The authors would like to acknowledge support from Spinal Cord Injury Ontario, the Ontario-China Research and Innovation Fund, the Toronto General and Western Hospital Foundation, and Physicians&#8217; Services Incorporated Foundation. The authors thank Dr. Tasneem Zahir for expert advice in human spinal cord NSPC culture, and Drs. Cindi Morshead and Iris Kulbatski for their expert advice in rat spinal cord NSPC isolation.

Toutes les procédures d&#39;animaux sont approuvés par le Comité de protection des animaux de l&#39;University Health Network, Toronto ON Canada, en conformité avec les politiques établies dans le Manuel sur le soin et l&#39;utilisation des animaux d&#39;expérimentation préparés par le Conseil canadien de protection des animaux. Pour la récolte de tissus de la moelle épinière humaine, l&#39;approbation a été obtenue du comité d&#39;éthique de la recherche du University Health Network et de la Trillium-cadeau Life Foundation qui supervise le don d&#39;organes en Ontario, Canada. 1. Préparation de dissection tampons et de la culture des médias <ol><li> Pour l&#39;isolement de moelle épinière de rat, de préparer 100 ml de tampon de dissection (PBS 1x + 0,6% de glucose + 2% de pénicilline-streptomycine) et réfrigérer. Pour moelle épinière humaine préparer 100 ml de tampon de dissection (1x HBSS + 0,6% de glucose + 2% de pénicilline-streptomycine) et réfrigérer. </li><li> Préparez 100 ml de milieu sans sérum (SFM) et chaude à 37 ° C. Pour préparer la GFD, ajouter 2 mM de L-glutamine, 100 ug / ml pénicilline-streptomycine, B27 2%, et 10% à l&#39;hormone mélange Neurobasal-A milieu. Pour préparer hormone mélange, faire un rapport 1: milieu / F12 1 DMEM contenant 0,6% de glucose, 3 mM de NaHCO 3, HEPES 5 mM, 25 ug / ml d&#39;insuline, 100 ug / ml d&#39;apo-transferrine, 10 uM de putrescine, 30 nM de sélénium, et 20 nM progestérone. </li><li> Préparez le support de placage de croissance EFH facteur enrichi (à la GDF ajouter 20 ng / ml d&#39;EGF, 20 ng / ml de bFGF, et 2 pg / ml d&#39;héparine) et chaude à 37 ° C. Assurez-vous que EFH humain contient des facteurs de croissance recombinants humains (voir le tableau des matériaux). </li></ol> 2. La récolte et la dissection des adultes Rat périventriculaire moelle épinière Tissue <ol><li> Stériliser les instruments de dissection dans l&#39;éthanol et rincer dans une solution saline stérile ou instruments autoclave à l&#39;avance. Donnez rat (6 - 8 semaines) une injection létale de pentobarbital de sodium (1 cc à 65 mg / ml) ou de surdose d&#39;anesthésique (c.-à 4% isofluorane) selon son institution a approuvé le protocole de l&#39;animal. RÉOuse le dos du rat avec 70% d&#39;éthanol et enlever la peau sur la surface dorsale avec de grands ciseaux de dissection. </li><li> Tenir les ciseaux perpendiculaires à la surface dorsale, coupée transversalement la colonne vertébrale au-dessus des membres postérieurs. Utilisez de petits ciseaux pour couper longitudinalement le muscle dorsal recouvrant la colonne vertébrale dans une direction rostrale pour exposer les apophyses épineuses. </li><li> À partir de l&#39;extrémité caudale exposée, insérez rongeurs ou d&#39;un petit instrument de coupe osseuse émoussée extradurally dans la face latérale du canal rachidien dans l&#39;espace entre la moelle épinière et la colonne vertébrale. Faire de petites coupures dans la lame (arcs osseux gauche et à droite des apophyses épineuses de chaque côté des vertèbres) et soigneusement décoller la lame pour exposer la moelle épinière (figure 1A-D). Assurez l&#39;angle des pales est peu profonde et parallèle à la corde afin de la moelle épinière sous-jacente ne soit pas endommagé. </li><li> Continuer laminectomie en direction rostrale aux Expose la moelle épinière thoracique et cervical. </li><li> Exciser doucement la moelle épinière de la colonne vertébrale avec une pince de tissus contondants et utilisation microciseaux à couper soigneusement les racines pour libérer le cordon. Placez la moelle épinière excisée dans une boîte de Pétri contenant 4 ° C tampon de dissection du rat stérile (décrit ci-dessus en 1.1). Rincez le tissu dans un tampon C à dissection 4 ° fraîchement préparé et l&#39;aide de ciseaux coupent la moelle épinière transversalement en segments de 1 cm (figure 1E). </li><li> Pour chaque segment de tissu, utiliser une main pour tenir le tissu avec des pinces fines. Avec l&#39;autre main, utiliser microciseaux à retirer soigneusement les méninges qui recouvrent, la matière blanche, et la plupart de la matière grise à l&#39;aide d&#39;un microscope à dissection. Sinon, utilisez une pince fine (Dumont N ° 4) à se décoller plus de la matière grise et blanche, ne laissant que la région périventriculaire de la moelle épinière qui comprend l&#39;épendyme et une petite quantité de la matière environnante gris (figure 1F-H).</li><li> Mutualiser le tissu périventriculaire disséqué dans un plat de 10 cm de Petri stérile contenant un tampon de dissection du rat froid. </li></ol> 3. La récolte et la dissection des adultes de la moelle épinière humaine périventriculaire Tissue Remarque: les tissus de la moelle épinière humaine est récolté à partir de donneurs de greffes d&#39;organes adultes (donateurs étaient âgés de 2 à 60 ans) après les autres organes ont été prélevés pour la transplantation d&#39;organes. Le Trillium-cadeau Programme Life du obtient le consentement pour l&#39;élimination des tissus à des fins de recherche de la famille du patient et informe notre équipe de récolte en temps opportun de sorte que nous avons été en mesure de récolter les cordons dans les 2 heures de clampage aortique. Donneurs adultes mâles et femelles ayant une sérologie négative et aucune infection sont acceptées. <ol><li> Tissus récolte de façon stérile dans la salle d&#39;opération par une approche antérieure en utilisant la même exposition antérieure déjà disséqué pour le prélèvement d&#39;organes par le transp d&#39;organeséquipe de récolte lant. </li><li> Exposer la colonne vertébrale antérieure par rétraction avec de grandes épandeurs de côtes et grands écarteurs de paddle