Ce travail a été soutenu par le NIH R01 GM56244 à Ani, qui inclut les fonds attribués par l&#39;American Recovery and Reinvestment Act de 2009, et par le NIH R01 GM87130 d&#39;Jarp

1. L&#39;isolement des embryons Remarque: Toutes les opérations impliquant des souris doivent être effectués en conformité avec les soins des animaux et des politiques appropriées d&#39;utilisation et des protocoles <ol><li> Vérifier la présence d&#39;une fiche d&#39;accouplement chez la souris femelle le matin après l&#39;accouplement et de séparer les femelles fécondées par des mâles haras en les plaçant dans une cage différente. Midi de la journée que la fiche d&#39;accouplement est observé est considéré comme jour embryonnaire 0,5 (E 0,5) de développement. </li><li> À E8.5, (ou le stade désiré, si différent), le sacrifice de la souris en utilisant un protocole approuvé. </li><li> Mouiller le ventre de l&#39;animal euthanasié à l&#39;éthanol 70% et d&#39;ouvrir la cavité abdominale. Les sites d&#39;implantation indiquant la présence d&#39;embryons en développement sont considérés comme un «perles sur un fil&quot; arrangement sur toute la longueur de chaque corne utérine (figure 1A). Avec des ciseaux, enlever les deux cornes utérines, couper chaque site d&#39;implantation individuelle de se séparer (figure 1B) et les placer dans un plat de 100 mm de Pétri contenant température ambiante (TA) moyen de dissection (DMEM, 10% de sérum de veau fœtal, HEPES 20 mM pH 7,4 , 60 pg / ml de pénicilline, la streptomycine 2 mM). </li><li> En utilisant une pince, retirer chaque embryon et les membranes entourant le tissu utérin (figure 1C) et les placer dans un milieu de dissection douce. </li><li> Isoler embryons individuels sous un microscope de dissection à l&#39;aide des pinces. A ce stade de développement, les embryons sont entourés par le pariétal du sac vitellin, qui contacte le tissu deciduum, le viscéral du sac vitellin et de l&#39;amnios. L&#39;amnios est une membrane transparente qui est en contact direct avec l&#39;embryon. Le sac vitellin viscéral se trouve entre l&#39;amnios et le feuillet pariétal jaune et se distingue facilement dans E8.5 E9.5-embryons par la présence de vaisseaux sanguins importants qui nourrissent l&#39;embryon. Retirez chaque embryon à partir de ses membranes entourant et le transfert individuellement dans une nouvelle plaque contenant les médias de dissection pour enlever l&#39;excès de sang. Le stade de développement peut varier d&#39;un embryon à l&#39;embryon et entre les portées; représentant E8.5 embryons et un embryon de E9.5 représentatifs sont présentés dans la figure 1D. </li><li> Transfert chaque embryon d&#39;un tube eppendorf de 1,5 ml contenant 200 ul de médias dissection (décrit dans l&#39;étape 4 ci-dessus). </li></ol> 2. Homogénéisation de l&#39;embryon isolé <ol><li> Ajouter 20 unités de collagénase de type II dans un volume de 200 ul (dilué dans du phosphate 1X Dubbecco du sérum physiologique tamponné; DPBS) à chaque tube Eppendorf. </li><li> Agitez doucement échantillons dans un shaker à 37 ° C à 100 rpm pendant 20 min. </li><li> Resuspendre bien par pipetage pour perturber des amas de cellules. </li><li> Appliquer la suspension de cellules sur le dessus de la crépine de cellules stériles (maillage de 40 um) placée sur un tube eppendorf de 1,5 ml. </li><li> Appliquer immédiatement 600 pl de la température ambiante 1X DPBS sur le dessus de la crépine de cellule pour compléter la séparation. Jeter le filtre. </li><li> Centrifuger les échantillons à 4 ° C à 4000 xg pendant 5 min. </li><li> Jeter le surnageant. </li><li> Reprendre le culot dans 1 ml de DPBS 1X RT. </li><li> Centrifuger les échantillons à 4000 xg pendant 1 min à température ambiante. </li><li> Jeter le surnageant. </li><li> Reprendre le culot dans 200 pl de la dissection des médias RT. </li><li> Compter les cellules embryonnaires. Il ya une moyenne 3-5 x 10 6 cells/E8.5 embryon. </li></ol> 3. Croix-link chromatine <ol><li> Ajouter 5,6 l de formaldéhyde à 37% des 200 échantillons ul pour une concentration finale de 1% de formaldehyde. </li><li> Incuber les échantillons pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Centrifuger les échantillons à 4 ° C à 4000 xg pendant 3 min. </li><li> Jeter le surnageant. </li><li> Resuspendre les cellules de froid 1X DPBS contenant 80 ul / ml cocktail inhibiteur de protéase (PIC). </li><li> Centrifuger les échantillons à 4 ° C à 4000 xg pendant 3 min. </li><li> Jeter le surnageant. À cette étape, les échantillons peuvent être congelés à -80 ° C. Les prélèvements congelés, réticulé sont stables pendant plusieurs mois. </li></ol> 4. Sonication <ol><li> Reprendre le culot cellulaire dans 100 ul de tampon SDS RT lyse (50 mM Tris-HCl (pH 8,1), EDTA 10 mM et SDS à 1% avec PIC fraîchement ajoutée à 1 ul PIC/800 volume total ul). Lorsque resuspendues, ajouter un supplément de 100 ul de tampon RT lyse SDS afin de promouvoir la remise en suspension. Mélangez bien à la pipette et de l&#39;inversion. </li><li> Incuber la suspension cellulaire sur la glace pendant 10 min. </li><li> Soniquer cellules lysées à l&#39;ADN de cisaillement entre 200 et 500 paires de bases en utilisant une Bioruptor Diagenode ™ UCD200 (5 min x 8 fois: réglage de l&#39;amplitude de 30 sec sec on/30 rabais sur élevée (320 watts) de puissance). Les échantillons doivent être entourés par un coulis de glace. Ne pas laisser les échantillons à chaud au-dessus de 4 ° C ou à congeler. Il ya de nombreux types de sonicateurs disponibles. Conditions sonication devrait être optimisé pour chaque sonicateur d&#39;entraîner en cisaillement de l&#39;ADN réticulé à une longueur d&#39;environ 500 pb. </li><li> Centrifuger les échantillons soniqué