Ce travail a été soutenu financièrement par la Fondation Overstreet.

1. Éléments qui doivent être préparés Avant de procéder à Placage Cellulaire: <ol><li> Volume approprié de milieu complet NSC est préparée en mélangeant NeuroCult NSC moyen basale et NeuroCult NSC Suppléments prolifération à un ratio 9:1, respectivement. </li><li> Une aliquote de NeuroCult NCFC milieu sans sérum, sans cytokines est décongelé. </li><li> Le milieu est chauffé dans un bain d&#39;eau à 37 ° C. </li><li> Les solutions mères du facteur de croissance épidermique (EGF), facteur de croissance basique fibroblastique (b-FGF) à la concentration de 10 pg / mL et héparine à 0,2% sont préparés à l&#39;avance. </li><li> Selon la taille expérimentation, plusieurs boîtes de culture tissulaire de 35 mm sont nécessaires à l&#39;assiette des cellules et un plat en plastique 150-200cm de Petri est également nécessaire de tenir les plats double de 35mm et un troisième plat 35mm d&#39;eau. </li></ol> 2. Préparation des cellules: Selon votre expérience, les cellules peuvent être préparés à partir d&#39;une source adultes ou embryonnaires (primaire ou de tissu dissocié neurosphères dissociées). Disséquer les tissus de l&#39;adulte / embryons de souris du système nerveux central (SNC) ou dissocier neurosphères adulte / embryonnaires dérivées comme décrit précédemment 1,2 et ensuite: <ol><li> La suspension cellulaire unique est passé à travers un filtre à mailles de 40 um de taille de manière à supprimer non dissociée des touffes. </li><li> 10 ul de la suspension cellulaire est mélangé avec 90μl de bleu trypan pour effectuer un comptage des cellules. Remarque: D&#39;autres dilutions cellule appropriée peut également être utilisé. </li><li> Si vous utilisez embryonnaire ou adulte primaires dérivées des cellules neurales, diluer la suspension cellulaire à une concentration de 6,5 x 10 5 cellules / ml dans un milieu complet NSC. Si utilisant des cellules de neurosphères dissociées provenant adultes ou embryonnaires des cellules neurales, diluer la suspension cellulaire à une concentration de 2,2 x 10 5 cellules / ml dans un milieu complet NSC. </li></ol> 3. Cellules Placage des semi-solide N-ACCP moyen: <ol><li> Le volume approprié des composants suivants sont mélangés dans l&#39;ordre, selon le nombre de répétitions. Ici, nous mélanger la quantité nécessaire pour deux répétitions ou de dupliquer des plats. Pour les nombres de répétitions supplémentaires, s&#39;il vous plaît se référer au tableau 1. <ul><li> 1,7 ml de NeuroCult NCFC milieu sans sérum, sans cytokines </li><li> 330 uL de suppléments NeuroCult prolifération NSC </li><li> 6,6 uL d&#39;EGF (10μg/mL) </li><li> 32 uL de pénicilline / streptomycine </li><li> 3,3 uL de b-FGF (10μg/mL) requis uniquement si la culture de cellules dérivées de cellules neurales adultes. </li><li> 3,3 uL de l&#39;héparine (0,2%) requis uniquement si la culture de cellules dérivées de cellules neurales adultes. </li><li> 25 pi de suspension cellulaire (de 2,2 x 10 5 cellules / ml à partir des cellules neurosphères dissociées ou 6,5 x 10 5 cellules / ml de cellules primaires à partir de tissus du système nerveux central dissocié). Note: Les numéros de cellulaire finale plaquée devrait être d&#39;environ 2500 cellules par boîte de 35 mm de la culture pour les cellules dérivées Neurosphère et 7500 cellules par boîte de 35 mm pour la culture de cellules primaires. Dans certains cas, la densité cellulaire finale plaquage doit être ajustée en effectuant une expérience de titrage cellule. Pour les analyses statistiques, le nombre total de colonies détectées après 21 jours de culture doit être dans la plage d&#39;au moins 50 à 150 colonies. </li></ul></li><li> Le milieu contenant les cellules est mélangé doucement puis 1,3 ml de solution de collagène froid est transféré à la suspension cellulaire et bien mélangés par pipetage doux pour éviter d&#39;introduire des bulles. </li><li> La solution mixte est dispensé au centre de chaque boîte de culture 35mm (~ 1,5 ml / boîte) et les plats sont inclinés en douceur en utilisant un mouvement circulaire pour laisser le mélange réparti uniformément sur la surface du plat. . </li><li> Les 35 boîtes de culture reproduire mm sont placés dans une plaque de Pétri de 100 mm. Le couvercle de la nouvelle boîte de 35 mm est enlevé et la capsule ouverte est également placé dans le même plat de Pétri de 100 mm. L&#39;eau stérile est ajoutée à cette boîte de 35 mm ouverte pour maintenir l&#39;humidité optimale pendant la période d&#39;incubation. Bioessai plaques carrées (245 mm) sont utilisés lorsque plus de reproduire des boîtes de 35 mm ont été mis en place. Encore une fois, comprennent 2 ou 3 boîtes de 35 mm ouvert contenant de l&#39;eau stérile. </li><li> Les plaques sont transférées à un incubateur réglé à 37 ° C, 5% de CO2 et 95% d&#39;humidité. Le collagène fige en augmentant la température et la formation de gel se fera dans environ une heure. Les cultures ne devraient pas être dérangé pendant ce temps. </li><li> Les cellules cultivées sont incubées pendant 21 jours (les différences de taille des colonies peuvent être clairement distingués, après 21 jours). </li></ol> 4. Préparation moyen reconstitution et de Nourrir la culture: Comme la N-ACCP cultures sont incubées pendant une