이 작품은 미국의 복구 및 2009 년 재투자 법을 통해 취득 자금을 포함 ANI에 NIH R01 GM56244 지원하고, NIH R01 GM87130에 의해 JARP하는 것이었다

1. 태아의 분리 참고 : 마우스와 관련된 모든 작업이 적절한 동물 관리 및 사용 정책 및 프로토콜에 따라 수행되어야 <ol><li> 여성의 마우스의 짝짓기 플러그의 존재 짝짓기 후 아침 확인하고 다른 케이지에서 그들을 배치하여 스터드 남성에서 여성 성관계를 구분한다. 짝짓기 플러그가 관찰되는 그날 정오가 개발의 배아 일 0.5 (E0.5)로 간주됩니다. </li><li> E8.5에서 (또는 원하는 단계와 다를 경우), 승인된 프로토콜을 사용하여 마우스를 희생. </li><li> 70 % 에탄올로 euthanized 동물의 배를 습식과 복강을 엽니다. 개발 태아의 존재를 나타내는 주입 사이트는 각각의 자궁 호른 (그림 1A)의 길이를 따라 정렬 &quot;문자열에 구슬&quot;로 볼 수 있습니다. 가위를 사용하면, 두 자궁 뿔을를 제거 분리 개별적으로 주입 사이트를 잘라 (그림 1B)와 실내 온도 (RT)를 포함하는 100mm 배양 접시에 넣어 해부 매체 (DMEM 10 % 태아 소 혈청, 20 MM HEPES의 산도 7.4 60 μg / ML 페니실린, 스트렙토 마이신이 당연). </li><li> 포셉를 사용하여 자궁 (그림 1C)에서 각각의 배아 및 주변 세포막을 제거하고 신선한 해부 매체에서 그들을 놓으십시오. </li><li> 포셉를 사용하여 해부 현미경으로 각각의 배아를 분리. 개발이 단계에서, 태아는 정수리 난황, 연락처 deciduum 조직, 내장 난황과 양막합니다. 둘러싸인 양막은 태아와 직접 접촉에있는 투명한 막이다. 내장 난황은 양막과 정수리 부분 노른자의 색 사이에 위치하고 있으며 쉽게 배아를 육성 두드러진 혈관의 존재에 의해 E8.5 - E9.5의 배아에서 구별됩니다. 주변 점막에서 각 배아를 제거하고 여분의 혈액을 제거하기 위해 절개 미디어를 포함하는 새 접시에 개별적으로 전송할 수 있습니다. 발달 단계는 배아에서 배아와 새끼 사이 다를 수 있으며, 대표적인 E8.5 배아 및 대표 E9.5의 배아는 그림 1D 표시됩니다. </li><li> 해부 미디어 (앞의 4 단계에서 설명) 200 μl를 포함하는 1.5 ML eppendorf 튜브 각 배아를 전송합니다. </li></ol> 2. 절연 배의 균질화 <ol><li> 각 eppendorf 튜브에 200 UL의 볼륨 (DPBS 1X Dubbecco의 인산에 희석 살린 버퍼)에 Collagenase 유형 II의 20 단위를 추가합니다. </li><li> 부드럽게 20 분 100 rpm으로 37 ° C 통에 샘플을 흔들. </li><li> 세포의 대단히 짧은 시간을 혼란 pipetting으로 잘 Resuspend. </li><li> 1.5 ML eppendorf 튜브를 통해 위치 살균 셀 스트레이너 (40 μm의 메쉬 크기)의 위에 세포 현탁액을 적용합니다. </li><li> 즉시 분리를 완료 실온 셀 스트레이너 위에 1X DPBS 600 μl를 적용합니다. 스트레이너를 폐기하십시오. </li><li> 4 견본을 원심 분리기 ° C를 5 분 4,000 XG에. </li><li> 뜨는 폐기하십시오. </li><li> RT 1X의 DPBS 1 ML에서 펠렛을 Resuspend. </li><li> RT 1 분 4,000 XG에서 샘플을 원심 분리기. </li><li> 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 알티 해부 미디어 200 μl의 펠렛을 Resuspend. </li><li> 배아 세포를 계산합니다. 평균 3-5 X 10 6 cells/E8.5 배아가 있습니다. </li></ol> 3. 크로스 링크 염색질 <ol><li> 1 %의 포름 알데히드의 최종 농도에 대한 200 μl 샘플에 37 % 포름 알데히드 5.6 μl를 추가합니다. </li><li> RT 10 분 샘플을 품어. </li><li> 4 ° C 3 분 4,000 XG에서 샘플을 원심 분리기. </li><li> 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 80 μl / ML 테아제 억제제 칵테일 (PIC)를 포함하는 차가운 1X DPBS와 세포 Resuspend. </li><li> 4 견본을 원심 분리기 ° C를 3 분 4,000 XG에. </li><li> 뜨는 폐기하십시오. 이 단계에서는 샘플 -80에서 얼어 수 있습니다 ° C. 냉동, 가교 샘플 몇 달 동안 안정합니다. </li></ol> 4. Sonication <ol><li> RT SDS 용해 버퍼 (1 μl PIC/800 μl 전체 볼륨에서 갓 추가 PIC와 함께 50 MM 트리스 - HCL (산도 8.1), 10 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 % SDS) 100 μl의 세포 펠렛을 Resuspend. resuspended 경우, resuspension을 촉진하기 위해 RT SDS의 용해 버퍼의 추가 100 UL를 추가합니다. pipetting과 전도로 잘 섞는다. </li><li> 10 분 얼음에 세포 현탁액을 품어. </li><li> 200 사이 Diagenode Bioruptor를 사용하여 500 basepairs에 전단 DNA에 lysed 세포를 Sonicate ™ UCD200 (5 분 X 8 회 : 높음 (320w) 전원을 30 초 on/30 초의 진폭 설정 해제). 샘플은 얼음 슬러리 둘러싸여 있어야합니다. 샘플 4 ° C 이상의 따뜻한하거나 동결하는 것을 허용하지 않습니다. 사용 가능한 sonicators 많은 종류가 있습니다. Sonication 조건은 약 500 BP의 길이에 교차 연결된 DNA의 전단의 결과 각 sonicator에 최적화된해야합니다. </li><li> 4 sonicated 샘플을 원심 분리기 ° C, 10 분 14,000 XG에. </li><li> 티새로운 eppendorf 튜브 얼음 사전 냉각에 뜨는를 ransfer. </li><li> 5 aliquots 최대로 sonicated 샘플을 나누십시오. 우리는 경험적으로 한 E8.5 배아가 5 aliquots로 나눌 수 있습니다 것으로 나타났습니다. 