Cette recherche est soutenue par la National Science Foundation attribué à JOD (OCE-0623475), la CPS (OCE-0623534 et 0727544), et JHC (OCE-0727587 et 0623508 OCE-), et par l&#39;Office of Naval Research décerné à JHC ( N000140810654). KK est soutenu par le programme de bourses postdoctorales au Woods Hole Oceanographic Institution, avec un financement assuré par la Fondation du Devonshire.

<ol><li> Pour commencer cette procédure, nous nous assurons que tous les composants ont SCUVA batterie suffisamment chargée, bande d&#39;enregistrement (pour la haute définition ou une caméra vidéo HD), et fonctionnent correctement. Selon le flux d&#39;être mesuré, sélectionnez résolution de la caméra vidéo et des taux de trame qui donnent les meilleurs résultats pour la vélocimétrie des particules d&#39;image numérique (DPIV) 1,2. </li><li> Préparer les boîtiers laser et caméra pour une utilisation par le nettoyage des rainures o-ring et les joints toriques avec une serviette propre ou essuyer. Fais constructeur fourni le joint torique de graisse uniformément sur les joints toriques et les remplacer dans les rainures de logement. En outre, nettoyer les ouvertures des logements au laser et la caméra pour éviter toute déformation tôle au laser et des marques sur le boîtier de la caméra optique. </li><li> Vérifier les joints o-ring en plaçant les deux boîtiers vides dans une baignoire pleine d&#39;eau. Objets pondéré devra être placé sur le dessus du boîtier de submerger eux depuis les boîtiers flottent lorsqu&#39;ils sont vides. Après 5 à 10 minutes, retirer les carters de la baignoire et sèche serviette tIl l&#39;extérieur. Vérifier s&#39;il ya de l&#39;humidité à l&#39;intérieur du boîtier. Pensez aussi à utiliser jetables, des bandes d&#39;humidité du papier lors de l&#39;essai de pression pour indiquer s&#39;il ya de l&#39;humidité dans les logements après le test. </li><li> Après les boîtiers passer le test de pression, placer les composants SCUVA l&#39;intérieur des logements. </li><li> Fixez à haute intensité de décharge gousses lumière (HID) au boîtier de la caméra. Assurez-vous que les lumières sont orientées de telle façon qu&#39;elles illuminent la zone directement devant la caméra et l&#39;opérateur, et ne pas interférer avec le maintien d&#39;emprise sur les poignées et le fonctionnement des commandes de l&#39;appareil. </li><li> Dans un environnement de faible luminosité, s&#39;assurer que le faisceau laser est correctement aligné par rapport à la lentille optique installé dans le boîtier laser. Lorsqu&#39;il est correctement aligné, la combinaison laser / lentille de créer une feuille de lumière verticaux qui sont orientés perpendiculairement à la boîtier de la caméra. Par mesure de sécurité, utilisez une feuille sensibles à la température de papier afin de déterminer l&#39;orientation nappe laser. </li&gt; <li> En utilisant des pièces jointes SCUVA et le rigide, bras extensible, connectez le boîtier du laser et le boîtier de la caméra à l&#39;autre. S&#39;assurer que les boîtiers sont bien attachés et que les logements ne peut pas tourner par rapport à l&#39;autre. Il est essentiel que la nappe laser reste orienté perpendiculairement au champ de la caméra de vue tout au long de la mesure. </li><li> Grâce aux capacités actuelles de SCUVA, plongées de mesure ne peut être réalisée en basse lumière endroits ou la nuit pour éviter les interférences de lumière naturelle avec la nappe laser. Par conséquent, nous recommandons d&#39;attendre jusqu&#39;au crépuscule ou plus tard avant d&#39;entrer dans l&#39;eau. </li><li> Allumez le