longue période de temps (21 jours), les cultures doivent être nourris avec les NeuroCult appropriée complète moyennes de réapprovisionnement fraîchement préparés comme suit: <ul><li> 4,5 ml de NeuroCult NSC milieu de base est mélangée avec 0,5 mL de suppléments NeuroCult prolifération NSC et ensuite les facteurs de croissance est ajouté: </li><li> 250 ul d&#39;10μg/mL EGF (pour donner une concentration finale de 0,5 pg / ml EGF) </li><li> 125 ul d&#39;10μg/mL b-FGF (pour donner une concentration finale de 0.25μg/mL b-FGF) requis uniquement si la culture de cellules dérivées de cellules neurales adultes. </li><li> 125 ul d&#39;héparine de 0,2%, requis uniquement si la culture de cellules dérivées de cellules neurales adultes. </li><li> 60 uL du milieu approprié NeuroCult complète reconstitution (pour les cellules embryonnaires ou adultes) est ajouté dans le centre de chaque plat Assay NCFC fois tous les 7 jours pendant l&#39;incubation toute Assay NCFC la culture (21 jours). </li></ul> 5. Scoring colonies Assay N-CFC dérivés et calcul de la fréquence de bonne NSCs Fide et cellules progénitrices neurales: <ul><li> Chaque plat de 35 mm de la culture est placée sur un plat notation quadrillées avec la taille de grille de 2,0 mm x 2,0 mm, puis les deux plats sont placés sur la platine du microscope. </li><li> L&#39;utilisation de faible puissance (2.5X - 5X) lentille d&#39;objectif, chaque plat est numérisé et les colonies sont marqués en fonction de leurs tailles. </li><li> Les colonies sont classés en deux grandes catégories: <ol><li> Moins de 2 mm de diamètre </li><li> Diamètre ≥ 2 mm </li></ol></li></ul> 6. Les résultats représentatifs: Comme dans l&#39;essai Neurosphère, cellules étalées dans le N-CFC test commencent à proliférer et de faire de petites colonies de cellules dans les 3 - 7 jours après le placage (figure 1). Dans deux semaines, des colonies de tailles différentes peuvent être distinguées. Bien que la majorité des colonies ont tendance à cesser de croître après 14 jours, certaines colonies continuent à augmenter en taille. En 21 jours, les colonies peuvent être classés dans l&#39;une des quatre catégories: 1) moins de 0,5 mm de diamètre, 2) 0,5 - 1 mm de diamètre, 3) 1 - 2 mm de diamètre et 4) ≥ 2mm de diamètre. Pratiquement, les colonies plus petites que 2 mm de diamètre sont considérés comme des dérivés progénitrices (figure 2) et les colonies ≥ 2mm de diamètre sont considérés comme des dérivés NSC (Figure 3). Le nombre de colonies ≥ 2mm de diamètre par nombre total de cellules plaquées, représente la fréquence de la réelle bonne foi des cellules souches neurales à long terme d&#39;auto-renouvellement et multi-potentiels capacités. Le total faisant Neurosphère fréquence dans une population de cellules particulières après 7-8 jours dans une expérience parallèle NSA a été estimée à être semblable à la colonie formant au total la fréquence de la même population cellulaire après 21 jours dans une expérience N-ACCP. La N-ACCP prévoit toutefois une condition plus permissive afin que chaque cellule peut montrer tout son potentiel prolifératif. <table border="1"><tbody><tr><td> Composante </td><td> 2 répétitions </td><td> 3 répétitions </td><td> 4 répétitions </td></tr><tr><td> NeuroCult NCFC milieu sans sérum, sans cytokines </td><td> 1700 </td><td> 2550 </td><td> 3400 </td></tr><tr><td> NeuroCult NSC Suppléments prolifération </td><td> 330 </td><td> 495 </td><td> 660 </td></tr><tr><td> EGF (10 pg / ml) </td><td> 6.6 </td><td> 9.9 </td><td> 13,2 </td></tr><tr><td> bFGF (10 pg / ml), uniquement pour les cellules adultes </td><td> 3.3 </td><td> 4,95 </td><td> 6.6 </td></tr><tr><td> Solution d&#39;héparine (0,2%), uniquement pour les cellules adultes </td><td> 3.3 </td><td> 4,95 </td><td> 6.6 </td></tr><tr><td> Pénicilline / streptomycine (1:100) </td><td> 32 </td><td> 48 </td><td> 64 </td></tr><tr><td> Les cellules à l&#39;adresse: 2,2 x 10 5 cellules cultivées / ml ou 6,5 x 10 5 cellules primaires / mL </td><td> 25 </td><td> 37,5 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Solution de collagène </td><td> 1300 </td><td> 1950 </td><td> 2600 </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Composantes de la culture d&#39;essai complète N-CFC. <img src="/files/ftp_upload/2639/2639fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Colonies représentant de la N-ACCP culture de la souris à un seul passage NSCs E14 7 jours après placage. Les colonies peuvent afficher la morphologie et de taille différentes. Le grossissement est de; 4x <img src="/files/ftp_upload/2639/2639fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Colonies progénitrices dérivées Représentant de différentes tailles dans la N-ACCP culture de passage on E14 NSCs souris 21 jours après placage. Comme indiqué, les colonies ont une morphologie différente, mais toutes sont à moins de 2 mm de la taille. Le grossissement est de; 4x <img src="/files/ftp_upload/2639/2639fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Représentant la figure 3. Bona fide de cellules souches dérivées colonie en N-ACCP culture de passage on E14 NSCs souris 21 jours après placage. Colonies de cellules souches dérivées pourrait afficher morphologie différente (voirla vidéo) mais tous sont ≥ 2mm de diamètre. Le grossissement est de; 4x