작은 또는 큰 샘플 크기는 적절하게 크기를 조정하실 수 있습니다. 이 단계에서는 샘플은 -80에 저장할 수 있습니다 ° C 이상 사용까지. </li><li> 상호 링크가 거꾸로 될 때까지 6 단계 -20 ° C에서 입력 및 저장소로 사용하기 위해 예약 한 나누어지는. 1 μl/800에서 갓 추가 PIC를 포함하는 칩 희석 버퍼 (16.7 MM 트리스 - HCL (산도 8.1), 1.2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1.1 % 트리톤 X - 100, 167 MM NaCl 및 0.01 % SDS)에 10 배 다른 aliquots를 희석 μl 버퍼. </li></ol> 5. 사전 지우고 Immunoprecipitation <ol><li> 연어 - 정자의 DNA / 단백질 4 또는 아가로 오스 G - 50 %의 슬러리 ° C, 회전, 1 시간을위한 75 μl 사전 명확 희석 뜨는. 또는 단백질 G 비즈가 칩을 사용하는 항체에 의해 결정되어야 하나 단백질 중 하나를 사용하십시오. 단백질 G 비즈가 염소 항체 드나 마우스 IgG 항체에 대한 1 추천 반면, 예를 들면, 단백질 구슬은 토끼 항체 권장됩니다. 자세한 내용은 비드 제조 업체에 의해 만들어진 권장 사항을 참조하십시오. </li><li> 1 분에 대한 2500 XG 4 ° C에서 원심 분리기. </li><li> 새로운 사전 냉각 eppendorf 튜브에 뜨는를 전송합니다. </li><li> 사전 허가 나누어지는하는 항체 (4 μg / 샘플)을 추가하고 4 박 품어 ° C를 회전. </li></ol> 6. 염색질 단백질 - 비드 콤플렉스 워싱 <ol><li> ° C 회전 1 시간 4 각 유리병과 부화에 연어 정자는 DNA / 단백질 A 또는 G 아가로 오스 슬러리의 60 μl를 추가합니다. 위의 단계 3 미리 삭제에 사용되는 동일한 비드 유형을 사용합니다. </li><li> 1 분 1000 XG 4 ° C에서 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 뜨는을 제거하고 폐기. 얼음에서 DNA - 단백질 비드 복잡한 보관하십시오. </li><li> Resuspend과 같은 세척 버퍼 1, 2와 함께 아래의 감독 펠렛, 3, 4를 씻으십시오. 1-3 ° C가 이러한 버퍼와 세척이 4 수행해야 4 냉장되어야 버퍼 ° C. 와시 버퍼 4 실온에서 수행되어야 상온이 버퍼로 세척에 있어야 씻으십시오. 각 세차 적절한 온도에서 회전 5 분입니다. 4 ° C (세척 버퍼 네 세척을위한 실내 온도) 1 분 1000 XG에서 각 세척, 원심 분리기에 따라 다음 조심스럽게 대기음 또는 표면에 뜨는를 제거하십시오. </li></ol> 버퍼 1 : 낮은 소금 세척 버퍼 (20 MM 트리스 - HCL (산도 8.1), 2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 % 트리톤 X - 100 150 MM NaCl 및 0.1 % SDS), 1 ML X 2 씻는다. 버퍼 2 : 높은 염분 세척 버퍼 (20 MM 트리스 - HCL (산도 8.1), 2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 % 트리톤 X - 100 500 MM NaCl 및 0.1 % SDS), 1 ML X 2 씻는다. 버퍼 3 : LiCl 소금 세척 버퍼 (10 MM 트리스 - HCL (산도 8.1), 1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 % IGEPAL - CA630, 0.25 M LiCl과 1 % deoxycholic의 산성 (나트륨 소금)), 1 X 1 ML 씻으십시오. 버퍼 4 : TE 버퍼 (10 MM 트리스 - HCL (산도 8.1), 1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)), 1 ML X 2 씻는다. 7. 염색질 - 항체 복합 용리 <ol><li> 신선한 용출 버퍼 (1 % SDS, 0.1 M NaHCO 3) 250 μl에 씻어 염색질 단백질 - 비드 복잡한을 Resuspend. 다음 회전 15 분 RT에서 품어 5 초에 대해 적극적으로 소용돌이로 샘플을. </li><li> RT 1 분 2,500 XG에 원심 분리기 새로운 eppendorf 튜브에 eluate를 전송합니다. </li><li> 1 단계와 2 단계를 반복하고 같은 eppendorf 튜브에 eluates을 결합. eluates는 상온에서 보관해야합니다. 이 단계를 완료되면, eluates가 더 사용하기 전까지 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 8. 크로스 링크를 바꾸게되면 DNA를 복구 <ol><li> 500 μl eluate (입력 컨트롤을 40 μl / ML) 20 μl 5 M NaCl을 추가합니다. </li><li> ° C 하루 4 시간을위한 물 목욕 65에서 eluates을 가열. </li><li> 각 샘플 (입력 컨트롤 포함) 10 μl는 DNA 조각의 크기를 확인 0.1-1 kbp를 스패닝 크기 표시 옆에있는 2 % 아가로 오스 겔에서 실행할 수 있습니다. DNA는 얼룩으로 나타납니다 아닌 날카로운 밴드 것입니다. 샘플의 나머지는 65 남아 수 있습니다 ° C 젤가 실행되는 동안. </li><li> QIAquick 젤 추출 키트 (Qiagen)를 사용하여 각 시료에서 DNA를 복구합니다. QIAquick의 스핀 열의와 500 μl의 시료에 이소프로판올 200 μl의 실리카 막과 DNA 흡착을 최적화하기 위해 600 μl QG 버퍼를 (키트에 제공)을 추가합니다. QG 버퍼는 시료의 산도 쉽게 결정을 허용하는 산도 표시기가 포함되어 있습니다. 샘플의 색상은 보라색에 노란색에서 전환하는 경우 (산도&gt; 7.5) 혼합 후, 시료와 혼합 3 M의 NaAcetate 10 μl (산도 5.2) 추가합니다. 이것은 열에있는 비즈에 바인딩 DNA를 극대화하기 위해 혼합물의 산도를 감소시킵니다. </li><li> 전에 칼럼을로드하는 모든 SDS의 침전물이 존재하는지 여부를 확인하기 위해 혼합물을 확인합니다. SDS 강수량이 발생한 경우에는 샘플로 예열한다42 ° C의 물 목욕 침전이 사라질 때까지. </li><li> QIAquick의 스핀 열 (키트에 보라색 열)로 혼합 700 μl를로드 1 분 14,000 XG에서 RT에서 원심 분리기. 