à 4 ° C à 14000 xg pendant 10 min. </li><li> Transfert le surnageant dans un nouveau tube Eppendorf pré-refroidi sur la glace. </li><li> Divisez l&#39;échantillon soniqué dans un maximum de 5 aliquotes. Nous avons déterminé empiriquement que l&#39;on E8.5 embryon peut être divisé en 5 aliquotes. Des échantillons plus petits ou plus grands peuvent être redimensionnées en conséquence. À cette étape, l&#39;échantillon peut être conservé à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation ultérieure. </li><li> Réserve une aliquote de l&#39;utiliser comme entrée et conserver à -20 ° C jusqu&#39;à l&#39;étape 6 lorsque la croix-liens seront inversés. Diluer les aliquotes d&#39;autres de 10 fois en tampon de dilution ChIP (16,7 mM Tris-HCl (pH 8,1), 1,2 mM EDTA, 1,1% de Triton X-100, 167 mM de NaCl et 0,01% SDS) contenant PIC fraîchement ajoutée à 1 μl/800 pi de tampon. </li></ol> 5. Pré-compensation et immunoprécipitation <ol><li> Pré-claire le surnageant dilué avec 75 ul de saumon-Sperm ADN / protéines A ou G-50 agarose coulis% à 4 ° C, avec rotation, pendant 1 heure. Utilisez soit la protéine A ou de perles protéines G devrait être déterminée par l&#39;anticorps à utiliser pour la puce. Par exemple, billes de protéine A sont recommandés pour les anticorps de lapin, tandis que la protéine G perles sont recommandés pour les anticorps IgG de souris de chèvre ou une anticorps. Pour plus d&#39;informations, voir les recommandations faites par le fabricant de billes. </li><li> Centrifuger à 4 ° C à 2500 xg pendant 1 min. </li><li> Transférer le surnageant dans un nouveau pré-refroidi tube Eppendorf. </li><li> Ajouter anticorps (4 mg / échantillon) à l&#39;aliquote de pré-effacé et incuber une nuit à 4 ° C avec rotation. </li></ol> 6. Le lavage des complexes protéines-chromatine perles <ol><li> Ajouter 60 ul de sperme de saumon ADN / protéine A ou G agarose coulis dans chaque flacon et incuber à 4 ° C avec rotation pendant 1 heure. Utiliser le même type de billes utilisées pour la pré-compensation à l&#39;étape 3 ci-dessus. </li><li> Centrifuger à 4 ° C à 1000 xg pendant 1 min. </li><li> Retirer délicatement le surnageant et le jeter. Gardez le complexe ADN-protéines-billes sur la glace. </li><li> Resuspendre et laver le culot comme indiqué ci-dessous avec une tampons de lavage, 2, 3 et 4. Lavez tampons 1-3 doivent être réfrigérés à 4 ° C et lavages avec ces tampons doivent être effectuées à 4 ° C. Tampon de lavage 4 devrait être à la température ambiante et se lave avec ce tampon devrait être effectuée à température ambiante. Chaque lavage est de 5 minutes avec une rotation à la température appropriée. Après chaque lavage, centrifuger à 4 ° C (température ambiante pendant tampon de lavage 4 lavages) à 1000 xg pendant 1 min, puis aspirer délicatement ou retirer le surnageant. </li></ol> Tampon 1: Faible tampon de lavage du sel (20 mM Tris-HCl (pH 8,1), 2 mM EDTA, 1% de Triton X-100, 150 mM de NaCl et 0,1% de SDS), 1 ml x 2 lavages. Tampon 2: High tampon de lavage du sel (20 mM Tris-HCl (pH 8,1), 2 mM EDTA, 1% de Triton X-100, 500 mM de NaCl et 0,1% de SDS), 1 ml x 2 lavages. Tampon 3: tampon LiCl laver le sel (10 mM Tris-HCl (pH 8,1), 1 mM EDTA, 1% IGEPAL-CA630, 0,25 M de LiCl et de l&#39;acide désoxycholique 1% (sel de sodium)), 1 ml x 1 lavage. Tampon 4: tampon TE (10 mM Tris-HCl (pH 8,1), EDTA 1 mM), 1 ml x 2 lavages. 7. Élution du complexe chromatine-anticorps <ol><li> Reprendre le lavage de la chromatine des protéines complexes billes dans 250 ul de tampon d&#39;élution fraîchement préparés (1% SDS, 0,1 M NaHCO 3). Vigoureusement l&#39;échantillon de vortex pendant 5 secondes, puis incuber à température ambiante pendant 15 min avec rotation. </li><li> Centrifuger à 2500 xg pendant 1 min à température ambiante et le transfert de l&#39;éluat dans un tube eppendorf de nouvelles. </li><li> Répétez les étapes 1 et 2 et de combiner les éluats dans le même tube eppendorf. Les éluats doivent être conservés à température ambiante. A l&#39;issue de cette étape, les éluats peuvent être conservés à -20 ° C jusqu&#39;à utilisation ultérieure. </li></ol> 8. Inverse de la Croix-lien et récupérer l&#39;ADN <ol><li> Ajouter 20 ul NaCl 5 M pour 500 éluat ul (40 ug / ml pour le contrôle d&#39;entrée). </li><li> Chauffer les éluats à 65 ° C dans un bain d&#39;eau pendant 4 heures à la nuit. </li><li> 10 ul de chaque échantillon (y compris le contrôle d&#39;entrée) peut être exécuté sur un gel agarose 2% à côté de marqueurs de taille allant de 0,1 à 1 kpb de vérifier la taille des fragments d&#39;ADN. L&#39;ADN apparaîtra comme un frottis et non une bande nette. Le reste des échantillons peut être laissé à 65 ° C tandis que le gel est en marche. </li><li> Récupérer l&#39;ADN de chaque échantillon en utilisant un kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen). Ajouter 600 ul de tampon QG (fourni dans le kit) pour optimiser l&#39;ADN d&#39;adsorption avec la membrane de silice dans une colonne spin QIAquick et 200 pi d&#39;isopropanol dans un échantillon de 500 pl. Notez que le tampon QG contient un indicateur de pH permettant de déterminer facilement le pH de l&#39;échantillon. Si la couleur de l&#39;échantillon vire du jaune au violet (pH&gt; 7,5) après le mélange, ajouter 10 ul de 3 M NaAcetate (pH 5,2) à l&#39;échantillon et mélanger. Cela réduit le pH du mélange pour maximiser liaison à l&#39;ADN aux perles dans la colonne. </li><li> Avant de charger la colonne, vérifier le mélange afin de déterminer si tout précipité SDS est présent. Si SDS précipitations a eu lieu, l&#39;échantillon doit être réchauffé dans un42 ° C jusqu&#39;à ce bain d&#39;eau, le précipité disparaît. </li><li> Charge 700 ul du mélange dans la