<ol>
	<li>Azari, H., Rahaman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Expansion+of+the+Adult+Mouse+Neural+Stem+Cells+Using+the+Neurosphere+Assay.">Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay.</a> J Vis Exp. , (2010).</li><li>Azari, H., Sharififar, S., Rahaman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+Embryonic+Mouse+Neural+Stem+Cell+Culture+Using+the+Neurosphere+Assay.">Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay.</a> J Vis Exp. , (2011).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li><li>Reynolds, B. A., Rietze, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+and+neurospheres--re-evaluating+the+relationship.">Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship.</a> Nat Methods. 2, 333-336 (2005).</li><li>Louis, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+of+Neural+Stem+and+Progenitor+Cells+in+the+Neural+Colony+Forming+Cell+Assay.">Enumeration of Neural Stem and Progenitor Cells in the Neural Colony Forming Cell Assay.</a> Stem Cells. , (2008).</li><li>Golmohammadi, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+the+frequency+and+distribution+of+stem+and+progenitor+cells+in+the+adult+mouse+brain.">Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain.</a> Stem Cells. 26, 979-987 (2008).</li><li>Louis, S. A., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosphere+and+Neural+Colony-Forming+Cell+Assays.">Neurosphere and Neural Colony-Forming Cell Assays.</a> Protocols for Neural Cell Culture. 10, 1-28 (2010).</li></ol>

Un des auteurs, Sharon A. Louis, est affilié à StemCell Technologies Inc, un producteur de certains des réactifs utilisés dans cette étude.