진행하기 전에 칼럼에서를 통해 흐름을 삭제하고 샘플의 나머지와 함께이 단계를 반복합니다. </li><li> 열을 씻어 500 μl QG 버퍼를 추가합니다. 2 분 14,000 XG에서 RT에서 원심 분리기. 진행하기 전에 칼럼에서를 통해 흐름을 폐기하십시오. </li><li> 제조 업체의 지시에 따라 에탄올 것이 추가되었습니다하기 위해 PE 세척 버퍼 700 μl (키트에 공급)로 컬럼을 씻으십시오. 1 분 14,000 XG에서 RT에서 원심 분리기. 진행하기 전에 칼럼에서를 통해 흐름을 폐기하십시오. </li><li> 완전히 칼럼에서 PE 버퍼의 나머지 부분을 제거하기 위해 원심 분리 단계를 반복합니다. 을 통해 흐름과 수집 튜브를 폐기하십시오. </li><li> 60 μl EB 버퍼 (용출 버퍼 키트에서 제공)을 추가하여 새로운 eppendorf 튜브에 열을에서 Elute의 DNA. </li><li> 1 분 14,000 XG에 실온에서 원심 분리기. eluted DNA가 검출 때까지 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. 복구 재료의 260 신호는 일반적으로 나누어지는 당 ~ 6-7 UG 총 복구를 위해, 90-120 NG / UL의 농도를 나타냅니다. 그러나 이러한 샘플 280분의 260 비율은 RNA의 예제에있다는 것을 제안, 일반적으로&gt; 1.8입니다. 따라서 복구 DNA의 정확한 금액은 낮을 수 있습니다. </li></ol> 9. 복구된 DNA 분석 <ol><li> SDS는 PCR DNA 형성 촉매 효소의 활동을 방해할 수 있습니다. SDS는 PCR을 수행하기 전에 완전히 제거하여야한다. 1 분 14,000 XG 4에서 잔여 SDS와 원심 분리기 ° C을 촉진하기 위해 얼음에 DNA를 품어. 새로운 eppendorf tube.This 단계에 뜨는을 전송 것은 좋습니다. </li><li> DNA의 eluates은 기존의 PCR 또는 분석 각 시퀀스에 대한 구체적인 primers와 양적 실시간 PCR (Q - PCR)을 통해 검색하실 수 있습니다. 전체 DNA를 eluate 5-10 μl 한 PCR 또는 Q - PCR 반응에 사용할 수 있습니다. 입력 컨트롤 PCR은 다른 샘플의 크기와 비교하여 DNA의 5-10 배 희석과 함께 수행할 수 있습니다. PCR 및 Q - PCR 조건하지만, 다양, 시작 물질의 제한된 양을 추가 PCR 사이클이 필요합니다. 기존의 PCR 검출을 위해, 우리는 40주기 시작하며 필요에 따라 조정하는 것이 좋습니다. </li></ol> 10. 대표 결과 우리는 E8.5과 E9.5의 배아 (그림 2) 모두에서 칩을 수행하기 위해이 프로토콜을 사용하고 있습니다. 결과는 myogenin가 E8.5과 E9.5의 배아에서 myogenin 모터에 존재하는 것을 보여줍니다. 칩 정화의 DNAs은 기존의 PCR (그림 2A)와 양적 실시간 PCR (그림 2B)에 의해 분석되었다. 대조적으로, myogenin이 표현되지 않은 난황에서 myogenin 모터에 바인딩 myogenin의 징후가 없었다. 인터페론 - γ (IFNγ) myogenin 바인딩 사이트를 일치 시퀀스를 포함 발기인은, 부정적인 시퀀스 제어로 사용되었다. 예상했던대로, myogenin는 테스트를 조직 샘플의에서 IFNγ업자에 바인딩되지 않았습니다. 골격근에 엽 성의 전구 물질 있으며,, E8.5 9.5 배아에서 myogenin은 특히 somites (6,10 그림 3)에 표시됩니다. 따라서 결과는 myogenin가 E8.5과 E9.5에서 somites에 myogenin 모터에 바인딩된을 나타냅니다. <img src="/files/ftp_upload/2677/2677fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. E8.5 배아 해부. (A) 절연 자궁 호른 (상단 패널, 하단 패널에 표시 상위 확대). (B) 자궁 경적 개별 배아를 포함하는 개별 주입 사이트를 분리하는 가위로 잘라. (C) 공룡의 태아가 해부하는 동안 자궁에서 튀어나온. 화살표는 여전히 엑스트라 배아 조직의 적용 배아를 표시합니다. 같은 쓰레기에서 (D) 2 E8.5 배아. 왼쪽의 배아 선회하는 과정을 시작하지 않았습니다. 오른쪽에 배아가 돌고를 겪고 있습니다. 맨 오른쪽 - 대표 E9.5의 배아. <img src="/files/ftp_upload/2677/2677fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 칩 분석은 E8.5과 E9.5의 배아에서 myogenin 모터에 바인딩 myogenin를 시연. myogenin 항체 또는 불특정 IgG가 전사의 시작 사이트를 -79에서 69 상대적으로 myogenin 모터의 일부를 증폭 primers로 수행된을 사용하여 칩 실험에서 정화 DNA의 5 UL의 (위) 기존의 PCR 분석되는 -12 또는 전사 시작 사이트의 ~ 1,075 BP 상류에 위치한 myogenin 바인딩 사이트를 일치하는 시퀀스를 포함하는 IFNγ 프로 모터의 일부를 증폭 primers에있는 myogenin 바인딩 사이트가 포함되어 있습니다. 사용 IFNγ의 프라이머 절차가 GAC TCA AGA CCC CGA GGC - 3 &#39;와 5&#39; - TGA GGA GGC TGG AGG AGG CC - 3&#39;5&#39; - GCT되었습니다. (A)에 사용되는 동일한 샘플 (아래) 정량 실시간 PCR 분석.표준 편차 - 데이터 입력 + /의 %로 꾸몄다 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2677/2677fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. Myogenin 특별히 E8.5과 E9.5의 태아의 somites에 표시됩니다. myogenin의 현장 하이브리드화의 전체 마운트 somites에서 특정 mRNA 표현을 보여줍니다. 200 μm의 - E8.5 이미지의 크기 바. E9.5 이미지 크기 모음 - 500 μm의.