boîtier de la caméra avant d&#39;entrer dans l&#39;eau. Le boîtier de la caméra possède un capteur d&#39;humidité intégré électronique qui fournit des avertissements visuels (feux clignotants à DEL) en cas d&#39;humidité dans le boîtier de la caméra. Le capteur ne fonctionne que lorsque le boîtier de la caméra est allumée. </li><li> Plongez dans l&#39;eau SCUVA et attacher l&#39;appareil pour vous en utilisantune ligne. Une fois attachée à l&#39;appareil, relâchez SCUVA pour déterminer les caractéristiques de flottabilité de l&#39;appareil. Selon les caractéristiques de flottabilité, attacher ou de mousse de flottabilité plombs à un ou deux boîtiers afin d&#39;assurer une flottabilité neutre et empêcher la rotation de l&#39;appareil dans l&#39;eau. </li><li> Ensuite, passer sur le laser et maintenez l&#39;appareil immobile. Positionner le laser à l&#39;aide du bras extensible suffisamment loin du plongeur afin de minimiser la mesure de plongeur induit des flux. Toute mesure de diver-induite coule près de la cible d&#39;introduire des erreurs et ne sont pas utilisés pour une analyse ultérieure. Ajustez le zoom de la caméra jusqu&#39;à ce que le champ de vue de la cible des cadres et du fluide environnant. </li><li> Tout en gardant l&#39;appareil à l&#39;arrêt, l&#39;accent de la caméra vidéo sur la feuille de laser jusqu&#39;à ce que les particules apparaissent nettes et au point. Une fois le plan de la tôle au laser est au point, mettez l&#39;appareil en mode de mise au point manuelle. Cela permettra d&#39;éviter l&#39;appareil photo de recentrage sur les objets qui apparaissent dans le domaine de laVue lors de la mesure, résultant en des particules floue dans la nappe laser. </li><li> Pour étalonner SCUVA, placer un objet de dimensions connues dans la nappe laser dans le champ de la caméra vidéo de vue. Record pour quelques secondes. Après la plongée, une image sera extrait de cette séquence vidéo afin de déterminer une constante d&#39;étalonnage qui convertit le champ de vue à partir d&#39;unités de pixels au centimètre. Si à tout moment l&#39;opérateur ajuste le champ de vue être re-positionner le bras extensible ou de changer le zoom appareil pendant la plongée, les étapes 12 et 13 devront être répétées. </li><li> Commencez la plongée en descendant à la profondeur de travail. À la recherche d&#39;une cible, les propriétés d&#39;écoulement de l&#39;environnement en vrac doivent être déterminés. S&#39;il est présent, la direction actuelle va dicter le positionnement des appareils et plongeur par rapport à la cible pendant les mesures. Le sens d&#39;écoulement en vrac autour de la cible peut être déduite par l&#39;observation de bulles s&#39;exhalait de le plongeur et en notant leur mouvement latéral. Dansplus de bulles, une petite quantité de colorant fluorescent (par exemple, la fluorescéine) peuvent être libérés pour déterminer la direction du courant. Depuis diver-a généré des flux peut être une source d&#39;erreur de mesure DPIV, le plongeur ne doit pas être situé en amont de la cible. En outre, la nappe laser doit être positionné parallèlement à la direction du courant de manière à maximiser le temps de résidence des particules au sein de la nappe laser, minimisant ainsi les erreurs DPIV. Toutefois, si aucun flux de courant ou en vrac est présent, le plongeur et le positionnement SCUVA rapport à la cible sont libres. </li><li> Position SCUVA pour éclairer et d&#39;enregistrer le mouvement du fluide entourant une cible. Si vous essayez d&#39;enregistrer les flux autour d&#39;une cible en mouvement d&#39;abord prédire la