Bien test Neurosphère 3,1,2 est la méthode la plus commune d&#39;isoler et de multiplier des cellules souches neurales provenant de diverses sources comme le tissu du SNC adultes et embryonnaires, il ne peut pas mesurer avec précision la fréquence NSC dans une population mixte de cellules précurseurs neurales (tige et progéniteurs) car il n&#39;existe pas une relation un à un entre le nombre de neurosphères et le nombre de bona fide 4 cellules souches. Pour répondre à cette limitation, l&#39;original NSA a été adapté de manière à permettre l&#39;souches neurales et les progéniteurs de grandir à leur capacité de prolifération complète pendant trois semaines 5-7. Contrairement aux liquides NSA, dans la N-ACCP les colonies sont en fait issus par clonage, comme la matrice de collagène semi-solide empêche la migration des cellules simples plaqués et l&#39;agrégation des colonies. Pour obtenir des résultats compatibles avec ce dosage, nous recommandons: <ol><li> Assurer une suspension cellulaire unique dans la suspension de cellules d&#39;origine. Passez votre suspension cellulaire unique à travers un filtre à mailles de 40 um de taille de manière à supprimer non dissociée des touffes. </li><li> Conserver la solution de collagène sur la glace ou dans le frigo 4 ° C. Le collagène est le dernier élément à ajouter au mélange de la suspension cellulaire comme il se fige en augmentant la température. </li><li> N&#39;oubliez pas de nourrir la culture de chaque semaine. Ajout du support de réapprovisionnement contenant un facteur de croissance (s) une fois tous les 7 jours permettra aux cellules de continuer à proliférer au cours de la période de culture prolongée. </li><li> La densité cellulaire finale plaquage ont été optimisés pour des cellules dérivées de cellules primaires soit ou de culture de neurones de telle sorte que le nombre total de colonies détectées après 21 jours de culture dans le NCFC-A est dans la plage d&#39;au moins 50 à 200 colonies. Cette gamme permet la détection des colonies rares NSC dérivés&gt; 2mm de diamètre dans des échantillons tout en offrant un nombre suffisant de colonies pour les analyses statistiques. Selon la source cellulaire de départ, beaucoup moins (&lt;50) et un plus grand nombre de colonies (&gt; 250) sont parfois obtenus. Trop peu de colonies se traduira dans les colonies&gt; 2mm de diamètre étant en dessous des niveaux de détection, tandis que les colonies de trop se traduira par la surpopulation des composants anddepletion milieu de croissance résultant en une colonie comptant inexacts. Par conséquent densité de placage cellulaire devra être ajustée en conséquence (c&#39;est à dire augmenter ou diminuer le nombre total de cellules étalées) </li></ol>

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>NeuroCult NSC Basal Medium</td>
<td>Medium</td>
<td>STEMCELL</td>
<td>05700</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NeuroCult NSC Proliferation Supplements</td>
<td>Medium supplement</td>
<td>STEMCELL</td>
<td>05701</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NeuroCult NCFC medium</td>
<td>Medium</td>
<td>STEMCELL</td>
<td>05720</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.05% 	trypsin-EDTA</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>25300-062</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Soybean trypsin inhibitor </td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>T6522</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell strainer </td>
<td>Sieve</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>352340</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pen/Strep </td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T25 flask</td>
<td>Culture ware</td>
<td>Nalge Nunc international</td>
<td>136196</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T80 flask</td>
<td>Culture ware</td>
<td>Nalge Nunc international</td>
<td>178905</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Collagen</td>
<td>Reagent </td>
<td>STEMCELL</td>
<td>04902</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EGF</td>
<td>Growth factor</td>
<td>R&amp;D</td>
<td>2028-EG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>b-FGF</td>
<td>Growth factor</td>
<td>R&amp;D</td>
<td>3139-FB</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Heparin</td>
<td>Growth factor</td>
<td>Sigma</td>
<td>H4784</td>
<td>Reconstituted in PBS</td>
</tr>
<tr>
<td>15 ml tubes</td>
<td>Culture ware</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>352096</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50 ml tubes</td>
<td>Culture ware</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>352070</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>35 mm culture dishes</td>
<td>Culture ware</td>
<td>STEMCELL</td>
<td>27100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gridded scoring dishes</td>
<td>Culture ware</td>
<td>STEMCELL</td>
<td>27500</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

neural-colony forming cell assay: an assay to discriminate bona fide neural stem cells from neural progenitor cells