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E., Arnold, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus-expressed+myogenic+determination+factors+require+E12+complex+formation+for+binding+to+the+myosin-light-chain+enhancer.">Baculovirus-expressed myogenic determination factors require E12 complex formation for binding to the myosin-light-chain enhancer.</a> Eur J Biochem. 198, 187-193 (1991).</li><li>Chakraborty, T., Brennan, T., Olson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+trans-activation+of+a+muscle-specific+enhancer+by+myogenic+helix-loop-helix+proteins+is+separable+from+DNA+binding.">Differential trans-activation of a muscle-specific enhancer by myogenic helix-loop-helix proteins is separable from DNA binding.</a> J Biol Chem. 266, 2878-2882 (1991).</li><li>French, B. A., Chow, K. L., Olson, E. N., Schwartz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterodimers+of+myogenic+helix-loop-helix+regulatory+factors+and+E12+bind+a+complex+element+governing+myogenic+induction+of+the+avian+cardiac+alpha-actin+promoter.">Heterodimers of myogenic helix-loop-helix regulatory factors and E12 bind a complex element governing myogenic induction of the avian cardiac alpha-actin promoter.</a> Mol Cell Biol. 11, 2439-2450 (1991).</li><li>Brennan, T. J., Chakraborty, T., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+of+the+myogenin+basic+region+identifies+an+ancient+protein+motif+critical+for+activation+of+myogenesis.">Mutagenesis of the myogenin basic region identifies an ancient protein motif critical for activation of myogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 5675-5679 (1991).</li><li>Lassar, A. B., Davis, R. L., Wright, W. E., Kadesch, T., Murre, C., Voronova, A., Baltimore, D., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+activity+of+myogenic+HLH+proteins+requires+hetero-oligomerization+with+E12/E47-like+proteins+in+vivo.">Functional activity of myogenic HLH proteins requires hetero-oligomerization with E12/E47-like proteins in vivo.</a> Cell. 66, 305-315 (1991).</li><li>Chakraborty, T., Brennan, T. J., Li, L., Edmondson, D., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inefficient+homooligomerization+contributes+to+the+dependence+of+myogenin+on+E2A+products+for+efficient+DNA+binding.">Inefficient homooligomerization contributes to the dependence of myogenin on E2A products for efficient DNA binding.</a> Mol Cell Biol. 11, 3633-3641 (1991).</li><li>Cserjesi, P., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myogenin+induces+the+myocyte-specific+enhancer+binding+factor+MEF-2+independently+of+other+muscle-specific+gene+products.">Myogenin induces the myocyte-specific enhancer binding factor MEF-2 independently of other muscle-specific gene products.</a> Mol Cell Biol. 11, 4854-4862 (1991).</li><li>Braun, T., Arnold, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+four+human+muscle+regulatory+helix-loop-helix+proteins+Myf3-Myf6+exhibit+similar+hetero-dimerization+and+DNA+binding+properties.">The four human muscle regulatory helix-loop-helix proteins Myf3-Myf6 exhibit similar hetero-dimerization and DNA binding properties.</a> Nucleic Acids Res. 19, 5645-5651 (1991).</li><li>Serna, d. e. l. a., L, I., Ohkawa, Y., Berkes, C. A., Bergstrom, D. A., Dacwag, C. S., Tapscott, S. J., Imbalzano, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyoD+targets+chromatin+remodeling+complexes+to+the+myogenin+locus+prior+to+forming+a+stable+DNA-bound+complex.">MyoD targets chromatin remodeling complexes to the myogenin locus prior to forming a stable DNA-bound complex.</a> Mol Cell Biol. 25, 3997-4009 (2005).</li><li>Blais, A., Tsikitis, M., Acosta-Alvear, D., Sharan, R., Kluger, Y., Dynlacht, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+initial+blueprint+for+myogenic+differentiation.">An initial blueprint for myogenic differentiation.</a> Genes Dev. 19, 553-569 (2005).</li><li>Cao, Y., Kumar, R. M., Penn, B. H., Berkes, C. A., Kooperberg, C., Boyer, L. A., Young, R. A., Tapscott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+and+gene-specific+analyses+show+distinct+roles+for+Myod+and+Myog+at+a+common+set+of+promoters.">Global and gene-specific analyses show distinct roles for Myod and Myog at a common set of promoters.</a> EMBO J. 25, 502-511 (2006).</li><li>Ohkawa, Y., Yoshimura, S., Higashi, C., Marfella, C. G., Dacwag, C. S., Tachibana, T., Imbalzano, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myogenin+and+the+SWI/SNF+ATPase+Brg1+maintain+myogenic+gene+expression+at+different+stages+of+skeletal+myogenesis.">Myogenin and the SWI/SNF ATPase Brg1 maintain myogenic gene expression at different stages of skeletal myogenesis.</a> J Biol Chem. 282, 6564-6570 (2007).</li><li>Davie, J. K., Cho, J. H., Meadows, E., Flynn, J. M., Knapp, J. R., Klein, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+gene+selectivity+of+the+myogenic+basic+helix-loop-helix+transcription+factor+myogenin+in+embryonic+muscle.">Target gene selectivity of the myogenic basic helix-loop-helix transcription factor myogenin in embryonic muscle.</a> Dev Biol. 311, 650-664 (2007).</li><li>Metivier, R., Penot, G., Hubner, M. R., Reid, G., Brand, H., Kos, M., Gannon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+receptor-alpha+directs+ordered,+cyclical,+and+combinatorial+recruitment+of+cofactors+on+a+natural+target+promoter.">Estrogen receptor-alpha directs ordered, cyclical, and combinatorial recruitment of cofactors on a natural target promoter.</a> Cell. 115, 751-763 (2003).</li><li>Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).</li></ol>