colonne de centrifugation QIAquick (colonne violette dans le kit) et centrifuger à RT à 14000 xg pendant 1 min. Jeter le débit à travers de la colonne avant de procéder et répétez cette étape avec le reste de l&#39;échantillon. </li><li> Ajouter 500 ul de tampon QG pour laver la colonne. Centrifuger à 14000 xg RT à 2 min. Jeter le débit à travers de la colonne avant de continuer. </li><li> Laver la colonne avec 700 ul d&#39;un tampon de lavage PE (fourni dans le kit) à laquelle l&#39;éthanol a été ajoutée selon les instructions du fabricant. Centrifuger à 14000 xg RT à 1 min. Jeter le débit à travers de la colonne avant de continuer. </li><li> Répéter l&#39;étape de centrifugation pour éliminer complètement le reste de la mémoire tampon PE de la colonne. Jeter le débit à travers le tube de collecte. </li><li> L&#39;ADN élue de la colonne dans un nouveau tube Eppendorf en ajoutant 60 ul de tampon EB (tampon d&#39;élution fourni dans le kit). </li><li> Centrifuger à température ambiante à 14 000 xg pendant 1 min. L&#39;ADN élue peut être conservé à -20 ° C jusqu&#39;à ce que la détection. A 260 lectures de la matière récupérée en général indiquent des concentrations de 90-120 ng / ul, pour une récupération totale de ~ 6-7 ug par aliquote. Cependant, le ratio de 260/280 Un de ces échantillons est typiquement&gt; 1,8, ce qui suggère que l&#39;ARN est présent dans l&#39;échantillon. Ainsi, le montant exact de l&#39;ADN récupéré peut être inférieur. </li></ol> 9. Analyse d&#39;ADN récupéré <ol><li> SDS peut interférer avec l&#39;activité du PCR Taq polymérase. SDD devrait être complètement éliminé avant d&#39;effectuer la PCR. Incuber l&#39;ADN sur la glace pour précipiter tout résidu de SDS et centrifuger à 4 ° C à 14000 xg pendant 1 min. Transférer le surnageant dans une nouvelle étape eppendorf tube.This est fortement recommandée. </li><li> Les éluats d&#39;ADN peuvent être détectés soit par PCR conventionnelle ou par quantitative PCR en temps réel (Q-PCR) avec des amorces spécifiques pour chaque séquence à analyser. Ul 5-10 éluat ADN total peut être utilisé pour une PCR ou Q-PCR réaction. PCR avec le contrôle d&#39;entrée peut être réalisé avec une dilution de 50 à 10 fois de l&#39;ADN par rapport à la quantité d&#39;autres échantillons. PCR et Q-PCR conditions varient, cependant, la quantité limitée de matériel de départ nécessite d&#39;autres cycles de PCR. Pour la PCR de détection classique, nous recommandons de commencer avec 40 cycles et en ajustant au besoin. </li></ol> 10. Les résultats représentatifs Nous avons utilisé ce protocole pour effectuer puce de deux E8.5 E9.5 et d&#39;embryons (Figure 2). Les résultats démontrent que la myogénine est présent sur le promoteur myogénine dans E8.5 E9.5 et d&#39;embryons. ChIP ADN purifiés ont été analysés par PCR conventionnelle (figure 2A) et par quantitative PCR en temps réel (figure 2B). En revanche, il n&#39;y avait aucune indication de myogénine liant au promoteur myogénine dans le sac vitellin, où myogénine n&#39;est pas exprimé. L&#39;interféron γ-(IFN), le promoteur qui contient des séquences correspondant du site myogénine contraignant, a été utilisé comme un contrôle de la séquence négative. Comme prévu, myogénine n&#39;était pas lié au promoteur IFN dans aucun des échantillons de tissus testés. En E8.5 et 9,5 embryons, myogénine est spécifiquement exprimé dans les somites (figure 3; 6,10), qui sont les précurseurs du muscle squelettique. Ainsi, les résultats indiquent que la myogénine est lié au promoteur myogénine dans les somites sur E8.5 E9.5 et. <img src="/files/ftp_upload/2677/2677fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. E8.5 dissection embryon. (A) Isolé corne utérine (panneau supérieur; plus fort grossissement indiqué dans panneau inférieur). (B) corne utérine coupé avec des ciseaux pour séparer les différents sites d&#39;implantation des embryons contenant individuel. (C) Les embryons dépassant du tissu utérin pendant la dissection. Les flèches marquent embryons encore couverts par les tissus extra-embryonnaires. (D) Deux E8.5 embryons de la même portée. L&#39;embryon sur la gauche n&#39;a pas commencé le processus de transformation. L&#39;embryon sur la droite est en train de tourner. Extrême droite - représentant l&#39;embryon E9.5. <img src="/files/ftp_upload/2677/2677fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Dosage de ChIP démontrant myogénine liant au promoteur myogénine dans E8.5 E9.5 et d&#39;embryons. (Haut) L&#39;analyse PCR conventionnelle de 5 ul d&#39;ADN purifié à partir d&#39;expériences puce en utilisant un anticorps myogénine ou non IgG spécifiques a été réalisée avec des amorces qui amplifient une partie du promoteur myogénine -79 à 69 par rapport au site que le début de la transcription contient un site myogénine contraignante situé à -12 ou amorces qui amplifient une partie du promoteur IFN qui contient une séquence correspondant au site myogénine contraignante situé ~ 1075 pb en amont du site d&#39;initiation de la transcription. Les séquences des amorces utilisées étaient 5&#39;IFN-GCT GAC TCA AGA CCC CGA GGC-3 &#39;et 5&#39;-TGA GGA TGG AGG GGC AGG CC-3&#39;. (Bas) quantitative en temps réel l&#39;analyse par PCR des mêmes échantillons utilisés dans (A). L&#39;données sont tracées en% de l&#39;entrée + / - écart-type. <img src="/files/ftp_upload/2677/2677fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Myogenin est spécifiquement exprimé dans les somites et les embryons des E8.5 E9.5. Monter toute l&#39;hybridation in situ de la myogénine montre expression de l&#39;ARNm spécifique dans les somites. Barre de taille dans l&#39;image E8.5 - 200 um. Barre de taille dans l&#39;image E9.5 - 500 um.