localisation de la cible, puis la position SCUVA à l&#39;emplacement prévu, tout en restant immobile. Comme la cible se déplace à travers champ de la caméra de vue, commencer l&#39;enregistrement. Si la cible est immobile, le cadre de la cible et fluide environnant dans la caméra vidéo et# X2019; champ de vision et de commencer l&#39;enregistrement tout en restant immobile. L&#39;opérateur doit s&#39;abstenir de mouvements de rotation et hors-plan pendant l&#39;enregistrement vidéo, puisque ces mouvements entraîner des résultats erronés DPIV. Par conséquent, les mesures recueillies au cours de rotation et out-of-plane mouvements plongeurs ne seront pas utilisés pour l&#39;analyse des données supplémentaires. </li><li> Une fois la collection vidéo est terminée, éteignez toutes les composantes de SCUVA et restaurer le bras laser pour sa position rétractée. Retirer SCUVA de l&#39;eau et détacher la caméra et boîtiers laser du bras. Rincer ou faire tremper l&#39;appareil dans l&#39;eau douce avant de les sécher pour éviter la rouille de l&#39;appareil. Une fois les boîtiers sont séchées, supprimer des composants à partir des boîtiers, et de recharger les batteries et les remplacer si nécessaire pour une autre plongée. </li><li> Connectez la caméra vidéo à un ordinateur et extrait vidéo de la bande HD en utilisant un package logiciel vidéo HD (par exemple, Adobe Premiere Pro ou iMovie). Après la vidéo est extraite, déterminer l&#39;éventail desla vidéo à convertir en une série d&#39;images pour l&#39;analyse DPIV. S&#39;assurer que les rapports d&#39;aspect des pixels et les tailles d&#39;image extraite correspondent aux paramètres de la vidéo HD. </li><li> Ces images sont importées à un programme de traitement DPIV (ie, Davis ou MatPIV). Après la sélection appropriée des constantes d&#39;étalonnage et les paramètres de capture d&#39;image, qui sont invités à partir du logiciel DPIV, des champs de vitesse peuvent être générés à partir d&#39;images de particules consécutives. D&#39;autres étapes de post-traitement, en fonction de la qualité et le type de mesures, peut également être appliquée 3. </li></ol> Les résultats représentatifs: Lorsque le protocole est fait correctement, les images de particules autour de la cible sera nette et facile à distinguer. En utilisant les champs de particules capturées in situ par caméra vidéo SCUVA (figure 1A) et un paquet DPIV logiciel de traitement, les champs de vitesse de l&#39;écoulement autour de la cible (figure 1B) sera révélée. Vecteurs dans le Velocichamp de Ty indiquent l&#39;ampleur et la direction de la vitesse d&#39;écoulement locale. Si la vidéo est suffisamment collectées pour fournir une série chronologique d&#39;images, une série chronologique des champs de vitesse peut également être déterminée. <img src="/files/ftp_upload/2615/2615fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1 Mesurée dans les champs de particules in situ (A) entourant Aurelia labiata. Champ de vitesse correspondant (B) avec des vecteurs jaune indiquant la direction d&#39;écoulement et de grandeur. <img src="/files/ftp_upload/2615/2615fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2 Dans les champs de particules in situ entourant Mastigias sp. Solmissus sp. (A et B, respectivement). La flèche rouge dans A indique une région de haute réflectivité, ce qui entraîne une saturation de l&#39;image, ce qui rend difficile de distinguer entre les particules et la cible. La flèche rouge dans B indique une région de stries qui se produit lorsque le débit estpas été échantillonnées à une fréquence assez élevée.

