionplaques n.1-n.8 + n.25 (première manche), n.9-n.16 + n.25 (deuxième manche) et n.16-n.24 + n.25 (troisième terme), chaque plaque projeté en trois exemplaires. Ainsi, une plaque de la bibliothèque (n.25) a été dosé dans les trois courses rendant possible la comparaison inter-terme. Le protocole ci-dessous décrit une seule série de neuf plaques de bibliothèque testés en triple exemplaire.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="786">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:239px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Culture plate 96-well White</td>
			<td style="width:239px;">PerkinElmer</td>
			<td align="right" style="width:119px;">6005688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">StorPlate 96-well U bottom (dilution plate)</td>
			<td style="width:239px;">PerkinElmer</td>
			<td align="right" style="width:119px;">6008190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">100 ml disposable trough for reagents</td>
			<td style="width:239px;">Tecan</td>
			<td>10 613 048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">300 ml disposable robotic reservoir</td>
			<td style="width:239px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">PB12001301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Robot tips DITI 50&#956;L Sterile</td>
			<td style="width:239px;">Tecan</td>
			<td align="right" style="width:119px;">30038607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Robot tips DITI 200&#956;L Sterile</td>
			<td style="width:239px;">Tecan</td>
			<td align="right" style="width:119px;">30038617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrix 1.4 ml 2D Barcoded w, Flat Bottom Tubes</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right">3711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">ONE-Glo Luciferase Assay System&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E6120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">RPMI</td>
			<td style="width:239px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">BE12-918F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">PBS-1X, w/o Ca++, Mg++</td>
			<td style="width:239px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">BE17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">L-Glutamine 200mM</td>
			<td style="width:239px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">BE17-605E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">FBS</td>
			<td style="width:239px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">DE14-801F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">DMSO</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">The Spectrum collection (compound library)</td>
			<td style="width:239px;">MicroSource Discovery Systems</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Tecan Freedom EVO200 robot&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Tecan</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Tecan F200 multiplate reader&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Tecan</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput screening for chemical modulators of post-transcriptionally regulated genes

Les deux régulation transcriptionnelle et post-transcriptionnelle ont un impact profond sur l&#39;expression des gènes. Cependant, des essais de criblage à base de cellules couramment adoptées se concentrent sur la régulation transcriptionnelle, étant essentiellement destinées à l&#39;identification de molécules de promoteur-ciblage. En conséquence, des mécanismes post-transcriptionnels sont en grande partie non couvert par l&#39;expression du gène cible de développement de médicaments. Nous décrivons ici un essai à base de cellules visant à étudier le rôle de «région non traduite (3 &#39;UTR 3) dans la modulation du sort de son ARNm, et à identifier des composés capables de le modifier. Le dosage est basé sur l&#39;utilisation d&#39;une construction de rapporteur luciférase contenant la 3 &#39;UTR d&#39;un gène d&#39;intérêt intégré de façon stable dans une lignée cellulaire maladie pertinent. Le protocole est divisé en deux parties, avec l&#39;accent initial sur le dépistage primaire visant à l&#39;identification de molécules affectant l&#39;activité de la luciférase après 24 h de traitement. La seconde partie du protocoledécrit la contre-criblage nécessaire de discriminer composés modulant l&#39;activité de luciférase en particulier par la UTR 3 &#39;. En plus du protocole détaillé et des résultats représentatifs, nous fournissons des considérations importantes sur le développement de l&#39;essai et la validation du tube (s) sur la cible endogène. Le dosage du gène rapporteur décrit à base de cellules permettra aux scientifiques d&#39;identifier des molécules modulant les taux de protéines par des mécanismes post-transcriptionnel dépendant d&#39;un &#39;UTR 3.

En utilisant l&#39;approche décrite, nous avons criblé une bibliothèque 2000 composé de modulateurs potentiels de mécanismes de contrôle post-transcriptionnel exercée par la 3 &#39;UTR du gène N-MYC. La figure 3 illustre les résultats de l&#39;examen initial illustré par une plaque seule bibliothèque. signal de la luciférase affichée en pourcentage des contrôles traités avec le véhicule a été obtenu par mesure de l&#39;activité luciférase dans des plaques en triple des cellu...

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High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Haut-débit criblage de modulateurs chimique des gènes post-transcriptionnelle réglementées

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

high-throughput-screening-for-chemical-modulators-post

Research

JoVE Journal

Biology

9.1K vues.  University of Trento. Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3’ UTR.