des tissus et des organes restants, y compris les gros vaisseaux sanguins. </li><li> Utiliser une scie sternale monté avec une longue lame pour couper à travers les disques intervertébraux aux extrémités rostrale et caudale de la longueur désirée de la colonne vertébrale à réséquer. Angle de la scie environ 45 ° dedans pour couper un creux triangulaire de la partie latérale des corps vertébraux arrêt juste avant le canal rachidien. </li><li> Retirer en bloc les aspects médiaux des corps vertébraux des segments souhaités à l&#39;aide d&#39;ostéotomes courbes et un maillet en prenant soin d&#39;éviter de couper à travers la dure-mère. Ensuite, soulevez délicatement la dure recouvert la moelle épinière avec une pince à griffes et fortement inciser les extrémités rostrale et caudale de la moelle. Utilisez longs ciseaux et des pinces à sectionner bilatéralement les racines individuelles. </li><li> Placer le segment excisé de la moelle épinière dans 4 °; Tampon stérile C (1x HBSS + 0,6% de glucose + 2% de pénicilline-streptomycine) dans un grand tube à essai pour le transport vers la chambre de culture de tissu. </li> <li> Remarque: En règle générale, un 3 - segment de 6 cm de la moelle épinière de la colonne thoracique supérieure et / ou la mi-à-faible niveau thoracique est enlevé dans la salle d&#39;opération dans des conditions stériles dès que possible après l&#39;arrêt de la circulation et placé dans un tampon stérile froide . Le temps écoulé entre la cessation de la circulation et la suppression de la moelle épinière varie avec le temps nécessaire pour récolter les organes ciblés pour don et a varié de 45 min à 2 h. Si le cœur et les poumons ont également été enlevés, la dissection peut être pris loin rostralement de récolter une partie de la moelle cervicale inférieure ainsi. </li><li> Disséquer les tissus de la moelle épinière humaine dès que possible après la récolte, généralement dans les 3 heures. Retirer la dure-mère et les méninges autres avec une pince. Rincer le tissu de la moelle épinière fraîchement préparé dans du tampon de dissection C à 4 ° C etcouper transversalement en segments de 1 cm. </li><li> Avec l&#39;aide d&#39;un microscope à dissection, exciser les méninges qui recouvrent, la matière blanche, et la plupart de la matière grise en utilisant des pinces de tissus, pinces fines et microciseaux pour chaque segment de tissu. Mutualiser le tissu disséqué périventriculaire, qui comprend l&#39;épendyme et une petite quantité de la matière environnante gris, dans un plat de 10 cm de Petri stérile contenant tampon froid de dissection humaine. </li></ol> 4. Isolement et culture des adultes et Rat NSPCs de la moelle épinière de l&#39;homme <ol><li> Effectuez les étapes suivantes de manière aseptique dans une hotte à flux laminaire. <ol><li> Émincer le rat ou le tissu disséqué périventriculaire humain dans 1 mm 3 pièces avec microciseaux. </li><li> Enzymatique dissocier le tissu haché avec des enzymes protéolytiques en utilisant le kit de dissociation papaïne comme indiqué dans le tableau des matériaux / réactifs. Note: les composants réactifs comprennent 4 flacons; Vial 1: solution saline équilibrée de Earle (EBSS), Vial 2: containin Papaing L-cystéine et de l&#39;EDTA, Vial 3: désoxyribonucléase I (DNase), Vial 4: inhibiteur ovomucoïde protease avec de l&#39;albumine de sérum bovin (BSA). Remarque: Remarque: La papaïne est une protéase sulfhydryle qui a une large spécificité pour des substrats protéiques. La papaïne ici est dérivé du latex à partir de la plante de papaye Carica et dégrade la plupart des substrats protéiques plus largement que les protéases pancréatiques. Pendant le processus de dissociation, il ya de l&#39;ADN causant des dommages aux cellules d&#39;être libérés dans le milieu de dissociation qui va augmenter la viscosité et de faire pipetage difficile. Ainsi, la DNase est inclus dans la procédure d&#39;isolement des cellules à digérer l&#39;ADN sans endommager les cellules intactes. Ovomucoïdes glycoprotéine sont des inhibiteurs de protéase utilisés pour inhiber l&#39;activité de la papaïne après l&#39;étape de dissociation. </li></ol></li><li> À la première utilisation, reconstituer le mélange inhibiteur albumine ovomucoïde (flacon 4) avec 32 ml d&#39;EBSS (1 flacon), puis stocker à 4 ° C et à utiliser pour les isolements ultérieures.Remarque: On obtient ainsi une solution à une concentration efficace de 10 mg d&#39;inhibiteur ovomucoïde et 10 mg d&#39;albumine par ml. </li><li> Ajouter 5 ml d&#39;EBSS (flacon 1) de la papaïne un flacon (flacon 2), ce qui donne une solution à 20 unités de papaïne / ml dans 1 mM de L-cystéine avec 0,5 mM d&#39;EDTA. Vérifier que la solution de papaïne semble clair quand il est complètement dissous, sinon placer le flacon dans un bain d&#39;eau à 37 C ° d&#39;une dizaine de minutes jusqu&#39;à ce que la papaïne est complètement dissous pour assurer la pleine activité de l&#39;enzyme. </li><li> Ajouter 500 ul d&#39;EBSS (flacon 1) dans un flacon de DNase (flacon 3) et mélanger doucement DNase est sensible à la dénaturation par cisaillement. Ajouter 250 ul de la solution de DNase dans le flacon contenant la papaïne, ce qui entraîne une concentration finale d&#39;environ 20 unités / ml de papaïne et 0,005% de DNase. Sauvegardez l&#39;équilibre de la fiole de DNase à utiliser plus tard. </li><li> Placez le rat hachée ou un tissu humain dans la solution de papaïne tel que préparé à l&#39;étape 4.4 ci-dessus. Pour l&#39;isolement de tissu humain, diviser le tissu haché à parts égales entre deuxflacons de papaïne (environ 0,2 g / fiole). </li><li> Incuber à 37 ° C avec agitation constante sur une plate-forme à bascule pour dissocier le tissu dans la solution de papaïne activée. Incuber tissu de rat pendant 45 minutes à 1 heure, et le tissu humain pendant 1 à 2 heures en fonction de la quantité de tissu haché, environ 0,2 à 0,4 g respectivement. </li><li> Triturer le mélange avec une pipette 10 ml de dissocier les morceaux de tissu restants pour donner une suspension de cellules trouble. Transférer la suspension cellulaire (ne pas inclure tous