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	<li>Adrian, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle-imaging+techniques+for+experimental+fluid+mechanics.">Particle-imaging techniques for experimental fluid mechanics.</a> Ann. Rev. Fluid Mech. 23, 261-304 (1991).</li><li>Willert, C. E., Gharib, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+particle+image+velocimetry.">Digital particle image velocimetry.</a> Exp. Fluids. 10, 181-193 (1991).</li><li>Raffel, M., Willert, C., Wereley, S., Kompenhans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Particle Image Velocimetry: A Practical Guide. , (2007).</li><li>Agrawal, Y. C., Pottsmith, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+diffraction+particle+sizing+in+STRESS.">Laser diffraction particle sizing in STRESS.</a> Cont. Shelf Res. 14, 1101-1121 (1994).</li><li>Katz, J., Donaghay, P. L., Zhang, J., King, S., Russell, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Submersible+holocamera+for+detection+of+particle+characteristics+and+motions+in+the+ocean.">Submersible holocamera for detection of particle characteristics and motions in the ocean.</a> Deep Sea Res. 46, 1455-1481 (1999).</li><li>Katija, K., Dabiri, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+field+measurements+of+aquatic+animal-fluid+interactions+using+a+self-contained+underwater+velocimetry+apparatus+(SCUVA).">In situ field measurements of aquatic animal-fluid interactions using a self-contained underwater velocimetry apparatus (SCUVA).</a> Limnol. Oceanogr.-Meth. 6, 162-171 (2008).</li></ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Un obstacle potentiel dans le domaine est la nécessité pour les particules dans l&#39;écoulement, qui sont nécessaires pour mettre en œuvre numérique de vélocimétrie par image de particules (DPIV). Dans les eaux côtières, les particules en suspension expositions tailles de l&#39;ordre de 10 microns de diamètre et de concentrations entre 0,002 et 10 par mm 3. 4 études supplémentaires utilisant une holocamera submersibles pour la détection de particules de confirmer la présence suffisante de particules d&#39;ensemencement pour effectuer DPIV dans l&#39;eau des océans. 5 Pendant mer et la plongée océan côtier, nous avons constaté que la densité des particules et les tailles ne sont pas une contrainte pour la réalisation in situ DPIV. Mis à part la densité des particules et les tailles, une autre préoccupation concernant les mesures DPIV est l&#39;homogénéité des concentrations de particules. Qualitativement, si une région dans une fenêtre d&#39;interrogation a des concentrations de particules supérieures à l&#39;autre, l&#39;ampleur de vitesse générés par le DL&#39;analyse PIV sera biaisée vers la région avec des concentrations de particules supérieures. Par conséquent, les mesures doivent être effectuées SCUVA où la variabilité de la concentration des particules est réduite au minimum. Nous avons trouvé des concentrations thatcle sont relativement constants au cours des concentrations de particules sont relativement constante au cours de plongées où le plongeur est en suspension dans le milieu de la colonne d&#39;eau. Toutefois, les champs de particules dans les environnements benthiques ont le potentiel d&#39;inhomogénéité due à la remise en suspension des particules par les flux environnementaux ou plongeur-induite à proximité du plancher océanique. Des précautions doivent être prises pour minimiser les perturbations des particules lors des mesures dans des environnements benthiques. Pour la connaissance des auteurs, une analyse formelle des erreurs générées par les champs inhomogènes concentration en particules n&#39;a pas été effectuée dans des conditions de laboratoire ou de terrain non plus, et devrait être un sujet pour un nouvel examen dans une publication distincte. Plusieurs questions diverses doivent être considérés lors de la préparation et lamener des expérimentations in situ en utilisant le protocole. Pendant l&#39;enregistrement, l&#39;opérateur est chargé de rester immobile et de s&#39;abstenir de tout hors de l&#39;avion et le mouvement de rotation. Cette demande est simple en théorie, mais difficile en pratique, et que ces mesures nécessitent des compétences avancées de plongée pour se terminer correctement. Hors de l&#39;avion et les mouvements de rotation de l&#39;opérateur en raison de données erronées DPIV. Toutefois, dans le plan motions peuvent être corrigées en utilisant un logiciel maison. 6 Il est recommandé à l&#39;opérateur de pratiquer le contrôle de flottabilité pour plusieurs plongées avant d&#39;utiliser SCUVA pour maximiser l&#39;efficacité des mesures. Outre les considérations de la flottabilité, l&#39;opérateur doit être conscient de la direction du flux cible. Flux qui voyagent hors-plan par rapport à la nappe laser ne donnera pas des résultats fiables DPIV, et l&#39;opérateur doit orienter SCUVA pour capter ces flux plus efficace. En outre, la position du plongeur par rapport à la cible doit être SelecteD afin de minimiser les plongeurs induit des flux dans les mesures. Diver-induite introduit une erreur de débit au débit cible, et des mesures qui incluent des effets plongeur doit pas être utilisé pour une analyse ultérieure. Dans le cas où la cible a une surface hautement réfléchissante, la région fluide entourant la cible sera fortement éclairée, ce qui rend difficile de distinguer les particules individuelles à proximité du fluide environnant (région indiquée par la flèche rouge, figure 2A). Filtres ou polariseurs peuvent être ajoutés aux boîtiers laser ou caméra de réduire l&#39;intensité de la lumière laser captée par le capteur de la caméra vidéo. Si cela n&#39;est pas possible en raison de contraintes logistiques et un accès limité à l&#39;équipement, de post-traitement des images en utilisant un logiciel interne peut fournir suffisamment de correction en soustrayant les images, les intensités des pixels élevés près de la cible. Une autre considération qui affecte la qualité des données est de savoir si DPIV traînées de particules sont présents. Si les particuleschamps ont des régions de stries (indiqué par la flèche rouge, Figure 2B), la caméra vidéo est un enregistrement à une cadence trop faible pour résoudre ces vitesses élevées. En augmentant le taux d&#39;armature, des stries de particules peut être réduite. Toutefois, cela se traduit par une réduction de lumière atteignant le capteur de la caméra vidéo et rend le gradateur chercher des particules sur le terrain. Si la caméra vidéo a la capacité de définir manuellement les paramètres d&#39;ouverture, augmenter le réglage de l&#39;ouverture pour empêcher gradation du champ de particules. Déterminer les paramètres du périphérique optimale peut nécessiter plusieurs plongées avec SCUVA, avant la collecte de données réussie.