Vidéo: High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

Criblage à haut débit et de biodétection avec fluorescent C. elegans Souches

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

Recherche

Biologie

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

Criblage à haut débit activité endoglucanase fongique dans les Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing a biorefinery. These raw materials would constitute a new industrial platform, which is both sustainable and carbon neutral, to replace 
the current dependency on fossil fuel. The recalcitrance to deconstruction observed in lignocellulosic materials is produced by several intrinsic properties 
of plant cell walls. Crystalline cellulose is embedded in matrix polysaccharides such as xylans and arabinoxylans, and the whole structure is encased by the 
phenolic polymer lignin, that is also difficult to digest 1. In order to improve the digestibility of plant materials we need to discover the main bottlenecks 
for the saccharification of cell walls and also screen mutant and breeding populations to evaluate the variability in saccharification 2. These tasks require 
a high throughput approach and here we present an analytical platform that can perform saccharification analysis in a 96-well plate format. This platform has 
been developed to allow the screening of lignocellulose digestibility of large populations from varied plant species. We have scaled down the reaction volumes 
for gentle pretreatment, partial enzymatic hydrolysis and sugar determination, to allow large numbers to be assessed rapidly in an automated system.
This automated platform works with milligram amounts of biomass, performing ball milling under controlled conditions to reduce the plant 
materials to a standardised particle size in a reproducible manner. Once the samples are ground, the automated formatting robot dispenses specified and recorded 
amounts of material into the corresponding wells of 96 deep well plate (Figure 1). Normally, we dispense the same material into 4 wells to have 4 replicates for 
analysis. Once the plates are filled with the plant material in the desired layout, they are manually moved to a liquid handling station (Figure 2). In this 
station the samples are subjected to a mild pretreatment with either dilute acid or alkaline and incubated at temperatures of up to 90&deg;C. The pretreatment solution 
is subsequently removed and the samples are rinsed with buffer to return them to a suitable pH for hydrolysis. The samples are then incubated with an enzyme
mixture for a variable length of time at 50&deg;C. An aliquot is taken from the hydrolyzate and the reducing sugars are automatically determined by the MBTH 
colorimetric method.

A simple, rapid method for determining the saccharification potential of large numbers of plant biomass samples is described. The automated platform for this analysis involves the preparation of the plant biomass for analysis in 96 well plates and the subsequent performance of pretreatment, hydrolysis and quantification of the sugars released.

Assay saccharification haut débit pour les matériaux lignocellulosiques

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in the brain, heart, skeletal muscle and endocrine tissue1,2. GIRK channels become activated following the binding of ligands (neurotransmitters, hormones, drugs, etc.) to their plasma membrane-bound, G protein-coupled receptors (GPCRs). This binding causes the stimulation of G proteins (Gi and Go) which subsequently bind to and activate the GIRK channel. Once opened the GIRK channel allows the movement of K+ out of the cell causing the resting membrane potential to become more negative. As a consequence, GIRK channel activation in neurons decreases spontaneous action potential formation and inhibits the release of excitatory neurotransmitters. In the heart, activation of the GIRK channel inhibits pacemaker activity thereby slowing the heart rate.
GIRK channels represent novel targets for the development of new therapeutic agents for the treatment neuropathic pain, drug addiction, cardiac arrhythmias and other disorders3. However, the pharmacology of these channels remains largely unexplored. Although a number of drugs including anti-arrhythmic agents, antipsychotic drugs and antidepressants block the GIRK channel, this inhibition is not selective and occurs at relatively high drug concentrations3.
Here, we describe a real-time screening assay for identifying new modulators of GIRK channels. In this assay, neuronal AtT20 cells, expressing GIRK channels, are loaded with membrane potential-sensitive fluorescent dyes such as bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol [DiBAC4(3)] or HLB 021-152 (Figure 1). The dye molecules become strongly fluorescent following uptake into the cells (Figure 1). Treatment of the cells with GPCR ligands stimulates the GIRK channels to open. The resulting K+ efflux out of the cell causes the membrane potential to become more negative and the fluorescent signal to decrease (Figure 1). Thus, drugs that modulate K+ efflux through the GIRK channel can be assayed using a fluorescent plate reader. Unlike other ion channel screening assays, such atomic absorption spectrometry4 or radiotracer analysis5, the GIRK channel fluorescent assay provides a fast, real-time and inexpensive screening procedure.

A real-time screening procedure for identifying drugs that interact with G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels is described. The assay utilizes membrane potential-sensitive fluorescent dyes to measure GIRK channel activity. This technique is adaptable for use on a number of cell lines.