les morceaux de tissu non dissocié) dans un tube stérile conique de 15 ml et centrifuger à 300 g pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Remettre en suspension le culot cellulaire dans du milieu contenant de l&#39;ovomucoïde, un inhibiteur de la papaïne. <ol><li> Préparer la solution par mélange de l&#39;ovomucoïde 2,7 ml EBSS (flacon 1) avec 300 ul de la solution d&#39;inhibiteur de l&#39;albumine ovomucoïde reconstituée (flacon 4) dans un tube conique de 15 ml. Ajouter 150 pi de solution de DNase (flacon 3) enregistrés à l&#39;étape 4.4 ci-dessus. </li><li> Jeter le surnageant deles cellules en culot et immédiatement remettre en suspension le culot cellulaire dans le mélange d&#39;albumine d&#39;inhibiteur dilué DNase. </li></ol></li><li> Séparer les cellules intactes les membranes cellulaires par centrifugation à travers une seule étape à gradient de densité discontinu. <ol><li> Préparer le gradient de densité discontinu par addition de 5 ml de solution d&#39;albumine-inhibiteur (flacon 4) à un tube de 15 ml, et en utilisant une pipette de 5 ml, doucement et la couche lentement la suspension cellulaire (préparé comme décrit ci-dessus à l&#39;étape 4.8) au-dessus de la solution d&#39;albumine-inhibiteur. </li><li> Centrifuger à 70 g pendant 6 min à température ambiante. </li><li> Remarque: L&#39;interface entre les deux couches de la pente doit être clairement visible, bien que le mélange à cette limite minimal n&#39;a aucune incidence sur le résultat. Fragments membranaires restent à l&#39;interface et cellules dissociées culot au fond du tube. </li></ol></li><li> Pour les cellules de rat, jeter le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml de rat moyenne EFH (pré-chauffé à 37 ° C).Compter densité cellulaire en temps réel avec un hémocytomètre et la plaque les cellules dans un flacon de culture T25 à une densité de 10 cellules / ul dans EFH. Le rendement typique de cellules provenant de tissu de rat est d&#39;environ 2 x 10 6 cellules avec environ 80% viability.If cultures clonales sont désirés, les cellules de semence à une densité inférieure à 10 cellules / ul. Incuber les flacons à 37 ° C dans 5% de CO 2 et de permettre aux cultures de se développer au repos pendant 1 semaine pour éviter l&#39;agrégation des sphères. </li><li> Pour les cellules humaines, éliminer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 10 ml de milieu EFH humaine (pré-chauffé à 37 ° C). On filtre la suspension de cellules à travers un filtre cellulaire en nylon de 40 pm a suivi avec 30 ml d&#39;EFH pour éliminer les fragments de myéline et la membrane cellulaire. Centrifugeuse à 300 g pendant 5 minutes et remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml de milieu EFH. </li><li> Comptez densité de cellules vivantes avec un hémocytomètre et plaque les cellules humaines dans des plaques de culture à 6 puits à une densité de 10 5 cellules / puits dans un volume total5 ml EFH / puits. Le rendement typique de cellules provenant de tissu humain est d&#39;environ 1 x 10 6 cellules avec environ 70% de viabilité. Puits pré-manteau avec un substrat adhérente comme Matrigel (voir note ci-dessous). Diluer à un ratio de 40 ul Matrigel: 1 ml GDF. </li><li> Remarque: En variante, d&#39;autres substrats tels que adhérentes poly-D-lysine / laminine, la fibronectine, le collagène ou peuvent être utilisés. </li><li> Incuber les plaques à 37 ° C dans 5% de CO 2 et de permettre aux cultures de se développer au repos pendant 1 semaine. </li></ol> 5. Le repiquage du rat adulte et NSPCs de la moelle épinière humains <ol><li> NSPCs Rat formeront de petits neurosphères environ 70 m de diamètre à 1 semaine d&#39;ensemencement initial; NSPCs hebdomadaires par la collecte de la suspension cellulaire, la centrifugation à 300 xg pendant 5 min, et trituration mécanique de la boulette de cellules de neurosphères passage dissocier les rats. </li><li> Ensemencer les cellules dissociées dans des flacons T25 contenant rat milieu frais EFH. Alternativement,utiliser milieu de rat climatisé de 50% pour les passages. Le rendement typique de NSPCs de rats à des passages est d&#39;environ 5 x 10 6 cellules qui augmente de façon exponentielle avec le nombre de passages. </li><li> Pour les cultures humaines, une semaine après le dépôt initial, remplacer la moitié du milieu de culture frais avec EFH deux fois par semaine pour permettre aux cellules d&#39;adhérer au substrat. En général, 1 à 2 semaines plus tard, une fois que les cellules ont fixé au substrat, remplacer l&#39;ensemble du volume du milieu de culture deux fois par semaine avec EFH frais. </li><li> cellules Subculture avant d&#39;atteindre la confluence entre 4 - 8 semaines. <ol><li> des cellules de sous-culture de cellules détacher du substrat enzymatique (voir le tableau des matériaux) avec 2 ml d&#39;enzyme par puits incubés pendant environ 10 min à 37 ° C. Recueillir suspension cellulaire, centrifuger à 300 g pendant 5 min, et remettre doucement le culot cellulaire dans 1 ml de milieu fraîchement préparé EFH. </li><li> Compter les cellules vivantes avec un hémocytomètre et plaque les cellules dans des plaques de culture à 6 puits (pré-coATED comme ci-dessus à l&#39;étape 4.12) à une densité de 10 5 cellules / puits dans un volume total de 5 ml EFH / puits. Le rendement typique de NSPCs humaines à des passages est d&#39;environ 2 x 10 6 cellules et généralement cela va doubler avec le passage. Généralement, de maintenir les cultures avec 50% de milieu EFH conditionné 2 - 3 fois par semaine entre passages. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Au cours de la dissection de la moelle épinière soins de tissu de rat doivent être prises pour ne pas endommager la moelle épinière tout en effectuant la laminectomie. Il est plus facile d&#39;isoler le tissu périventriculaire lorsque les segments de la moelle épinière sont intacts. Les segments de tissus devraient être complètement immergés dans un tampon de dissection et les méninges recouvrant la matière blanche et peuvent être découpées en bandes longitudinales avec microciseaux. Alternativement, for...