quantitatively measuring in situ flows using a self-contained underwater velocimetry apparatus (scuva)

La capacité de mesurer directement les champs de vitesse dans un environnement fluide est nécessaire de fournir des données empiriques pour des études dans des domaines aussi variés que l&#39;océanographie, l&#39;écologie, la biologie et la mécanique des fluides. Mesures sur le terrain d&#39;introduire les défis pratiques tels que les conditions environnementales, la disponibilité des animaux, et le besoin de techniques de mesure de champ compatible. Pour éviter ces difficultés, les scientifiques utilisent généralement des environnements de laboratoire contrôlé à l&#39;étude des animaux-fluide interactions. Cependant, il est raisonnable de se demander si on peut extrapoler le comportement naturel (c&#39;est à dire, ce qui se passe sur le terrain) à partir de mesures de laboratoire. Par conséquent, in situ, mesures de flux quantitatifs sont nécessaires pour décrire avec précision la natation animaux dans leur environnement naturel. Nous avons conçu une auto-contenue, appareil portatif qui fonctionne indépendamment de tout lien vers la surface, et peut fournir des mesures quantitatives de l&#39;surrou champ d&#39;écoulementnding un animal. Cet appareil, un appareil autonome vélocimétrie sous-marine (SCUVA), peut être actionné par un plongeur dans les profondeurs seule jusqu&#39;à 40 m. En raison de la complexité ajoutée inhérente à des conditions de terrain, d&#39;autres considérations et de préparation sont nécessaires par rapport aux mesures effectuées en laboratoire. Ces considérations incluent, mais ne sont pas limités à, le mouvement opérateur, prédire la position des cibles de natation, disponible à particules naturelles en suspension, et l&#39;orientation de SCUVA rapport à l&#39;écoulement d&#39;intérêt. Le protocole suivant est destiné à répondre à ces défis sur le terrain commun et pour maximiser le succès de mesure.

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Quantitatively Measuring In situ Flows using a Self-Contained Underwater Velocimetry Apparatus SCUVA

Ce protocole fournit des instructions sur la façon d&#39;utiliser un appareil autonome vélocimétrie sous-marine (SCUVA), qui est conçu pour la quantification in situ des animaux a généré des flux. En outre, ce protocole aborde les défis posés par les conditions du terrain, et comprend le mouvement opérateur, la position prédire des animaux, et l&#39;orientation de SCUVA.