동물 실험은 매사 추세츠 의과 대학 IACUC 대학에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수행되었다.

설명 칩 프로토콜에서는, 우리는 myogenic 조절기 myogenin가 단일 E8.5과 E9.5의 배아에있는 골격근 전구체 조직에서 myogenin 모터와 관련된 것을 보여줍니다. 이전 연구는 광범위 11-20 타겟 유전자 규제 시퀀스의 관련 부분을 인코딩 체외 번역 또는 bacterially 생산 myogenin 및 radiolabeled DNA에 활용하여 체외 겔 이동 실험의 초기부터 시작 시퀀스를 포함하는 E 상자에 바인딩...

<table><tbody><tr><td>ChIP Assay Kit</td><td>Upstate, Millipore</td><td>17-295</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type II</td><td>Invitrogen</td><td>17101015</td><td>Dilution by 1 x PBS</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modified eagle medium (DMEM) </td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>12100-061</td><td>High glucose content</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s phosphate buffered saline 1X (DPBS)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190-144</td><td>Calcium chloride free, Magnesium chloride free</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Gel extraction kit</td><td>QIAquick</td><td>28704</td><td>50 reaction kit</td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin stock solution</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td></td><td>5000 &amp;#x03BC;g/ml concentration</td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>Salmon sperm DNA /Protein A agarose</td><td>EMD Millipore</td><td>16-157</td><td></td></tr><tr><td>myogenin antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-576</td><td></td></tr><tr><td>Normal rabbit IgG</td><td>EMD Millipore</td><td>12-370</td><td></td></tr><tr><td>Platinum PCR Supermix</td><td>Invitrogen</td><td>11306-016</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Q-PCR master mix</td><td>Promega Corp.</td><td>A6001</td><td></td></tr></tbody></table>

chromatin immunoprecipitation assay for tissue-specific genes using early-stage mouse embryos