Le dosage de Neurosphère (NSA) est l&#39;une des méthodes les plus fréquemment utilisées pour isoler, d&#39;élargir et aussi calculer la fréquence des cellules souches neurales (NSC). Par ailleurs, ce système de culture sans sérum a également été employé pour développer des cellules souches et de déterminer leur fréquence d&#39;une variété de tumeurs et les tissus normaux. Il a été démontré récemment qu&#39;une relation un-à-un n&#39;existe pas entre la formation et de Neurosphère NSCs. Cela suggère que la NSA tel qu&#39;appliqué actuellement, surestime la fréquence des CNS dans une population mixte de cellules précurseurs neurales isolées à la fois du cerveau embryonnaire et adulte des mammifères. Cette vidéo montre pratiquement un roman basé collagène semi-solide de dosage, les neurones formant colonie test sur des cellules (N-ACCP), qui a la capacité à discriminer proviennent de cellules progénitrices en fonction de leur potentiel à long terme de prolifération, et fournit ainsi une méthode d&#39;énumérer la fréquence NSC. Dans le N-ACCP, les colonies ≥ 2 mm de diamètre sont dérivées de cellules qui répondent à tous les critères fonctionnels d&#39;un CNS, alors colonies &lt;2mm sont dérivées de progéniteurs. La procédure de N-ACCP peut être utilisé pour les cellules préparées à partir de différentes sources, y compris les adultes primaires et cultivé ou embryonnaires de souris des cellules du SNC. Ici, nous utilisons des cellules préparées à partir seul passage neurosphères générés par jour embryonnaire du cerveau des souris 14 pour effectuer la N-ACCP. Les cultures sont reconstituées avec des moyennes de prolifération tous les sept jours pendant trois semaines pour permettre aux cellules plaquées à exposer leur plein potentiel prolifératif puis la fréquence des progénitrices neurales et de bonne foi des cellules souches neurales sont calculées respectivement en comptant le nombre de colonies qui sont &lt;2mm et ceux qui sont ≥ 2mm en référence au nombre de cellules qui ont été initialement plaqué.

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Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

Ce protocole vidéo montre comment faire de la discrimination et d&#39;énumérer bona fide des cellules souches neurales dans une population mixte de cellules précurseurs neurales utilisant le test sur des cellules neurales formant colonie.

Neural-Formant Colonie dosage cellulaire: Un test pour distinguer Bona Fide Cellules souches neuronales à partir de cellules progénitrices neurales

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

neural-colony-forming-cell-assay-an-assay-to-discriminate-bona-fide

Research

JoVE Journal

Neuroscience

22.0K vues.  University of Florida. Ce protocole vidéo montre comment faire de la discrimination et d'énumérer bona fide des cellules souches neurales dans une population mixte de cellules précurseurs neurales utilisant le test sur des cellules neurales formant colonie.

Vidéo: Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

L&#39;isolement et expansion des cellules souches neurales de souris adultes utilisant le test Neurosphère

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Recherche

Neurosciences

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life span of the animal. They can potentially replace cells that are lost in the aging process or in the process of injury and disease. The existence of neural stem cells (NSCs) was first described by Reynolds and Weiss (1992) in the adult mammalian central nervous system (CNS) using a novel serum&#8208;free culture system, the neurosphere assay (NSA). Using this assay, it is also feasible to isolate and expand NSCs from different regions of the embryonic CNS. These in vitro expanded NSCs are multipotent and can give rise to the three major cell types of the CNS. While the NSA seems relatively simple to perform, attention to the procedures demonstrated here is required in order to achieve reliable and consistent results. This video practically demonstrates NSA to generate and expand NSCs from embryonic day 14-mouse brain tissue and provides technical details so one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting E14 mouse embryos, brain microdissection to harvest the ganglionic eminences, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in NSA culture. After 5-7 days in culture, the resulting primary neurospheres are passaged to further expand the number of the NSCs for future experiments.

This video protocol demonstrates the application of the neurosphere assay for the isolation and expansion of neural stem cells from the ganglionic eminences of embryonic day 14-mouse brain.

