Nous remercions les fonds de démarrage de la Wayne State University (MJA), une subvention de la Fondation américaine pour la recherche sur le vieillissement (SMV), et une voie à l&#39;attribution de transition de carrière Indépendance (R00EB007129) de l&#39;Institut national d&#39;imagerie biomédicale et bio-ingénierie de l&#39;Institut national Santé des (MJA).

1. Métallation utilisant LnCl 3 sels <ol><li> Dissoudre le ligand dans l&#39;eau pour produire une solution de 30 à 265 mM. Le ligand 2 - (4-isothiocyanatobenzyl)-diéthylènetriamine pentaacétique acide (p-SCN-Bn-DTPA) a été utilisé dans cette vidéo à une concentration de 73 mM. </li><li> Ajuster le pH de la solution de ligand à entre 5,5 et 7,0 en ajoutant 1 M NH 4 OH. Dans cette vidéo, 0,2 mL de la 1 M solution de NH 4 OH a été utilisé. </li><li> Dissoudre 1-2 équivalents d&#39;LnCl 3 dans l&#39;eau pour produire une solution avec une concentration de 5000-1000 mM. Dans cette vidéo, eucl 3 et GdCl 3 ont été utilisés dans des concentrations de 111 mM. Un excès de métal est souvent utilisé pour conduire la métallation d&#39;achèvement et, par conséquent simplifier la purification. </li><li> Ajouter la solution de LnCl 3 à la solution de ligand tout en remuant. </li><li> Après l&#39;ajout de LnCl 3, ajuster le pH du mélange réactionnel résultant à entre 5,5 et 7,0 par addition de 0,2 M NH 4 OH. Un total de 0,5 mL de l&#39;0,2 M solution de NH 4 OH a été utilisé dans cette vidéo. Si votre ligand contient de l&#39;acide-groupes fonctionnels sensibles, ajuster le pH de multiples reprises au cours de cette étape. ATTENTION - Si la solution devient trop basique, n&#39;importe quelle base de groupes fonctionnels sensibles, comme l&#39;isothiocyanate, sera rendu inutilisable pour la conjugaison. </li><li> Surveiller la réaction via les mesures de pH. La réaction est terminée lorsque le pH reste constant. </li></ol> 2. Bilan pH Raising (non inclus dans cette vidéo, mais bon pour les ligands sans base-groupes fonctionnels sensibles) <ol><li> Ajouter NH4OH concentré au mélange réactionnel pour ajuster le pH à une valeur ≥ 11. Cette étape va précipiter tout métal décomplexé que l&#39;hydroxyde insoluble. </li><li> Filtrer le surnageant à travers un filtre de 0,2 um. Si le mélange réactionnel obstrue le filtre, la centrifugation et de décantation avant la filtration est recommandée. </li><li> Si la dialyse ne sera pas exécutée, éliminer le solvant sous pression réduite (évaporation rotatif ou lyophilisation est recommandé). </li><li> Étapes 2.1 à 2.3 peut être répétée si lanthanides libre reste. </li></ol> 3. Dialyse bilan <ol><li> Couper le tube à dialyse à une longueur appropriée (suivre les directives du fabricant) pour maintenir le volume de l&#39;échantillon, tout en laissant une longueur supplémentaire (environ 10% du volume de l&#39;échantillon). Dans cette vidéo, un 100-500 daltons de poids moléculaire de coupure (MWCO) membrane a été utilisée, mais plus grand tube MWCO peuvent être utilisées le cas échéant, si la conjugaison est effectuée avant métallation. Aussi, les cassettes de dialyse peut être utilisé comme une alternative au tube à dialyse, si désiré. </li><li> Si approprié basé sur les directives du fabricant, faire tremper le tube à dialyse coupées dans l&#39;eau pendant 15 min à température ambiante. </li><li> Remplir un réservoir de dialyse (un bécher de 1 L a été utilisée dans cette vidéo) avec de l&#39;eau (dialysat). Le volume de dialysat doit être approximativement 100x celle de l&#39;échantillon. </li><li> Pliez une extrémité du tube à deux reprises et sécuriser la partie pliée du tube avec une pince de fermeture de dialyse. Enveloppez la fin de la fermeture avec un élastique afin de s&#39;assurer qu&#39;il reste fermé pendant la dialyse. </li><li> Filtrer le mélange réactionnel à travers un filtre de 0,2 um, et de charger le filtrat dans l&#39;extrémité ouverte du tube en faisant attention à ne pas déchirer le tube. Soyez sûr de laisser un espace suffisant pour la tête près du tuyau. </li><li> Replier l&#39;autre extrémité ouverte du tube à deux reprises, sécurisée avec une fermeture, et envelopper la fermeture avec un élastique comme dans l&#39;étape 3.4. </li><li> Attacher un flacon en verre contenant de l&#39;air à la pince à une extrémité du tube de dialyse en utilisant une bande de