NSPCs cellules multipotentes sont commis à la lignée de neurones qui peut auto renouveler et élargir facilement in vitro. Nous nous référons à ces cellules comme une population mixte de cellules souches / progénitrices neurales car ils présentent des propriétés de cellules souches multipotentes auto-renouvellement et les progéniteurs plus restreints. NSPCs se trouvent à la fois dans le cerveau du fœtus et de l&#39;adulte et la moelle épinière 1,2. Chez l&#39;adulte, NSPCs sont normalement repos et résident dans des niches spécifiques, y compris la zone sous-ventriculaire qui tapisse les ventricules latéraux 2-4, et dans la région périventriculaire entourant le canal central de la moelle épinière de 5,6. Typiquement, NSPCs sont cultivées comme neurosphères flottants ou comme monocouches adhérentes dans un milieu sans sérum supplémenté avec de l&#39;EGF et bFGF, qui sélectionnent mitogenes pour les populations de cellules souches / progénitrices. Le dosage de neurosphère initialement développé par Reynolds et Weiss 2, est le plus couramment utilisé pour la culture etdévelopper des cellules souches neurales. NSPCs montrent multipotence quand ils sont étalées dans un milieu contenant du sérum exempt de facteur de croissance, se différencier en neurones, astrocytes, oligodendrocytes et. Multipotentes, NSPCs d&#39;auto-renouvellement peuvent être isolés et mis en culture à partir du rongeur adulte moelle épinière lorsque le tissu en culture comprend les régions du canal central 6,7. Un avantage potentiel dans l&#39;utilisation de NSPCs générées lors de la moelle épinière adulte, par opposition à générer des cellules provenant d&#39;autres régions est que ces cellules spécifiques d&#39;un tissu ressemblent plus étroitement les cellules de la moelle épinière qui sont perdues ou endommagées après une blessure ou d&#39;une maladie. Des travaux antérieurs ont montré que neurosphères dérivées de la moelle épinière adulte humaine ne pouvaient pas être propagées à long terme ou des passages pour générer un nombre suffisant de cellules 8,9. Cependant, avec des modifications dans des conditions de culture, nous avons signalé l&#39;expansion et la transplantation de NSPCs adultes de la moelle épinière humaine dérivés, ce qui démontre que l&#39;auto-renouvellementNSPCs multipotentes et peuvent être isolées à partir de moelle épinière de l&#39;adulte humain de donneurs de transplantation d&#39;organes 10. En premier lieu, l&#39;élimination de la majeure partie de la matière blanche au cours de la dissection et la culture de ces cellules adhérentes sur un substrat dans un milieu de croissance enrichi en facteur choisi pour adultes humains en prolifération NSPCs de la moelle épinière. Dans ce protocole, nous décrivons la récolte de la moelle épinière de rats adultes et à partir de donneurs humains de transplantation d&#39;organes, la dissection du tissu péri-ventriculaire, et l&#39;isolement, la culture et l&#39;expansion de NSPCs.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#10010023</td>
			<td>Dissection buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X HBSS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#14175095</td>
			<td>Dissection buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td># G-6152</td>
			<td>Prepare 30% glucose stock solution for dissection buffer and hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#15140-148</td>
			<td>Dissection buffer and culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal-A&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#10888-022</td>
			<td>Culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine, 200mM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#25030-081</td>
			<td>Culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#12587010</td>
			<td>Culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#11885084</td>
			<td>Hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#21700-075</td>
			<td>Hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td># S-5761</td>
			<td>Prepare 7.5% NaHCO3 stock solution for hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#H9136</td>
			<td>Prepare 1M HEPES stock solution for hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#I-5500</td>
			<td>Hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apo-transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#T-2252</td>
			<td>Hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td># P7505</td>
			<td>Hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selenium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#S-9133</td>
			<td>Hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#P-6149</td>
			<td>Hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF, mouse</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#E4127</td>
			<td>Prepare 100 &#956;g/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF, human recombinant</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#E9644</td>
			<td>Prepare 100 &#956;g/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF, human recombinant</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#F0291</td>
			<td>Prepare 100 &#956;g/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin, 10000U</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#H3149</td>
			<td>Prepare 27.3 mg/ml stocks in hormone mix and aliquot; EFH medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain dissociation kit</td>
			<td>Worthington Biochemicals</td>
			<td>#LK003150</td>
			<td>Contains EBSS, papain, DNase, ovomucoid protease inhibitor with BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pentobarbital</td>
			<td>Bimeda &#8211; MTC Animal Health Inc</td>
			<td>DIN 00141704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Forceps: Addisons</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>#11006-12&#160;</td>
			<td>Serrated standard tip; micro-tip also available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps: Dumont #4</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>#11241-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>#15024-10</td>
			<td>Round-handled Vannas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rongeurs</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td>N1430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mm Petri dishes&#160;</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 Culture flasks</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>156367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#956;m nylon cell strainer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA21008-949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plates</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>CA73520-906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, growth factor reduced (100X)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Thaw according to directions and freeze aliquots; use diluted at a ratio of 40 &#956;l Matrigel: 1 ml SFM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of neural stem/progenitor cells from the periventricular region of the adult rat and human spinal cord