Un test de dépistage fluorescent pour identifier des modulateurs de canaux Girk

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, atrial fibrillation, and pain1,2. For the most part, however, progress toward understanding their therapeutic potential or even basic physiological functions has been slowed by the lack of good pharmacological tools. Indeed, the molecular pharmacology of the inward rectifier family has lagged far behind that of the S4 superfamily of voltage-gated potassium (Kv) channels, for which a number of nanomolar-affinity and highly selective peptide toxin modulators have been discovered3. The bee venom toxin tertiapin and its derivatives are potent inhibitors of Kir1.1 and Kir3 channels4,5, but peptides are of limited use therapeutically as well as experimentally due to their antigenic properties and poor bioavailability, metabolic stability and tissue penetrance. The development of potent and selective small-molecule probes with improved pharmacological properties will be a key to fully understanding the physiology and therapeutic potential of Kir channels.
The Molecular Libraries Probes Production Center Network (MLPCN) supported by the National Institutes of Health (NIH) Common Fund has created opportunities for academic scientists to initiate probe discovery campaigns for molecular targets and signaling pathways in need of better pharmacology6. The MLPCN provides researchers access to industry-scale screening centers and medicinal chemistry and informatics support to develop small-molecule probes to elucidate the function of genes and gene networks. The critical step in gaining entry to the MLPCN is the development of a robust target- or pathway-specific assay that is amenable for high-throughput screening (HTS).
Here, we describe how to develop a fluorescence-based thallium (Tl+) flux assay of Kir channel function for high-throughput compound screening7,8,9,10.The assay is based on the permeability of the K+ channel pore to the K+ congener Tl+. A commercially available fluorescent Tl+ reporter dye is used to detect transmembrane flux of Tl+ through the pore. There are at least three commercially available dyes that are suitable for Tl+ flux assays: BTC, FluoZin-2, and FluxOR7,8. This protocol describes assay development using FluoZin-2. Although originally developed and marketed as a zinc indicator, FluoZin-2 exhibits a robust and dose-dependent increase in fluorescence emission upon Tl+ binding. We began working with FluoZin-2 before FluxOR was available7,8 and have continued to do so9,10. However, the steps in assay development are essentially identical for all three dyes, and users should determine which dye is most appropriate for their specific needs. We also discuss the assay's performance benchmarks that must be reached to be considered for entry to the MLPCN. Since Tl+ readily permeates most K+ channels, the assay should be adaptable to most K+ channel targets.

Methods for developing and validating a quantitative fluorescence assay for measuring the activity of inward rectifier potassium (Kir) channels for high-throughput compound screening is presented.

Criblage à haut débit pour les petites molécules modulateurs de canaux potassiques entrants Rectifier

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with Parkinson&#39;s disease. 293T cells are transiently transfected with plasmids from an arrayed ORF expression library, together with luciferase reporter plasmids, in a one-gene-per-well microplate format. Firefly luciferase activity is assayed after 48 hr to determine the effects of each library gene upon alpha-synuclein transcription, normalized to expression from an internal control construct (a hCMV promoter directing Renilla luciferase). This protocol is facilitated by a bench-top robot enclosed in a biosafety cabinet, which performs aseptic liquid handling in 96-well format. Our automated transfection protocol is readily adaptable to high-throughput lentiviral library production or other functional screening protocols requiring triple-transfections of large numbers of unique library plasmids in conjunction with a common set of helper plasmids. We also present an inexpensive and validated alternative to commercially-available, dual luciferase reagents which employs PTC124, EDTA, and pyrophosphate to suppress firefly luciferase activity prior to measurement of Renilla luciferase. Using these methods, we screened 7,670 human genes and identified 68 regulators of alpha-synuclein. This protocol is easily modifiable to target other genes of interest.

We present a rapid and inexpensive screening method for identifying transcriptional regulators using high-throughput robotic transfections and a homemade dual-glow luciferase assay. This protocol rapidly generates direct side-by-side functional data for thousands of genes and is easily modifiable to target any gene of interest.

Criblage à haut débit fonctionnelle utilisant une maison double lueur de dosage de luciférase

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

Le titrage à haut débit de la luciférase-virus recombinants exprimant

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

Recouvrement des adultes coeurs de poisson zèbre à haut débit pour des applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

Identification de paires Kinase-substrat en utilisant criblage à haut débit


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

Automated Modular High Throughput Exopolysaccharide Screening Platform Coupled with Highly Sensitive Carbohydrate Fingerprint Analysis

Many microorganisms are capable of producing and secreting exopolysaccharides (EPS), which have important implications in medical fields, food applications or in the replacement of petro-based chemicals. We describe an analytical platform to be automated on a liquid handling system that allows the fast and reliable analysis of the type and the amount of EPS produced by microorganisms. It enables the user to identify novel natural microbial exopolysaccharide producers and to analyze the carbohydrate fingerprint of the corresponding polymers within one day in high-throughput (HT). Using this platform, strain collections as well as libraries of strain variants that might be obtained in engineering approaches can be screened. The platform has a modular setup, which allows a separation of the protocol into two major parts. First, there is an automated screening system, which combines different polysaccharide detection modules: a semi-quantitative analysis of viscosity formation via a centrifugation step, an analysis of polymer formation via alcohol precipitation and the determination of the total carbohydrate content via a phenol-sulfuric-acid transformation. Here, it is possible to screen up to 384 strains per run. The second part provides a detailed monosaccharide analysis for all the selected EPS producers identified in the first part by combining two essential modules: the analysis of the complete monomer composition via ultra-high performance liquid chromatography coupled with ultra violet and electrospray ionization ion trap detection (UHPLC-UV-ESI-MS) and the determination of pyruvate as a polymer substituent (presence of pyruvate ketal) via enzymatic oxidation that is coupled to a color formation. All the analytical modules of this screening platform can be combined in different ways and adjusted to individual requirements. Additionally, they can all be handled manually or performed with a liquid handling system. Thereby, the screening platform enables a huge flexibility in order to identify various EPS.

We present an automated modular high-throughput-method for the identification and characterization of microbial exopolysaccharides in small scale. This method combines a fast preselection to analyze the total amount of secreted polysaccharides with a detailed carbohydrate fingerprint to enable the fast screening of newly isolated bacterial strains or entire strain collections.