1-3 살아있는 세포의 맥락에서 발생하는 염색질의 상호 작용 : 염색질 immunoprecipitation (칩)은 단백질을 식별하는 강력한 도구입니다. 이 기술은 널리 기본 조직에서 낮은 정도 조직 문화 세포에 악용하고있다. 특히 개발 초기 시간에 쥐 배아 조직에 칩의 응용 프로그램, 조직의 한계와 배아의 세포와 조직 유형의 이질에 의해 복잡합니다. 여기 dissociated 배아 하루 8.5 (E8.5) 배아를 사용하여 칩을 수행하는 방법을 제시한다. 염색질 상호 작용 : 단일 E8.5 배아에서 가지각색 염색질은 컨트롤과 특정 단백질의 조사를 위해 조사 충분한 자료를 수있는 다섯 aliquots에로까지 나눌 수 있습니다. 조직 특정 유전자 발현 프로그램의 사양 중 염색질 상호 작용 : 우리는 단백질을 문서로 시작이 기술을 활용합니다. 모든 상호 작용이 발생 여부를 구별하지 않고 염색질 상호 작용의 일부, 또는 하나의 셀 타입 (S) : 결과가 단백질의 검출이기 때문에 배아에서 세포 유형의 이질 반드시이 기술의 응용 프로그램을 제한합니다. 그러나, 도중에 조직 특정 유전자 검사 또는 조직 특정 유전자 발현의 발병 다음 두 가지 이유 때문에 가능합니다. 첫째, 조직 구체적인 요인 immunoprecipitation 반드시 요소가 표현되는 세포 유형에서 염색질를 분리합니다. 둘째, coactivators 및 유전자 활성화와 관련된 포스트 translational 수정을 포함 histones의 immunoprecipitation은 유전자가되는 세포 유형의 유전자와 유전자의 규제 시퀀스에서 찾을 수 있어야하거나 활성화되었습니다. 이 기술은 대부분의 조직 특정 유전자 활성화 이벤트의 연구에 적용해야합니다. 예제는 아래에서 설명에서 우리는 골격근 특정 유전자 프로 모터에 바인딩 요소를 검토 E8.5과 E9.5 마우스 배아를 활용. 트렁크와 사지의 골격 근육이 형성하는 전구체 조직 아르 Somites는 E8.5 - 9.5 4,5에서 존재하고 있습니다. Myogenin는 골격 근육 차별 6-9에 필요한 규제 요소입니다. 데이터 myogenin가 E8.5과 E9.5의 배아 자체 발기인와 관련된 것을 보여줍니다. myogenin에만 개발 6,10이 단계에서 somites 표현이기 때문에, 데이터 자체 모터와 myogenin 상호 작용은 이미 E8.5 태아의 골격 근육 전구체 세포에서 발생한 것을 나타냅니다.

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Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

우리는 마우스 배아 조직에서 조직 특정 유전자 발현의 시작하는 동안이나 이후에 조직 특정 유전자의 상호 작용 요소를 식별하는 방법은 염색질의 immunoprecipitation (칩)을 보여줍니다. 그것이 정상적인 배아 발달 동안 발생으로이 프로토콜은 조직 특정 유전자 활성화의 연구에 대해 광범위하게 적용되어야합니다.

초기 마우스 배아를 사용하는 조직 특정 유전자에 대한 염색질의 Immunoprecipitation 분석

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

chromatin-immunoprecipitation-assay-for-tissue-specific-genes-using

Research

JoVE Journal

Biology

18.0K 조회수.  University of Massachusetts Medical School. 우리는 마우스 배아 조직에서 조직 특정 유전자 발현의 시작하는 동안이나 이후에 조직 특정 유전자의 상호 작용 요소를 식별하는 방법은 염색질의 immunoprecipitation (칩)을 보여줍니다. 그것이 정상적인 배아 발달 동안 발생으로이 프로토콜은 조직 특정 유전자 활성화의 연구에 대해 광범위하게 적용되어야합니다.

비디오: Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

The recruitment of chromatin regulators and the assignment of chromatin states to specific genomic loci are pivotal to cell fate decisions and tissue and organ formation during development. Determining the locations and levels of such chromatin features in vivo will provide valuable information about the spatio-temporal regulation of genomic elements, and will support aspirations to mimic embryonic tissue development in vitro. The most commonly used method for genome-wide and high-resolution profiling is chromatin immunoprecipitation followed by next-generation sequencing (ChIP-Seq). This protocol outlines how yolk-rich embryos such as those of the frog Xenopus can be processed for ChIP-Seq experiments, and it offers simple command lines for post-sequencing analysis. Because of the high efficiency with which the protocol extracts nuclei from formaldehyde-fixed tissue, the method allows easy upscaling to obtain enough ChIP material for genome-wide profiling. Our protocol has been used successfully to map various DNA-binding proteins such as transcription factors, signaling mediators, components of the transcription machinery, chromatin modifiers and post-translational histone modifications, and for this to be done at various stages of embryogenesis. Lastly, this protocol should be widely applicable to other model and non-model organisms as more and more genome assemblies become available.

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

The question of how chromatin regulators and chromatin states affect the genome in vivo is key to our understanding of how early cell fate decisions are made in the developing embryo. ChIP-Seq&#8212;the most popular approach to investigate chromatin features at a global level&#8212;is outlined here for Xenopus embryos.

염색질 레귤레이터 및 미국에서의 게놈 전체의 스냅 샷<em&gt; 아프리카 발톱 개구리</em칩 서열 번호&gt; 태아

The recruitment of chromatin regulators and the assignment of chromatin states to specific genomic loci are pivotal to cell fate decisions and tissue and ...

연구

발생학

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, transcription factors, or chromatin-modifying enzymes at a given locus or on a genome-wide scale. The combination of ChIP assays with next-generation sequencing (i.e., ChIP-Seq) is a powerful approach to globally uncover gene regulatory networks and to improve the functional annotation of genomes, especially of non-coding regulatory sequences. ChIP protocols normally require large amounts of cellular material, thus precluding the applicability of this method to investigating rare cell types or small tissue biopsies. In order to make the ChIP assay compatible with the amount of biological material that can typically be obtained in vivo during early vertebrate embryogenesis, we describe here a simplified ChIP protocol in which the number of steps required to complete the assay were reduced to minimize sample loss. This ChIP protocol has been successfully used to investigate different histone modifications in various embryonic chicken and adult mouse tissues using low to medium cell numbers (5 x 104 - 5 x 105 cells). Importantly, this protocol is compatible with ChIP-seq technology using standard library preparation methods, thus providing global epigenomic maps in highly relevant embryonic tissues.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Here, we describe a chromatin immunoprecipitation (ChIP) and ChIP-seq library preparation protocol to generate global epigenomic profiles from low-abundance chicken embryonic samples.