Rat adulte et les cellules humaines de la moelle épinière neurales souches / progénitrices (NSPCs) cultivées dans un milieu de croissance enrichi en facteur permet la prolifération des multipotentes, et les cellules souches neurales expansibles auto-renouvellement. Dans des conditions sérum, ces NSPCs multipotentes seront différencier, générer des neurones, des astrocytes et des oligodendrocytes,. Le tissu prélevé est enzymatiquement dissocié dans une solution de papaïne-EDTA et ensuite dissocié mécaniquement et séparés par un gradient de densité discontinu pour obtenir une suspension cellulaire unique, qui est plaqué dans un milieu neurobasal additionné de facteur de croissance épidermique (EGF), facteur de croissance basique des fibroblastes (bFGF ), et de l&#39;héparine. Rats adultes de la moelle épinière NSPCs sont cultivées comme neurosphères flottants et adultes humains NSPCs de la moelle épinière sont cultivées comme cultures adhérentes. Dans ces conditions, adultes de la moelle épinière NSPCs prolifèrent, marqueurs expresses de cellules précurseurs, et peuvent être élargies en permanence lors du passage. Ces cellules peuvent be étudiée in vitro en réponse à divers stimuli, et des facteurs exogènes peuvent être utilisés pour promouvoir restriction de la lignée d&#39;examiner la différenciation des cellules souches neurales. Multipotentes NSPCs ou leur progéniture peuvent également être transplantées dans divers modèles animaux pour évaluer la réparation régénérative.