Mesurer quantitativement In situ Flux aide d&#39;un appareil autonome à la vélocimétrie subaquatique (SCUVA)

The ability to directly measure velocity fields in a fluid environment is necessary to provide empirical data for studies in fields as diverse as ...

quantitatively-measuring-situ-flows-using-self-contained-underwater

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Quantitatively Measuring In situ Flows using a Self-Contained Underwater Velocimetry Apparatus (SCUVA)

12.9K vues.  Woods Hole Oceanographic Institution. Ce protocole fournit des instructions sur la façon d'utiliser un appareil autonome vélocimétrie sous-marine (SCUVA), qui est conçu pour la quantification in situ des animaux a généré des flux. En outre, ce protocole aborde les défis posés par les conditions du terrain, et comprend le mouvement opérateur, la position prédire des animaux, et l'orientation de SCUVA.

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Electrospinning Fundamentals: Optimizing Solution and Apparatus Parameters

Electrospun nanofiber scaffolds have been shown to accelerate the maturation, improve the growth, and direct the migration of cells in vitro. Electrospinning is a process in which a charged polymer jet is collected on a grounded collector; a rapidly rotating collector results in aligned nanofibers while stationary collectors result in randomly oriented fiber mats. The polymer jet is formed when an applied electrostatic charge overcomes the surface tension of the solution. There is a minimum concentration for a given polymer, termed the critical entanglement concentration, below which a stable jet cannot be achieved and no nanofibers will form - although nanoparticles may be achieved (electrospray). A stable jet has two domains, a streaming segment and a whipping segment. While the whipping jet is usually invisible to the naked eye, the streaming segment is often visible under appropriate lighting conditions. Observing the length, thickness, consistency and movement of the stream is useful to predict the alignment and morphology of the nanofibers being formed. A short, non-uniform, inconsistent, and/or oscillating stream is indicative of a variety of problems, including poor fiber alignment, beading, splattering, and curlicue or wavy patterns. The stream can be optimized by adjusting the composition of the solution and the configuration of the electrospinning apparatus, thus optimizing the alignment and morphology of the fibers being produced. In this protocol, we present a procedure for setting up a basic electrospinning apparatus, empirically approximating the critical entanglement concentration of a polymer solution and optimizing the electrospinning process. In addition, we discuss some common problems and troubleshooting techniques.

Electrospinning techniques can create a variety of nanofibrous scaffolds for tissue engineering or other applications. We describe here a procedure to optimize the parameters of the electrospinning solution and apparatus to obtain fibers with the desired morphology and alignment. Common problems and troubleshooting techniques are also presented.

Fondements Électrofilage: Solution Optimisation et paramètres Appareillage

Electrospun nanofiber scaffolds have been shown to accelerate the maturation, improve the growth, and direct the migration of cells in vitro. ...

Recherche

Bio-ingénierie

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

Créer deux dimensions Substrats motifs pour le confinement des protéines et de cellules

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Micro-particle Image Velocimetry for Velocity Profile Measurements of Micro Blood Flows

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to give an accurate velocity profile. A protocol is presented for &mu;PIV measurements of blood flows in microchannels. At the scale of the microcirculation, blood cannot be considered a homogeneous fluid, as it is a suspension of flexible particles suspended in plasma, a Newtonian fluid. Shear rate, maximum velocity, velocity profile shape, and flow rate can be derived from these measurements. Several key parameters such as focal depth, particle concentration, and system compliance, are presented in order to ensure accurate, useful data along with examples and representative results for various hematocrits and flow conditions.

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows which are cross-correlated to give an accurate velocity profile. Shear rate, maximum velocity, velocity profile shape, and flow rate, each of which has clinical applications, can be derived from these measurements.

Micro-particules vélocimétrie par image de profil de vitesse pour mesures de débits Micro sang

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

Mesurer les propriétés mécaniques des cellules vivantes par microscopie à force atomique

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

Researchers regularly use Transmission Electron Microscopes (TEMs) to examine biological entities and to assess new materials. Here, we describe an additional application for these instruments- viewing viral assemblies in a liquid environment. This exciting and novel method of visualizing biological structures utilizes a recently developed microfluidic-based specimen holder. Our video article demonstrates how to assemble and use a microfluidic holder to image liquid specimens within a TEM. In particular, we use simian rotavirus double-layered particles (DLPs) as our model system. We also describe steps to coat the surface of the liquid chamber with affinity biofilms that tether DLPs to the viewing window. This permits us to image assemblies in a manner that is suitable for 3D structure determination. Thus, we present a first glimpse of subviral particles in a native liquid environment.