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N., Schwartz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterodimers+of+myogenic+helix-loop-helix+regulatory+factors+and+E12+bind+a+complex+element+governing+myogenic+induction+of+the+avian+cardiac+alpha-actin+promoter.">Heterodimers of myogenic helix-loop-helix regulatory factors and E12 bind a complex element governing myogenic induction of the avian cardiac alpha-actin promoter.</a> Mol Cell Biol. 11, 2439-2450 (1991).</li><li>Brennan, T. J., Chakraborty, T., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+of+the+myogenin+basic+region+identifies+an+ancient+protein+motif+critical+for+activation+of+myogenesis.">Mutagenesis of the myogenin basic region identifies an ancient protein motif critical for activation of myogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 5675-5679 (1991).</li><li>Lassar, A. B., Davis, R. L., Wright, W. E., Kadesch, T., Murre, C., Voronova, A., Baltimore, D., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+activity+of+myogenic+HLH+proteins+requires+hetero-oligomerization+with+E12/E47-like+proteins+in+vivo.">Functional activity of myogenic HLH proteins requires hetero-oligomerization with E12/E47-like proteins in vivo.</a> Cell. 66, 305-315 (1991).</li><li>Chakraborty, T., Brennan, T. J., Li, L., Edmondson, D., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inefficient+homooligomerization+contributes+to+the+dependence+of+myogenin+on+E2A+products+for+efficient+DNA+binding.">Inefficient homooligomerization contributes to the dependence of myogenin on E2A products for efficient DNA binding.</a> Mol Cell Biol. 11, 3633-3641 (1991).</li><li>Cserjesi, P., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myogenin+induces+the+myocyte-specific+enhancer+binding+factor+MEF-2+independently+of+other+muscle-specific+gene+products.">Myogenin induces the myocyte-specific enhancer binding factor MEF-2 independently of other muscle-specific gene products.</a> Mol Cell Biol. 11, 4854-4862 (1991).</li><li>Braun, T., Arnold, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+four+human+muscle+regulatory+helix-loop-helix+proteins+Myf3-Myf6+exhibit+similar+hetero-dimerization+and+DNA+binding+properties.">The four human muscle regulatory helix-loop-helix proteins Myf3-Myf6 exhibit similar hetero-dimerization and DNA binding properties.</a> Nucleic Acids Res. 19, 5645-5651 (1991).</li><li>Serna, d. e. l. a., L, I., Ohkawa, Y., Berkes, C. A., Bergstrom, D. A., Dacwag, C. S., Tapscott, S. J., Imbalzano, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyoD+targets+chromatin+remodeling+complexes+to+the+myogenin+locus+prior+to+forming+a+stable+DNA-bound+complex.">MyoD targets chromatin remodeling complexes to the myogenin locus prior to forming a stable DNA-bound complex.</a> Mol Cell Biol. 25, 3997-4009 (2005).</li><li>Blais, A., Tsikitis, M., Acosta-Alvear, D., Sharan, R., Kluger, Y., Dynlacht, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+initial+blueprint+for+myogenic+differentiation.">An initial blueprint for myogenic differentiation.</a> Genes Dev. 19, 553-569 (2005).</li><li>Cao, Y., Kumar, R. M., Penn, B. H., Berkes, C. A., Kooperberg, C., Boyer, L. A., Young, R. A., Tapscott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+and+gene-specific+analyses+show+distinct+roles+for+Myod+and+Myog+at+a+common+set+of+promoters.">Global and gene-specific analyses show distinct roles for Myod and Myog at a common set of promoters.</a> EMBO J. 25, 502-511 (2006).</li><li>Ohkawa, Y., Yoshimura, S., Higashi, C., Marfella, C. G., Dacwag, C. S., Tachibana, T., Imbalzano, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myogenin+and+the+SWI/SNF+ATPase+Brg1+maintain+myogenic+gene+expression+at+different+stages+of+skeletal+myogenesis.">Myogenin and the SWI/SNF ATPase Brg1 maintain myogenic gene expression at different stages of skeletal myogenesis.</a> J Biol Chem. 282, 6564-6570 (2007).</li><li>Davie, J. K., Cho, J. H., Meadows, E., Flynn, J. M., Knapp, J. R., Klein, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+gene+selectivity+of+the+myogenic+basic+helix-loop-helix+transcription+factor+myogenin+in+embryonic+muscle.">Target gene selectivity of the myogenic basic helix-loop-helix transcription factor myogenin in embryonic muscle.</a> Dev Biol. 311, 650-664 (2007).</li><li>Metivier, R., Penot, G., Hubner, M. R., Reid, G., Brand, H., Kos, M., Gannon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+receptor-alpha+directs+ordered,+cyclical,+and+combinatorial+recruitment+of+cofactors+on+a+natural+target+promoter.">Estrogen receptor-alpha directs ordered, cyclical, and combinatorial recruitment of cofactors on a natural target promoter.</a> Cell. 115, 751-763 (2003).</li><li>Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).</li></ol>

Expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les directives et règlements établis par l&#39;Université du Massachusetts Medical IACUC école.

Dans le protocole décrit ChIP, nous montrons que le régulateur de myogénine myogénique est associé avec le promoteur myogénine dans les tissus musculaires squelettiques précurseur présent dans seule E8.5 E9.5 et d&#39;embryons. Des études antérieures ont largement caractérisé myogénine liant à la boîte E contenant des séquences, à commencer par la première des expériences in vitro de retard sur gel en utilisant in vitro, traduits ou l&#39;ADN des bactéries produites myogén...

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>ChIP Assay Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Upstate Cell Signaling Solutions, Millipore</td>
<td>17-295</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Collagenase Type II</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17101015</td>
<td>Dilution by 1 x PBS</td>
</tr>
<tr>
<td>Dulbecco&#x2019;s modified eagle medium (DMEM) </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco Labs, Invitrogen</td>
<td>12100-061</td>
<td>High glucose content</td>
</tr>
<tr>
<td>Dulbecco&#x2019;s phosphate buffered saline 1X (DPBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco Labs, Invitrogen</td>
<td>14190-144</td>
<td>Calcium chloride free, Magnesium chloride free</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mediatech, Inc.</td>
<td>35-010-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gel extraction kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>QIAquick</td>
<td>28704</td>
<td>50 reaction kit</td>
</tr>
<tr>
<td>Penicillin/streptomycin stock solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco Labs, Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5000 &mu;g/ml concentration</td>
</tr>
<tr>
<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P8340</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Salmon sperm DNA /Protein A agarose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>16-157</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>myogenin antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td>
<td>sc-576</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Normal rabbit IgG</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>12-370</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Platinum PCR Supermix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11306-016</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GoTaq Q-PCR master mix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>A6001</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

chromatin immunoprecipitation assay for tissue-specific genes using early-stage mouse embryos

Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) est un outil puissant pour identifier les protéines: les interactions chromatine qui se produisent dans le contexte de cellules vivantes 1-3. Cette technique a été largement exploitée dans les cellules de culture de tissus, et dans une moindre mesure, dans les tissus primaires. L&#39;application de ChIP pour les tissus de rongeurs embryonnaire, surtout en période précoce du développement, est compliquée par la quantité limitée de tissu et de l&#39;hétérogénéité des cellules et de tissus dans l&#39;embryon. Nous présentons ici une méthode pour effectuer une puce en utilisant jours dissocié embryonnaire 8.5 (E8.5) embryon. Chromatine cisaillé à partir d&#39;un seul embryon E8.5 peut être divisé en jusqu&#39;à cinq aliquotes, qui permet au matériel de l&#39;enquêteur suffisants pour les contrôles et des enquêtes de protéines spécifiques: les interactions chromatine. Nous avons utilisé cette technique pour commencer à documenter des protéines: les interactions chromatine lors de la spécification du tissu-spécifique des programmes d&#39;expression génique. L&#39;hétérogénéité des types de cellules dans un embryon limite nécessairement l&#39;application de cette technique car le résultat est la détection de protéines: les interactions chromatine sans distinguer selon que les interactions se produisent dans tous, un sous-ensemble, ou un seul type cellulaire (s). Cependant, l&#39;examen du tissu-spécifique des gènes pendant ou après l&#39;apparition de tissu-spécifique l&#39;expression des gènes est possible pour deux raisons. Tout d&#39;abord, immunoprécipitation de facteurs tissulaires spécifiques des isolats nécessairement chromatine du type cellulaire où le facteur est exprimé. Deuxièmement, immunoprécipitation de coactivateurs et les histones contenant modifications post-traductionnelles qui sont associés à l&#39;activation des gènes ne devraient être disponibles sur les gènes et les séquences régulatrices de gènes dans le type cellulaire où le gène est ou a été activé. La technique devrait être applicable à l&#39;étude de la plupart des tissus spécifiques événements d&#39;activation des gènes. Dans l&#39;exemple décrit ci-dessous, nous avons utilisé E8.5 et E9.5 embryons de souris pour examiner les facteurs liant à un promoteur du gène spécifique du muscle squelettique. Somites, qui sont les précurseurs de tissus à partir de laquelle les muscles squelettiques du tronc et des branches vont se former, sont présents à E8.5-9.5 4,5. Myogenin est un facteur de régulation nécessaire à la différenciation du muscle squelettique 6-9. Les données démontrent que la myogénine est associée à son propre promoteur de E8.5 E9.5 et d&#39;embryons. Parce que la myogénine est exprimé uniquement dans les somites, à ce stade de développement 6,10, les données indiquent que les interactions avec les myogénine son propre promoteur sont déjà produites dans les cellules précurseurs des muscles squelettiques dans E8.5 embryons.

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Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Nous démontrons une immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) méthode pour identifier les interactions de facteurs au tissu-spécifique des gènes pendant ou après l&#39;apparition de tissu-spécifique l&#39;expression des gènes dans les tissus embryonnaires de souris. Ce protocole devrait être largement applicable pour l&#39;étude de l&#39;activation de gènes spécifiques de tissus comme il se produit pendant le développement embryonnaire normal.

Assay immunoprécipitation de la chromatine des gènes spécifiques de tissus en utilisant des embryons de souris en début de

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

chromatin-immunoprecipitation-assay-for-tissue-specific-genes-using

Research

JoVE Journal

Biology

18.0K vues.  University of Massachusetts Medical School. Nous démontrons une immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) méthode pour identifier les interactions de facteurs au tissu-spécifique des gènes pendant ou après l'apparition de tissu-spécifique l'expression des gènes dans les tissus embryonnaires de souris. Ce protocole devrait être largement applicable pour l'étude de l'activation de gènes spécifiques de tissus comme il se produit pendant le développement embryonnaire normal.

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Placing Growth Factor-Coated Beads on Early Stage Chicken Embryos

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development. These proteins have been shown to be critical for cell fate determination, cell migration, and formation of neural circuits. Neuronal induction and patterning involve bone morphogenetic protein (BMP), sonic hedgehog (SHH), fibroblast growth factor (FGF), among others. In particular, the expression pattern of Fgf8 is in close proximity to regions expressing BMP4 and SHH. This expression pattern is consistent with developmental interactions that facilitate patterning in the telencephalon.

Here we provide a visual demonstration of a method in which an in ovo preparation can be used to test the effects of Fgfs in the formation of the forebrain. Beads are coated with protein and placed in the developing neural tube to provide sustained exposure. Because the procedure uses small, carefully placed beads, it is minimally invasive and allows several beads to be placed within a single neural tube. Moreover, the method allows for continued development so that embryos can be analyzed at a more mature stage to detect changes in anatomy and in neural patterning. This simple but useful protocol allows for real time imaging. It provides a means to make spatially and temporally limited changes to endogenous protein levels.

A variety of growth factors and proteins interact to induce cells to take on different cell fates during development. Here we demonstrate the use of an in ovo preparation to address possible interactions between different proteins in development by placing beads on E2.5 chick embryos.

Placer du facteur de croissance des billes recouvertes sur les premiers embryons de poulet scène

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development.   These proteins have been shown to be critical for cell ...