낮은 풍부 배아 샘플 chromatin Immunoprecipitation (칩) 프로토콜

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

유전학

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, cell culture has been widely used in developmental biology studies. However, it is important to determine whether in vitro cultured cells truly represent in vivo cell types. Grafting cells into embryos, followed by an assessment of their contribution during development is a useful method to determine the potential of in vitro cultured cells. In this study, we describe a method for grafting cells into a defined site of early postimplantation mouse embryos, followed by ex vivo culture. We also introduce an optimized electroporation method that uses glass capillaries of known diameter, allowing precise localization and adjustment of the number of cells receiving exogenous DNA with both high transfection efficiency and low cell death. These techniques, which do not require any specialized equipment, render experimental manipulations of the gastrulation and early organogenesis-stage mouse embryo possible, allowing analysis of commitment in cultured cell subpopulations and the effect of genetic manipulations in situ on cell differentiation.

We demonstrate a method for grafting cultured cells into defined sites of early mouse embryos to determine their in vivo potential. We also introduce an optimized electroporation method that uses glass capillaries of known diameter, allowing the precise delivery of exogenous DNA into a few cells in the embryos.

초기 Postimplantation 마우스 배아로 세포 나 DNA를 정확하게 현지화 전송하는 방법

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a protocol for performing the chromatin conformation capture technique in situ Hi-C on staged Drosophila melanogaster embryo populations. The result is a sequencing library that allows the mapping of all chromatin interactions that occur in the nucleus in a single experiment. Embryo sorting is done manually using a fluorescent stereo microscope and a transgenic fly line containing a nuclear marker. Using this technique, embryo populations from each nuclear division cycle, and with defined cell cycle status, can be obtained with very high purity. The protocol may also be adapted to sort older embryos beyond gastrulation. Sorted embryos are used as inputs for in situ Hi-C. All experiments, including sequencing library preparation, can be completed in five days. The protocol has low input requirements and works reliably using 20 blastoderm stage embryos as input material. The end result is a sequencing library for next generation sequencing. After sequencing, the data can be processed into genome-wide chromatin interaction maps that can be analyzed using a wide range of available tools to gain information about topologically associating domain (TAD) structure, chromatin loops, and chromatin compartments during Drosophila development.

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

This work describes a protocol for the generation of high resolution in situ Hi-C libraries from tightly staged pre-gastrulation Drosophila melanogaster embryos.

단단히 준비 초기 초파리 배아에서 게놈 넓은 Chromatin 구조 캡처 라이브러리의 생성

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for embryo collection, immunofluorescence, imaging on a confocal microscope, and image segmentation and analysis are described. This method allows quantitation of the expression of multiple nuclear markers and the spatial (XYZ) coordinates of all cells in the embryo. It takes advantage of MINS, an image segmentation software tool specifically developed for the analysis of confocal images of preimplantation embryos and embryonic stem cell (ESC) colonies. MINS carries out unsupervised nuclear segmentation across the X, Y and Z dimensions, and produces information on cell position in three-dimensional space, as well as nuclear fluorescence levels for all channels with minimal user input. While this protocol has been optimized for the analysis of images of preimplantation stage mouse embryos, it can easily be adapted to the analysis of any other samples exhibiting a good signal-to-noise ratio and where high nuclear density poses a hurdle to image segmentation (e.g., expression analysis of embryonic stem cell (ESC) colonies, differentiating cells in culture, embryos of other species or stages, etc.).

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analysis of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for collection of blastocysts, whole-mount immunofluorescent detection of proteins, imaging of samples on a confocal microscope, and nuclear segmentation and image analysis are described.

단백질 발현의 정량 분석​​은 마우스 착상 전의 배아에서 리니지 사양을 공부하기

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.

The goal of this protocol is to describe a loss- and gain-of function method that is applicable to identify neogenin as a stage-specific receptor that leads to trophectoderm and inner cell mass differentiation in preimplantation mouse embryos.

착상 전의 마우스 배아의 초기 세포 운명 결정 요인을 조사 할 Loss- 및 이득 -의 - 기능 접근

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

인간 배아 줄기 세포에서 염색질의 Immunoprecipitation

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

생물학

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. The classical histochemical reaction is based on the hydrolysis of the substrate X-gal in combination with ferric and ferrous ions, which produces an insoluble blue precipitate that is easy to visualize. Therefore, &#946;-galactosidase activity serves as a marker for the expression pattern of the gene of interest as the development proceeds. Here we describe the standard protocol for the detection of &#946;-galactosidase activity in early whole mouse embryos and the subsequent method for paraffin sectioning and counterstaining. Additionally, a procedure for clarifying whole embryos is provided to better visualize X-gal staining in deeper regions of the embryo. Consistent results are obtained by performing this procedure, although optimization of reaction conditions is needed to minimize background activity. Limitations in the assay should be also considered, particularly regarding the size of the embryo in whole mount staining. Our protocol provides a sensitive and a reliable method for &#946;-galactosidase detection during the mouse development that can be further applied to the cryostat sections as well as whole organs. Thus, the dynamic gene expression patterns throughout development can be easily analyzed by using this protocol in whole embryos, but also detailed expression at the cellular level can be assessed after paraffin sectioning.

Here we describe the standard protocol for the detection of &#946;-galactosidase activity in early whole mouse embryos and the method for paraffin sectioning and counterstaining. This is an easy and quick procedure to monitor gene expression during development that can also be applied to tissue sections, organs or cultured cells.