Établir embryonnaires de la souris culture de cellules souches neurales utilisant le test Neurosphère

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Imagerie des cellules vivantes des cellules sensorielles de précurseurs d&#39;organes en Intact Drosophile Les chrysalides

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of the central nervous system (CNS); namely, astrocytes, oligodendrocytes and neurons. These characteristics make neural stem and progenitor cells an invaluable renewable source of cells for in vitro studies such as drug screening, neurotoxicology and electrophysiology and also for cell replacement therapy in many neurological diseases. In practice, however, heterogeneity of NSC progeny, low production of neurons and oligodendrocytes, and predominance of astrocytes following differentiation limit their clinical applications. Here, we describe a novel methodology for the generation and subsequent purification of immature neurons from murine NSC progeny using fluorescence activated cell sorting (FACS) technology. Using this methodology, a highly enriched neuronal progenitor cell population can be achieved without any noticeable astrocyte and bona fide NSC contamination. The procedure includes differentiation of NSC progeny isolated and expanded from E14 mouse ganglionic eminences using the neurosphere assay, followed by isolation and enrichment of immature neuronal cells based on their physical (size and internal complexity) and fluorescent properties using flow cytometry technology. Overall, it takes 5-7 days to generate neurospheres and 6-8 days to differentiate NSC progeny and isolate highly purified immature neuronal cells.

This video protocol demonstrates a novel method for the generation and subsequent purification of neuronal progenitor cells from a renewable source of neural stem cells (NSCs) based on their physical (size and internal granularity) and fluorescent properties using flow cytometry technology.

Le test neuroblaste: Un test pour la génération et l&#39;enrichissement des cellules souches neuronales à partir de différenciation des cellules souches neurales Progeny Par cytométrie en flux

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Isolement et culture de cellules de crêtes neurales de tube neural embryonnaire murin

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a source of transplantable cells for regenerative applications after disease or accidents. Neural crest (NC) cells are the precursors for a large variety of adult somatic cells, such as cells from the peripheral nervous system and glia, melanocytes and mesenchymal cells. They are a valuable source of cells to study aspects of human embryonic development, including cell fate specification and migration. Further differentiation of NC progenitor cells into terminally differentiated cell types offers the possibility to model human diseases in vitro, investigate disease mechanisms and generate cells for regenerative medicine. This article presents the adaptation of a currently available in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs. This new protocol requires 18 days of differentiation, is feeder-free, easily scalable and highly reproducible among human embryonic stem cell (hESC) lines as well as human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. Both old and new protocols yield NC cells of equal identity.

Neural crest (NC) cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC) have great potential for modeling human development and disease and for cell replacement therapies. Here, a feeder-free adaptation of the currently widely used in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs is presented.

Dérivation sans chargeur-de cellules progénitrices de la crête neurale souches pluripotentes humaines cellules

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. They successively generate transit amplifying cells (TACs) and neuroblasts that differentiate into neurons once they integrate the olfactory bulbs. Emerging fluorescent activated cell sorting (FACS) techniques have allowed the isolation of NSCs as well as their progeny and have started to shed light on gene regulatory networks in adult neurogenic niches. We report here a cell sorting technique that allows to follow and distinguish the cell cycle dynamics of the above-mentioned cell populations from the adult SVZ with a LeX/EGFR/CD24 triple staining. Isolated cells are then plated as adherent cells to explore in details their cell cycle progression by time-lapse video microscopy. To this end, we use transgenic Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) mice in which cells are red-fluorescent during G1 phase due to a G1 specific red-Cdt1 reporter. This method has recently revealed that proliferating NSCs progressively lengthen their G1 phase during aging, leading to neurogenesis impairment. This method is easily transposable to other systems and could be of great interest for the study of the cell cycle dynamics of brain cells in the context of brain pathologies.

We report a Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)-based method to isolate neural stem cells (NSCs) and their progeny from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain. Applied to Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgenic mice, it allows the study of cell cycle progression by live imaging.

Tri cellulaire des neurones cellules souches et progénitrices de la souris adulte-ventriculaire Zone et Live-imagerie de la dynamique de leur cycle cellulaire

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Enumeration of Neural Stem Cells Using Clonal Assays

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. NSCs and neural progenitors (NPs) are commonly cultured in vitro as neurospheres. This protocol describes in detail how to determine the NSC frequency in a given cell population under clonal conditions. The protocol begins with the seeding of the cells at a density that allows for the generation of clonal neurospheres. The neurospheres are then transferred to chambered coverslips and differentiated under clonal conditions in conditioned medium, which maximizes the differentiation potential of the neurospheres. Finally, the NSC frequency is calculated based on neurosphere formation and multipotency capabilities. Utilities of this protocol include the evaluation of candidate NSC markers, purification of NSCs, and the ability to distinguish NSCs from NPs. This method takes 13 days to perform, which is much shorter than current methods to enumerate NSC frequency.