Recherche

Biologie

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental factors that might result in epigenetic alterations of gene expression and other molecular pathology. Traditionally, however, expression studies in postmortem brain were confined to quantification of mRNA or protein. The limitations encountered in postmortem brain research   such as variabilities in autolysis time and tissue integrities   are also likely to impact any studies of higher order chromatin structures. However, the nucleosomal organization of genomic DNA   including DNA:core histone binding - appears to be largely preserved in representative samples provided by various brain banks. Therefore, it is possible to study the methylation pattern and other covalent modifications of the core histones at defined genomic loci in postmortem brain. Here, we present a simplified native chromatin immunoprecipitation (NChIP) protocol for frozen (never-fixed) human brain specimens. Starting with micrococcal nuclease digestion of brain homogenates, NChIP followed by qPCR can be completed within three days. The methodology presented here should be useful to elucidate epigenetic mechanisms of gene expression in normal and diseased human brain.

Until recently, expression studies on human brain were limited to quantification of RNA or protein. With the chromatin immunoprecipitation techniques described in this paper, it will be possible to map histone methylation and other epigenetic regulators of gene expression in postmortem brain.

Un dosage de la chromatine pour les tissus du cerveau humain

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

Immunoprécipitation de la chromatine des cellules souches embryonnaires humaines

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited from their latent state in the cytoplasm to cell surface receptors where they are activated by phosphorylation at a single tyrosine residue1. They then dimerize and translocate to the nucleus to drive the transcription of target genes, affecting growth, differentiation, homeostasis and the immune response. Not surprisingly, given their widespread involvement in normal cell processes, dysregulation of STAT function contributes to human disease, particularly to cancers2 and autoimmune diseases3. It is well established that transcription is regulated by alterations to the chromatin template4,5. These alterations include the activities of ATP-dependent complexes, as well as covalent histone modifications and DNA methylation6. Because STAT activation of gene expression is both rapid and transient, it requires specific mechanisms for modulating the chromatin template at STAT-dependent gene loci. To define these mechanisms, we characterize the histone modifications and the enzymatic activities that generate them at gene loci that respond to STAT signaling. This protocol describes chromatin immunoprecipitation, a method that is valuable for the study of STAT signaling to chromatin in activated gene expression.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

This protocol describes how chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used to study the dynamic alterations to the chromatin template that regulate transcription induced by a signal transduction pathway.

Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) pour doser modification des histones dynamique dans l&#39;expression génique dans les cellules humaines Activé

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

Chromosomics: Detection of Numerical and Structural Alterations in All 24 Human Chromosomes Simultaneously Using a Novel OctoChrome FISH Assay

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell nuclei1. The technique uses DNA probes with unique sequences that hybridize to whole chromosomes or specific chromosomal regions, and serves as a powerful adjunct to classic cytogenetics. For instance, many earlier studies reported the frequent detection of increased chromosome aberrations in leukemia patients related with benzene exposure, benzene-poisoning patients, and healthy workers exposed to benzene, using classic cytogenetic analysis2. Using FISH, leukemia-specific chromosomal alterations have been observed to be elevated in apparently healthy workers exposed to benzene3-6, indicating the critical roles of cytogentic changes in benzene-induced leukemogenesis. 
Generally, a single FISH assay examines only one or a few whole chromosomes or specific loci per slide, so multiple hybridizations need to be conducted on multiple slides to cover all of the human chromosomes. Spectral karyotyping (SKY) allows visualization of the whole genome simultaneously, but the requirement for special software and equipment limits its application7. Here, we describe a novel FISH assay, OctoChrome-FISH, which can be applied for Chromosomics, which we define here as the simultaneous analysis of all 24 human chromosomes on one slide in human studies, such as chromosome-wide aneuploidy study (CWAS)8. The basis of the method, marketed by Cytocell as the Chromoprobe Multiprobe System, is an OctoChrome device that is divided into 8 squares, each of which carries three different whole chromosome painting probes (Figure 1). Each of the three probes is directly labeled with a different colored fluorophore, green (FITC), red (Texas Red), and blue (Coumarin). The arrangement of chromosome combinations on the OctoChrome device has been designed to facilitate the identification of the non-random structural chromosome alterations (translocations) found in the most common leukemias and lymphomas, for instance t(9;22), t(15;17), t(8;21), t(14;18)9. Moreover, numerical changes (aneuploidy) in chromosomes can be detected concurrently. The corresponding template slide is also divided into 8 squares onto which metaphase spreads are bound (Figure 2), and is positioned over the OctoChrome device. The probes and target DNA are denatured at high-temperature and hybridized in a humid chamber, and then all 24 human chromosomes can be visualized simultaneously. 
OctoChrome FISH is a promising technique for the clinical diagnosis of leukemia and lymphoma and for detection of aneuploidies in all chromosomes. We have applied this new Chromosomic approach in a CWAS study of benzene-exposed Chinese workers8,10.

A novel fluorescence in situ hybridization (FISH) method that simultaneously examines both numerical and structural chromosome alterations, particularly the specific chromosomal translocations associated with leukemia and lymphoma, of all 24 human chromosomes on a single device in one hybridization, is described.