전체 마우스 배아에서 β-galactosidase 활동의 감지를 통해 유전자 발현 추적

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs during early development are technically challenging due to the limiting cell number. Moreover, many approaches require a miRNA of interest to be defined in assays such as northern blotting, microarray, and qPCR. Therefore, the expression of many miRNAs and their isoforms have not been studied during early development. Here, we demonstrate a protocol for small RNA sequencing of sorted cells from early mouse embryos to enable relatively unbiased profiling of miRNAs in early populations of neural crest cells. We overcome the challenges of low cell input and size selection during library preparation using amplification and gel-based purification. We identify embryonic age as a variable accounting for variation between replicates and stage-matched mouse embryos must be used to accurately profile miRNAs in biological replicates. Our results suggest that this method can be broadly applied to profile the expression of miRNAs from other lineages of cells. In summary, this protocol can be used to study how miRNAs regulate developmental programs in different cell lineages of the early mouse embryo.

We describe a technique for profiling microRNAs in early mouse embryos. This protocol overcomes the challenge of low cell input and small RNA enrichment. This assay can be used to analyze changes in miRNA expression over time in different cell lineages of the early mouse embryo.

초기 마우스 배아에서 시퀀싱을 위한 작은 RNA 라이브러리 의 준비

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...

Single-Cell Sequencing을 위한 Gastrulating Mouse embryo의 분리 및 유전형 분석

Single-Cell RNA Sequencing of Mutant Whole Mouse Embryos: From the Epiblast to the End of Gastrulation

Over the last decade, single-cell approaches have become the gold standard for studying gene expression dynamics, cell heterogeneity, and cell states within samples. Before single-cell advances, the feasibility of capturing the dynamic cellular landscape and rapid cell transitions during early development was limited. In this paper, a robust pipeline was designed to perform single-cell and nuclei analysis on mouse embryos from embryonic day E6.5 to E8, corresponding to the onset and completion of gastrulation. Gastrulation is a fundamental process during development that establishes the three germinal layers: mesoderm, ectoderm, and endoderm, which are essential for organogenesis. Extensive literature is available on single-cell omics applied to wild-type perigastrulating embryos. However, single-cell analysis of mutant embryos is still scarce and often limited to FACS-sorted populations. This is partially due to the technical constraints associated with the need for genotyping, timed pregnancies, the count of embryos with desired genotypes per pregnancy, and the number of cells per embryo at these stages. Here, a methodology is presented designed to overcome these limitations. This method establishes breeding and timed pregnancy guidelines to achieve a higher chance of synchronized pregnancies with desired genotypes. Optimization steps in the embryo isolation process coupled with a same-day genotyping protocol (3 h) allow for microdroplet-based single-cell to be performed on the same day, ensuring the high viability of cells and robust results. This method further includes guidelines for optimal nuclei isolations from embryos. Thus, these approaches increase the feasibility of single-cell approaches of mutant embryos at the gastrulation stage. We anticipate that this method will facilitate the analysis of how mutations shape the cellular landscape of the gastrula.

저자 스포트라이트: 단일 세포 분해능에서 계통 특이적 돌연변이 배아를 분석하기 위한 파이프라인

This paper establishes a pipeline for high-quality single-cell and nuclei suspensions of gastrulating mouse embryos for sequencing of single cells and nuclei.

돌연변이 전체 마우스 배아의 단일 세포 RNA 염기서열 분석: epiblast에서 gastrulation 말기까지

Over the last decade, single-cell approaches have become the gold standard for studying gene expression dynamics, cell heterogeneity, and cell states ...

초기 마우스 배아를 사용하는 조직 특정 유전자에 대한 염색질의 Immunoprecipitation 분석

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

염색질 레귤레이터 및 미국에서의 게놈 전체의 스냅 샷

낮은 풍부 배아 샘플 chromatin Immunoprecipitation (칩) 프로토콜

초기 Postimplantation 마우스 배아로 세포 나 DNA를 정확하게 현지화 전송하는 방법

단단히 준비 초기 초파리 배아에서 게놈 넓은 Chromatin 구조 캡처 라이브러리의 생성

단백질 발현의 정량 분석은 마우스 착상 전의 배아에서 리니지 사양을 공부하기

착상 전의 마우스 배아의 초기 세포 운명 결정 요인을 조사 할 Loss- 및 이득 -의 - 기능 접근

인간 배아 줄기 세포에서 염색질의 Immunoprecipitation

전체 마우스 배아에서 β-galactosidase 활동의 감지를 통해 유전자 발현 추적

초기 마우스 배아에서 시퀀싱을 위한 작은 RNA 라이브러리 의 준비

돌연변이 전체 마우스 배아의 단일 세포 RNA 염기서열 분석: epiblast에서 gastrulation 말기까지

초기 마우스 배아를 사용하는 조직 특정 유전자에 대한 염색질의 Immunoprecipitation 분석

요약

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염색질 레귤레이터 및 미국에서의 게놈 전체의 스냅 샷

낮은 풍부 배아 샘플 chromatin Immunoprecipitation (칩) 프로토콜

초기 Postimplantation 마우스 배아로 세포 나 DNA를 정확하게 현지화 전송하는 방법

단단히 준비 초기 초파리 배아에서 게놈 넓은 Chromatin 구조 캡처 라이브러리의 생성

단백질 발현의 정량 분석​​은 마우스 착상 전의 배아에서 리니지 사양을 공부하기

착상 전의 마우스 배아의 초기 세포 운명 결정 요인을 조사 할 Loss- 및 이득 -의 - 기능 접근

인간 배아 줄기 세포에서 염색질의 Immunoprecipitation

전체 마우스 배아에서 β-galactosidase 활동의 감지를 통해 유전자 발현 추적

초기 마우스 배아에서 시퀀싱을 위한 작은 RNA 라이브러리 의 준비

돌연변이 전체 마우스 배아의 단일 세포 RNA 염기서열 분석: epiblast에서 gastrulation 말기까지

단백질 발현의 정량 분석은 마우스 착상 전의 배아에서 리니지 사양을 공부하기