Rats adultes de la moelle épinière cellules cultivées dans une culture en suspension dans un milieu EFH se former de petites neurosphères (colonies de cellules non différenciées) dans 1 semaine de placage initial. Dans les cultures primaires, la plupart des cellules étalées mourront et les cellules souches du facteur sensible croissance va proliférer et sont choisis dans le milieu EFH. Par passage 3, il y aura de nombreux neurosphères flottant librement à environ 100 m de diamètre (figure 2A).</stron...

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Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

The adult mammalian spinal cord contains neural stem/progenitor cells (NSPCs) that can be isolated and expanded in culture. This protocol describes the harvesting, isolation, culture, and passaging of NSPCs generated from the periventricular region of the adult spinal cord from the rat and from human organ transplant donors.

Isolement de neurones cellules souches / progénitrices de la région périventriculaire du Rat des adultes et de la moelle épinière humaine

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

isolation-neural-stemprogenitor-cells-from-periventricular-region

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

12.1K vues.  Toronto Western Research Institute and Krembil Neuroscience Center. The adult mammalian spinal cord contains neural stem/progenitor cells (NSPCs) that can be isolated and expanded in culture. This protocol describes the harvesting, isolation, culture, and passaging of NSPCs generated from the periventricular region of the adult spinal cord from the rat and from human organ transplant donors. 

Vidéo: Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose dependent. Human term placenta is rich in MSC and is a physically large tissue that is generally discarded following birth. Placenta is an ideal starting material for the large-scale manufacture of multiple cell doses of allogeneic MSC. The placenta is a fetomaternal organ from which either fetal or maternal tissue can be isolated. This article describes the placental anatomy and procedure to dissect apart the decidua (maternal), chorionic villi (fetal), and chorionic plate (fetal) tissue. The protocol then outlines how to isolate MSC from each dissected tissue region, and provides representative analysis of expanded MSC derived from the respective tissue types. These methods are intended for pre-clinical MSC isolation, but have also been adapted for clinical manufacture of placental MSC for human therapeutic use.

Herein we describe methods for the dissection of fetal and maternal tissues from human term placenta, followed by isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells (MSC) from these tissues.

Isolement et expansion de mésenchymateuses cellules souches / stromales dérivées de placenta humain Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Recherche

Biologie du développement

Isolation and Expansion of Adult Canine Hippocampal Neural Precursors

The rate of neurogenesis within the adult hippocampus has been shown to vary across mammalian species. The canine hippocampus, demonstrating a structural intermediacy between the rodent and human hippocampi, is therefore a valuable model in which to study adult neurogenesis. In vitro culture assays are an essential component of characterizing neurogenesis and adult neural precursor cells, allowing for precise control over the cellular environment. To date however, culture protocols for canine cells remain under-represented in the literature. Detailed here are systematic protocols for the isolation and culture of hippocampal neural precursor cells from the adult canine brain. We demonstrate the expansion of canine neural precursor cells as floating neurospheres and as an adherent monolayer culture, producing stable cell lines that are able to differentiation into mature neural cell types in vitro. Adult canine neural precursors are an underused resource that may provide a more faithful analogue for the study of human neural precursors and the cellular mechanisms of adult neurogenesis.

The canine brain is a valuable model in which to study adult neurogenesis. Presented here are protocols for isolating and expanding adult canine hippocampal neural precursor cells from primary brain tissue.

Isolement et expansion des adultes Canine hippocampiques Neural Précurseurs

The rate of neurogenesis within the adult hippocampus has been shown to vary across mammalian species. The canine hippocampus, demonstrating a structural ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly gained attention because they do not pose any ethical or moral concerns. Current methods to isolate MSCs from UC yield low amounts of cells with variable proliferation potentials. Since UC is an anatomically-complex organ, differences in MSC properties may be due to the differences in the anatomical regions of their isolation. In this study, we first dissected the cord/placenta samples into three discrete anatomical regions: UC, cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP). Second, two distinct zones, cord lining (CL) and Wharton&#39;s jelly (WJ), were separated. The explant culture technique was then used to isolate cells from the four sources. The time required for the primary culture of cells from the explants varied depending on the source of the tissue. Outgrowth of the cells occurred within 3 - 4 days of the CPJ explants, whereas growth was observed after 7 - 10 days and 11 - 14 days from CL/WJ and FP explants, respectively. The isolated cells were adherent to plastic and displayed fibroblastoid morphology and surface markers, such as CD29, CD44, CD73, CD90, and CD105, similarly to bone marrow (BM)-derived MSCs. However, the colony-forming efficiency of the cells varied, with CPJ-MSCs and WJ-MSCs showing higher efficiency than BM-MSCs. MSCs from all four sources differentiated into adipogenic, chondrogenic, and osteogenic lineages, indicating that they were multipotent. CPJ-MSCs differentiated more efficiently in comparison to other MSC sources. These results suggest that the CPJ is the most potent anatomical region and yields a higher number of cells, with greater proliferation and self-renewal capacities in vitro. In conclusion, the comparative analysis of the MSCs from the four sources indicated that CPJ is a more promising source of MSCs for cell therapy, regenerative medicine, and tissue engineering.

Here, we present a protocol for the dissection of human umbilical cord (UC) and fetal placenta sample into cord lining (CL), Wharton&#39;s jelly (WJ), cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP) for the isolation and characterization of mesenchymal stromal cells (MSCs) using the explant culture technique.