Chromosomics: détection d&#39;altérations numériques et structurelles dans les 24 chromosomes de l&#39;homme en utilisant simultanément un dosage FISH Novel OctoChrome

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at different developmental stages. Epigenetic regulation contributes to a broad spectrum of biological processes, including cellular differentiation during embryonic development and homeostasis in adulthood. A critical strategy in epigenetic studies is to examine how various histone modifications and chromatin factors regulate gene expression. To address this, Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) is used widely to obtain a snapshot of the association of particular factors with DNA in the cells of interest.
ChIP technique commonly uses cultured cells as starting material, which can be obtained in abundance and homogeneity to generate reproducible data. However, there are several caveats: First, the environment to grow cells in Petri dish is different from that in vivo, thus may not reflect the endogenous chromatin state of cells in a living organism. Second, not all types of cells can be cultured ex vivo. There are only a limited number of cell lines, from which people can obtain enough material for ChIP assay.
Here we describe a method to do ChIP experiment using Drosophila tissues. The starting material is dissected tissue from a living animal, thus can accurately reflect the endogenous chromatin state. The adaptability of this method with many different types of tissue will allow researchers to address a lot more biologically relevant questions regarding epigenetic regulation in vivo1, 2. Combining this method with high-throughput sequencing (ChIP-seq) will further allow researchers to obtain an epigenomic landscape.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

Recently high-throughput sequencing technology has greatly increased sensitivity of Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) experiment and prompted its application using purified cells or dissected tissue. Here we delineate a method to use ChIP technique with Drosophila tissue, which can address the endogenous chromatin state in a well-characterized biological system.

Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) à l&#39;aide Drosophila Tissus

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used method for determining the interactions of different proteins with DNA in chromatin of living cells. Examples include sequence-specific DNA binding transcription factors, histones and their different modification states, enzymes such as RNA polymerases and ancillary factors, and DNA repair components. Despite its ubiquity, there is a lack of up-to-date, detailed methodologies for both bench preparation of material and for accurate analysis allowing quantitative metrics of interaction. Due to this lack of information, and also because, like any immunoprecipitation, conditions must be re-optimized for new sets of experimental conditions, the ChIP assay is susceptible to inaccurate or poorly quantitative results.
Our protocol is ultimately derived from seminal work on transcription factor:DNA interactions1,2 , but incorporates a number of improvements to sensitivity and reproducibility for difficult-to-obtain cell types. The protocol has been used successfully3,4 , both using qPCR to quantify DNA enrichment, or using a semi-quantitative variant of the below protocol.
This quantitative analysis of PCR-amplified material is performed computationally, and represents a limiting factor in the assay. Important controls and other considerations include the use of an isotype-matched antibody, as well as evaluation of a control region of genomic DNA, such as an intergenic region predicted not to be bound by the protein under study (or anticipated not to show changes under the experimental conditions). In addition, a standard curve of input material for every ChIP sample is used to derive absolute levels of enrichment in the experimental material. Use of standard curves helps to take into account differences between primer sets, regardless of how carefully they are designed, and also efficiency differences throughout the range of template concentrations for a single primer set. Our protocol is different from others that are available5-8 in that we extensively cover the later, analysis phase.

We describe a robust method for chromatin immunoprecipitation using primary T cells. The method is founded on standard approaches, but uses a specific set of conditions and reagents that improve efficiency for limited a quantities of cells. Importantly, a detailed description of the data analysis phase is presented.

Immunoprécipitation de la chromatine efficace en utilisant des quantités limitées de biomasse

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a  widely-used method for determining the interactions of different proteins with  DNA in chromatin of living ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation (ChIP) and massively parallel sequencing can be utilized to identify the repertoire of mammalian DNA sequences bound by transcription factors in vivo. "Next-generation" genome sequencing technologies provide 1-2 orders of magnitude increase in the amount of sequence that can be cost-effectively generated over older technologies thus allowing for ChIP-seq methods to directly provide whole-genome coverage for effective profiling of mammalian protein-DNA interactions.
For successful ChIP-seq approaches, one must generate high quality ChIP DNA template to obtain the best sequencing outcomes. The description is based around experience with the protein product of the gene most strongly implicated in the pathogenesis of type 2 diabetes, namely the transcription factor transcription factor 7-like 2 (TCF7L2). This factor has also been implicated in various cancers.
Outlined is how to generate high quality ChIP DNA template derived from the colorectal carcinoma cell line, HCT116, in order to build a high-resolution map through sequencing to determine the genes bound by TCF7L2, giving further insight in to its key role in the pathogenesis of complex traits.

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

The combination of chromatin immunoprecipitation and ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) can identify and map protein-DNA interactions in a given tissue or cell line. Outlined is how to generate a high quality ChIP template for subsequent sequencing, using experience with the transcription factor TCF7L2 as an example.

Génération de haute qualité Immunoprécipitation de la chromatine Patron de l&#39;ADN pour le séquençage à haut débit (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

Isolation efficace et rapide des embryons à un stade précoce de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Graines

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are frequently used to identify chemicals that modulate gene expression. Chemical screens that assay fluorescence in live zebrafish often rely on expensive, specialized equipment for high content screening. We describe a procedure using a standard epifluorescence microscope with a motorized stage to automatically image zebrafish embryos and detect tissue-specific fluorescence. Using transgenic zebrafish that report estrogen receptor activity via expression of GFP, we developed a semi-automated procedure to screen for estrogen receptor ligands that activate the reporter in a tissue-specific manner. In this video we describe procedures for arraying zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in a 96-well plate and adding small molecules that bind estrogen receptors. At 72-96 hpf, images of each well from the entire plate are automatically collected and manually inspected for tissue-specific fluorescence. This protocol demonstrates the ability to detect estrogens that activate receptors in heart valves but not in liver.

Described here is a protocol for semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos.

Imagerie semi-automatique de la fluorescence spécifique de tissu dans embryons de poissons zèbres

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...