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

Here we describe a procedure to image viral complexes in liquid at nanometer resolution using a transmission electron microscope.

In situ TEM d’assemblages biologiques dans un liquide

Researchers regularly use Transmission Electron Microscopes (TEMs) to examine biological entities and to assess new materials. Here, we describe an ...

Custom-designed Laser-based Heating Apparatus for Triggered Release of Cisplatin from Thermosensitive Liposomes with Magnetic Resonance Image Guidance

Liposomes have been employed as drug delivery systems to target solid tumors through exploitation of the enhanced permeability and retention (EPR) effect resulting in significant reductions in systemic toxicity. Nonetheless, insufficient release of encapsulated drug from liposomes has limited their clinical efficacy. Temperature-sensitive liposomes have been engineered to provide site-specific release of drug in order to overcome the problem of limited tumor drug bioavailability. Our lab has designed and developed a heat-activated thermosensitive liposome formulation of cisplatin (CDDP), known as HTLC, to provide triggered release of CDDP at solid tumors. Heat-activated delivery in vivo was achieved in murine models using a custom-built laser-based heating apparatus that provides a conformal heating pattern at the tumor site as confirmed by MR thermometry (MRT). A fiber optic temperature monitoring device was used to measure the temperature in real-time during the entire heating period with online adjustment of heat delivery by alternating the laser power. Drug delivery was optimized under magnetic resonance (MR) image guidance by co-encapsulation of an MR contrast agent (i.e.,&#160;gadoteridol) along with CDDP into the thermosensitive liposomes as a means to validate the heating protocol and to assess tumor accumulation. The heating protocol consisted of a preheating period of 5 min prior to administration of HTLC and 20 min heating post-injection. This heating protocol resulted in effective release of the encapsulated agents with the highest MR signal change observed in the heated tumor in comparison to the unheated tumor and muscle. This study demonstrated the successful application of the laser-based heating apparatus for preclinical thermosensitive liposome development and the importance of MR-guided validation of the heating protocol for optimization of drug delivery.

AN MRI-compatible&#160;custom-designed laser-based heating apparatus has been developed to provide local heating of subcutaneous tumors in order to activate release of agents from thermosensitive liposomes specifically at the tumor region.

Spécialement conçu à base de laser appareils de chauffage à libération déclenchée de cisplatine de thermosensible liposomes avec guidage par l&#39;image par résonance magnétique

Liposomes have been employed as drug delivery systems to target solid tumors through exploitation of the enhanced permeability and retention (EPR) effect ...

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances (EPS). The EPS serves as a physical and protective scaffold that houses the bacterial cells and consists of a variety of materials that includes proteins, exopolysaccharides and DNA. The composition of the EPS may change, which remodels the mechanic properties of the biofilm to further develop or support alternative biofilm structures, such as streamers, as a response to environmental cues. Despite this, there are little quantitative descriptions on how EPS components contribute to the mechanical properties and function of biofilms. Rheology, the study of the flow of matter, is of particular relevance to biofilms as many biofilms grow in flow conditions and are constantly exposed to shear stress. It also provides measurement and insight on the spreading of the biofilm on a surface. Here, particle-tracking microrheology is used to examine the viscoelasticity and effective crosslinking roles of different matrix components in various parts of the biofilm during development. This approach allows researchers to measure mechanic properties of biofilms at the micro-scale, which might provide useful information for controlling and engineering biofilms.