Isolement et caractérisation de cellules mésenchymateuses stromales du cordon ombilical humain et fœtale Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. Currently, efforts are being made to regenerate damaged cartilage with ex vivo expanded chondrocytes or bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMSCs). However, the restricted viability and instability of these cells limit their application in cartilage reconstruction. Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) have received scientific attention as a new alternative for regenerative applications. With unlimited self-renewal ability and multipotency, hiPSCs have been highlighted as a new replacement cell source for cartilage repair. However, obtaining a high quantity of high-quality chondrogenic pellets is a major challenge to their clinical application. In this study, we used embryoid body (EB)-derived outgrowth cells for chondrogenic differentiation. Successful chondrogenesis was confirmed by PCR and staining with alcian blue, toluidine blue, and antibodies against collagen types I and II (COL1A1 and COL2A1, respectively). We provide a detailed method for the differentiation of cord blood mononuclear cell-derived iPSCs (CBMC-hiPSCs) into chondrogenic pellets.

Here, we propose a protocol for chondrogenic differentiation from cord blood mononuclear cell-derived human induced pluripotent stem cells.

Formation de granulés chondrogéniques à partir de cellules souches pluripotentes induites par sang de cordon

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and colleagues1. Later, others documented the existence of similar types of EPCs originating from bone marrow2,3. More recently, Yoder and Ingram showed that EPCs derived from umbilical cord blood had a higher proliferative potential compared to ones isolated from adult peripheral blood4,5,6. Apart from being involved in postnatal vasculogenesis, EPCs have also shown promise as a cell source for creating tissue-engineered vascular and heart valve constructs7,8. Various isolation protocols exist, some of which involve the cell sorting of mononuclear cells (MNCs) derived from the sources mentioned earlier with the help of endothelial and hematopoietic markers, or culturing these MNCs with specialized endothelial growth medium, or a combination of these techniques9. Here, we present a protocol for the isolation and culture of EPCs using specialized endothelial medium supplemented with growth factors, without the use of immunosorting, followed by the characterization of the isolated cells using Western blotting and immunostaining.

The goal of this protocol is to isolate endothelial progenitor cells from umbilical cord blood. Some of the applications include using these cells as a biomarker for identifying patients with cardiovascular risk, treating ischemic diseases, and creating tissue-engineered vascular and heart valve constructs.

Isolement des cellules endothéliales progénitrices du sang de cordon ombilical humain

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells (NPCs)

Human brain development proceeds through a series of precisely orchestrated processes, with earlier stages distinguished by proliferation, migration, and neurite outgrowth; and later stages characterized by axon/dendrite outgrowth and synapse formation. In neurodevelopmental disorders, often one or more of these processes are disrupted, leading to abnormalities in brain formation and function. With the advent of human induced pluripotent stem cell (hiPSC) technology, researchers now have an abundant supply of human cells that can be differentiated into virtually any cell type, including neurons. These cells can be used to study both normal brain development and disease pathogenesis. A number of protocols using hiPSCs to model neuropsychiatric disease use terminally differentiated neurons or use 3D culture systems termed organoids. While these methods have proven invaluable in studying human disease pathogenesis, there are some drawbacks. Differentiation of hiPSCs into neurons and generation of organoids are lengthy and costly processes that can impact the number of experiments and variables that can be assessed. In addition, while post-mitotic neurons and organoids allow the study of disease-related processes, including dendrite outgrowth and synaptogenesis, they preclude the study of earlier processes like proliferation and migration. In neurodevelopmental disorders, such as autism, abundant genetic and post-mortem evidence indicates defects in early developmental processes. Neural precursor cells (NPCs), a highly proliferative cell population, may be a suitable model in which to ask questions about ontogenetic processes and disease initiation. We now extend methodologies learned from studying development in mouse and rat cortical cultures to human NPCs. The use of NPCs allows us to investigate disease-related phenotypes and define how different variables (e.g., growth factors, drugs) impact developmental processes including proliferation, migration, and differentiation in only a few days. Ultimately, this toolset can be used in a reproducible and high-throughput manner to identify disease-specific mechanisms and phenotypes in neurodevelopmental disorders.

Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells NPCs

Neurodevelopmental processes such as proliferation, migration, and neurite outgrowth are often perturbed in neuropsychiatric diseases. Thus, we present protocols to rapidly and reproducibly assess these neurodevelopmental processes in human iPSC-derived NPCs. These protocols also allow the assessment of the effects of relevant growth factors and therapeutics on NPC development.

Détection rapide des phénotypes de développement neurologique dans des cellules précurseurs neurales humaines (PNJ)

Human brain development proceeds through a series of precisely orchestrated processes, with earlier stages distinguished by proliferation, migration, and ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of the heart after ischemic injury. When activated, epicardial cells undergo a process known as epithelial to mesenchymal transition (EMT) to provide cells to the regenerating myocardium. Furthermore, the epicardium contributes via secretion of essential paracrine factors. To fully appreciate the regenerative potential of the epicardium, a human cell model is required. Here we outline a novel cell culture model to derive primary epicardial derived cells (EPDCs) from human adult and fetal cardiac tissue. To isolate EPDCs, the epicardium is dissected from the outside of the heart specimen and processed into a single cell suspension. Next, EPDCs are plated and cultured in EPDC medium containing the ALK 5-kinase inhibitor SB431542 to maintain their epithelial phenotype. EMT is induced by stimulation with TGF&#946;. This method enables, for the first time, the study of the process of human epicardial EMT in a controlled setting, and facilitates gaining more insight in the secretome of EPDCs that may aid heart regeneration. Furthermore, this uniform approach allows for direct comparison of human adult and fetal epicardial behavior.