Neural stem cells (NSCs) refer to cells&#160;which can self-renew and differentiate into the three neural lineages. Here, we describe a protocol to determine NSC frequency in a given cell population using neurosphere formation and differentiation under clonal conditions.

Énumération des cellules souches neurales utilisant clonales Assays

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is characterized by the degeneration of retinal pigment epithelial (RPE) cells, which are a monolayer of cells functionally supporting and anatomically wrapping around the neural retina. Current pharmacological treatments for the non-neovascular AMD (dry AMD) only slow down the disease progression but cannot restore vision, necessitating studies aimed at identifying novel therapeutic strategies. Replacing the degenerative RPE cells with healthy cells holds promise to treat dry AMD in the future. Extensive preclinical studies of stem cell replacement therapies for AMD involve the transplantation of stem cell-derived RPE cells into the subretinal space of animal models, in which the subretinal injection technique is applied. The approach most frequently used in these preclinical animal studies is through the trans-scleral route, which is made difficult by the lack of direct visualization of the needle end and can often result in retinal damage. An alternative approach through the vitreous allows for direct observation of the needle end position, but it carries a high risk of surgical traumas as more eye tissues are disturbed. We have developed a less risky and reproducible modified trans-scleral injection method that uses defined needle angles and depths to successfully and consistently deliver RPE cells into the rat subretinal space and avoid excessive retinal damage. Cells delivered in this manner have been previously demonstrated to be efficacious in the Royal College of Surgeons (RCS) rat for at least 2 months. This technique can be used not only for cell transplantation but also for delivery of small molecules or gene therapies.

Subretinal injection has been widely applied in preclinical studies of stem cell replacement therapy for age-related macular degeneration. In this visualized article, we describe a less risky, reproducible and precisely modified subretinal injection technique via the trans-scleral approach to deliver cells into rat eyes.

Élaboration d’un protocole raffiné pour Trans-sclérale Transplantation sous-rétinienne des cellules épithéliales humaines pigmentaire dans les yeux de Rat

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized niches in vivo and can be isolated and expanded in vitro, serving as an important resource for cell transplantation to repair brain damage. However, NSPCs are heterogeneous and not clearly defined at the molecular level or purified due to a lack of specific cell surface markers. The protocol presented, which has been previously reported, combines a neural-endothelial co-culture system with a metabolic glycan labeling method to identify the surface sialoglycoproteome of primary NSPCs. The NSPC-endothelial co-culture system allows self-renewal and expansion of primary NSPCs in vitro, generating a sufficient number of NSPCs. Sialoglycans in cultured NSPCs are labeled using an unnatural sialic acid metabolic reporter with bioorthogonal functional groups. By comparing the sialoglycoproteome from self-renewing NSPCs expanded in an endothelial co-culture with differentiating neural culture, we identify a list of membrane proteins that are enriched in NSPCs. In detail, the protocol involves: 1) set-up of an NSPC-endothelial co-culture and NSPC differentiating culture; 2) labeling with azidosugar per-O-acetylated N-azidoacetylmannosamine (Ac4ManNAz); and 3) biotin conjugation to modified sialoglycan for imaging after fixation of neural culture or protein extraction from neural culture for mass spectrometry analysis. Then, the NSPC-enriched surface marker candidates are selected by comparative analysis of mass spectrometry data from both the expanded NSPC and differentiated neural cultures. This protocol is highly sensitive for identifying membrane proteins of low abundance in the starting materials, and it can be applied to marker discovery in other systems with appropriate modifications

Presented here is a protocol that combines an in vitro neural-endothelial co-culture system and metabolic incorporation of sialoglycan with bioorthogonal functional groups to expand primary neural stem and progenitor cells and label their surface sialoglycoproteins for imaging or mass-spectrometry analysis of cell surface markers.

Identification des marqueurs de surface cellulaire des cellules neurales primaires de tige et de progéniture par l'étiquetage métabolique du sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...