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

En cartographie in situ des propriétés mécaniques des biofilms par Microrhéologie de particules de suivi

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen Presenting Cells (APCs). This is despite T-cell antigen receptors (TCRs) exerting usually a moderate affinity (&#181;M range) to antigen when binding is measured in vitro1. In view of the molecular and cellular parameters contributing to T-cell antigen sensitivity, a microscopy-based methodology has been developed as a means to monitor TCR-pMHC binding in situ, as it occurs within the synapse of a live T-cell and an artificial and functionalized glass-supported planar lipid bilayer (SLB), which mimics the cell membrane of an Antigen presenting Cell (APC) 2. Measurements are based on F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between a blue- and red-shifted fluorescent dye attached to the TCR and the pMHC. Because the efficiency of FRET is inversely proportional to the sixth power of the inter-dye distance, one can employ FRET signals to visualize synaptic TCR-pMHC binding. The sensitive of the microscopy approach supports detection of single molecule FRET events. This allows to determine the affinity and off-rate of synaptic TCR-pMHC interactions and in turn to interpolate the on-rate of binding. Analogous assays could be applied to measure other receptor-ligand interactions in their native environment.

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

This manuscript describes how to conduct (single molecule) F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)- based assays to measure the binding dynamics between T-cell antigen receptor (TCR) and antigenic peptide-loaded MHC molecules as they occur within the immunological synapse of a T-cell in contact with a functionalized planar supported lipid bilayer.

Mesure de TCR-pMHC Reliure<em&gt; In Situ</em&gt; L&#39;aide d&#39;un essai basé sur la microscopie FRET-

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

Apparatus for Harvesting Tissue Microcolumns

This manuscript describes the production process for a laboratory apparatus, made from off-the-shelf components, that can be used to collect microcolumns of full-thickness skin tissue. The small size of the microcolumns allows donor sites to heal quickly without causing donor site scarring, while harvesting full-thickness tissue enables the incorporation of all cellular and extracellular components of skin tissue, including those associated with deeper dermal regions and the adnexal skin structures, which have yet to be successfully reproduced using conventional tissue engineering techniques. The microcolumns can be applied directly into skin wounds to augment healing, or they can be used as the autologous cell/tissue source for other tissue engineering approaches. The harvesting needles are made by modifying standard hypodermic needles, and they can be used alone for harvesting small amounts of tissue or coupled with a simple suction-based collection system (also made from commonly available laboratory supplies) for high-volume harvesting to facilitate studies in large animal models.

Here we describe a protocol for producing harvesting needles that can be used to collect full-thickness skin tissue without causing donor site scarring. The needles can be combined with a simple collection system to achieve high-volume harvesting.

Appareil pour la récolte de tissus Microcolumns

This manuscript describes the production process for a laboratory apparatus, made from off-the-shelf components, that can be used to collect microcolumns ...

Meso-Scale Particle Image Velocimetry Studies of Neurovascular Flows In Vitro

Particle image velocimetry (PIV) is used in a wide variety of fields, due to the opportunity it provides for precisely visualizing and quantifying flows across a large spatiotemporal range. However, its implementation typically requires the use of expensive and specialized instrumentation, which limits its broader utility. Moreover, within the field of bioengineering, in vitro flow visualization studies are also often further limited by the high cost of commercially sourced tissue phantoms that recapitulate desired anatomical structures, particularly for those that span the mesoscale regime (i.e., submillimeter to millimeter length scales). Herein, we present a simplified experimental protocol developed to address these limitations, the key elements of which include 1) a relatively low-cost method for fabricating mesoscale tissue phantoms using 3-D printing and silicone casting, and 2) an open-source image analysis and processing framework that reduces the demand upon the instrumentation for measuring mesoscale flows (i.e., velocities up to tens of millimeters/second). Collectively, this lowers the barrier to entry for nonexperts, by leveraging resources already at the disposal of many bioengineering researchers. We demonstratethe applicability of this protocol within the context of neurovascular flow characterization; however, it is expected to be relevant to a broader range of mesoscale applications in bioengineering and beyond.

Meso-Scale Particle Image Velocimetry Studies of Neurovascular Flows In Vitro

Here we present simplified methods for fabricating transparent neurovascular phantoms and characterizing the flow therein. We highlight several important parameters and demonstrate their relationship to field accuracy.

Méso-échelle Particle Image Velocimetry études de neurovasculaire Flows In Vitro

Particle image velocimetry (PIV) is used in a wide variety of fields, due to the opportunity it provides for precisely visualizing and quantifying flows ...