The epicardium plays a crucial role in the development and repair of the heart by providing cells and growth factors to the myocardial wall. Here, we describe a method to culture human primary epicardial cells that enables the study and comparison of their developmental and adult characteristics.

L’isolement et la Culture de cellules primaires épicardiques spécimens de coeur adultes et du foetus humain

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

Isolation and Characterization of Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells from Preterm and Term Infants

Mesenchymal stem cells (MSCs) have considerable therapeutic potential and attract increasing interest in the biomedical field. MSCs are originally isolated and characterized from bone marrow (BM), then acquired from tissues including adipose tissue, synovium, skin, dental pulp, and fetal appendages such as placenta, umbilical cord blood (UCB), and umbilical cord (UC). MSCs are a heterogeneous cell population with the capacity for (1) adherence to plastic in standard culture conditions, (2) surface marker expression of CD73+/CD90+/CD105+/CD45-/CD34-/CD14-/CD19-/HLA-DR- phenotypes, and (3) trilineage differentiation into adipocytes, osteocytes, and chondrocytes, as currently defined by the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Although BM is the most widely used source of MSCs, the invasive nature of BM aspiration ethically limits its accessibility. Proliferation and differentiation capacity of MSCs obtained from BM generally decline with the age of the donor. In contrast, fetal MSCs obtained from UC have advantages such as vigorous proliferation and differentiation capacity. There is no ethical concern for UC sampling, as it is typically regarded as medical waste. Human UC starts to develop with continuing growth of the amniotic cavity at 4-8 weeks of gestation and keeps growing until reaching 50-60 cm in length, and it can be isolated during the whole newborn delivery period. To gain insight into the pathophysiology of intractable diseases, we have used UC-derived MSCs (UC-MSCs) from infants delivered at various gestational ages. In this protocol, we describe the isolation and characterization of UC-MSCs from fetuses/infants at 19-40 weeks of gestation.

Human umbilical cord (UC) can be obtained during the perinatal period as a result of preterm, term, and postterm delivery. In this protocol, we describe the isolation and characterization of UC-derived mesenchymal stem cells (UC-MSCs) from fetuses/infants at 19-40 weeks of gestation.

Isolement et caractérisation des humains provenant du cordon ombilical cellules souches mésenchymateuses de prématurés et les nouveau-nés à terme

Mesenchymal stem cells (MSCs) have considerable therapeutic potential and attract increasing interest in the biomedical field. MSCs are originally ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily functions. Biomimetics is the imitation of the models, systems, and elements of nature for the purpose of solving complex human problems1. Skin biomimetics is a useful tool for in vitro disease research and in vivo regenerative medicine. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have the characteristic of unlimited proliferation and the ability of differentiation to three germ layers. Human iPSCs are generated from various primary cells, such as blood cells, keratinocytes, fibroblasts, and more. Among them, cord blood mononuclear cells (CBMCs) have emerged as an alternative cell source from the perspective of allogeneic regenerative medicine. CBMCs are useful in regenerative medicine because human leukocyte antigen (HLA) typing is essential to the cell banking system. We provide a method for the differentiation of CBMC-iPSCs into keratinocytes and fibroblasts and for generation of a 3D skin organoid. CBMC-iPSC-derived keratinocytes and fibroblasts have characteristics similar to a primary cell line. The 3D skin organoids are generated by overlaying an epidermal layer onto a dermal layer. By transplanting this 3D skin organoid, a humanized mice model is generated. This study shows that a 3D human iPSC-derived skin organoid may be a novel, alternative tool for dermatologic research in vitro and in vivo.

We propose a protocol that shows how to differentiate induced pluripotent stem cell-derived keratinocytes and fibroblasts and generate a 3D skin organoid, using these keratinocytes and fibroblasts. This protocol contains an additional step of generating a humanized mice model. The technique presented here will improve dermatologic research.

Génération de peau 3D Organoïde de dérivés du sang de cordon induite par les cellules souches pluripotentes

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism

Hematopoietic stem progenitor cells (HSPCs) have distinct metabolic plasticity, which allows them to transition from their quiescent state to a differentiation state to sustain demands of the blood formation. However, it has been difficult to analyze the metabolic status (mitochondrial respiration and glycolysis) of HSPCs due to their limited numbers and lack of optimized protocols for non-adherent, fragile HSPCs. Here, we provide a set of clear, step-by-step instructions to measure metabolic respiration (oxygen consumption rate; OCR) and glycolysis (extracellular acidification rate; ECAR) of murine bone marrow-LineagenegSca1+c-Kit+ (LSK) HSPCs. This protocol provides a higher amount of LSK HSPCs from murine bone marrow, improves the viability of HSPCs during incubation, facilitates extracellular flux analyses of non-adherent HSPCs, and provides optimized injection protocols (concentration and time) for drugs targeting oxidative phosphorylation and glycolytic pathways. This method enables the prediction of the metabolic status and the health of HSPCs during blood development and diseases.

Hematopoietic stem progenitor cells (HSPCs) transition from a quiescent state to a differentiation state due to their metabolic plasticity during blood formation. Here, we present an optimized method for measuring mitochondrial respiration and glycolysis of HSPCs.