caoutchouc. Attacher un flacon contenant du sable à l&#39;autre pince. Ces flacons s&#39;assurer que le tuyau reste immergé dans le dialysat. </li><li> Placez le tuyau dans le réservoir plein de dialyse qui contient dialysat. </li><li> Incorporer le dialysat en utilisant une plaque d&#39;agitation magnétique à une vitesse lente (pas de vortex) à température ambiante. </li><li> Changer le dialysat 3x au cours d&#39;une journée (dans cette vidéo, le dialysat a été changé à 2,5, 6,5 et 11,5 h), et ensuite permettre de poursuivre la dialyse pendant la nuit (pour un total de 20-28 h de dialyse). </li><li> Retirez le tube de dialyse du dialysat et ouvrir avec précaution une fermeture pour retirer l&#39;échantillon. Laver le tube à dialyse 3x avec de l&#39;eau et de combiner les lavages avec de l&#39;échantillon. </li><li> Enlevez l&#39;eau sous pression réduite. La lyophilisation est utilisée dans cette vidéo. </li></ol> 4. Évaluation de la présence de métal libre <ol><li> Dissoudre le complexe de métal dans du tampon acétate (préparation du tampon: dissoudre 1,4 ml d&#39;acide acétique dans 400 ml d&#39;eau, ajuster le pH à 5,8 avec 1 M de NH 4 OH, et ajouter de l&#39;eau pour produire un volume total de 500 ml) et ajouter le xylénol Indicateur d&#39;orange (16 uM dans un tampon pH 5,8). Dans cette vidéo, 0,3 mg de complexe a été dissous dans 0,3 ml de tampon et 3 ml de solution d&#39;indicateur a été ajouté. </li><li>Détecter la présence de métal gratuitement via l&#39;observation d&#39;un changement de couleur de l&#39;indicateur du jaune au violet. </li><li> Si désiré, la quantité de métal libre peut être quantifiée par la création d&#39;une courbe d&#39;étalonnage 1. Alternativement, le colorant arsenazo III peut être utilisé au lieu de xylénol orange 2. Si le métal libre reste, l&#39;échantillon doit encore être purifié par dialyse, une colonne de dessalage, ou la chromatographie liquide haute performance (CLHP) avant de caractérisation. </li></ol> 5. Dosage de l&#39;eau-de coordination nombre (q) <ol><li> Préparer une solution de l&#39;Eu III complexe contenant (~ 1 mM) dans H 2 O et une autre solution de la même concentration dans D 2 O. Avant l&#39;analyse, la D 2 O solution doit être évaporé et dissous dans D 2 O trois fois pour éliminer les résidus H 2 O. </li><li> Ajouter la solution d&#39;eau dans une cuvette propre, et placer la cuvette dans un spectrofluorimètre. </li><li> Effectuer des analyses excitation et d&#39;émission afin de déterminer les maxima pour chaque (~ 395 nm et 595 nm ~, respectivement). </li><li> Effectuer une phosphorescence temps carie expérience en utilisant les paramètres suivants: excitation et d&#39;émission de longueurs d&#39;onde déterminée à partir de l&#39;étape 5.3, d&#39;excitation et d&#39;émission des largeurs de fente (5 nm), le flash de comptage (100), le retard initial (0,01 ms), le délai maximal (13 ms) , incrément de retard et de (0,1 ms). Ces conditions sont appropriées pour la plupart des complexes, mais le délai maximum et les valeurs incrément peut être augmenté ou diminué pour les espèces à temps de décroissance extrêmement longues ou très courtes. </li><li> Répétez l&#39;étape 5.4 avec la solution D 2 O préparé à l&#39;étape 5.1. </li><li> À partir des données de luminescence désintégration obtenu en 5.4 et 5.5, tracer le logarithme naturel de l&#39;intensité en fonction du temps. La pente de ces lignes sont les taux de désintégration (τ -1) (figure 2). Dans cette vidéo, Microsoft Excel 2007 a été utilisé pour générer les parcelles logarithme naturel à partir des données brutes. Utilisez le taux de décomposition dans l&#39;équation développée par Horrocks et ses collaborateurs (éq 1) 3. Si votre ligand contient des groupes OH ou NH coordonnée pour le métal, l&#39;équation doit être modifié avant utilisation 3. </li></ol> EQ 1: <img src="/files/ftp_upload/2844/2844eq1.jpg" alt="L&#39;équation 1" /> 6. Mesures relaxivité <ol><li> Sélectionnez le mode d&#39;application désirée sur l&#39;analyseur temps de relaxation: T 1 (temps de relaxation longitudinal) ou T 2 (temps de relaxation transversale). </li><li> Préparer une série d&#39;échantillons qui contiennent différentes concentrations de Gd III contenant complexe dans un solvant aqueux. Dans cette vidéo, l&#39;eau a été utilisé comme solvant et des solutions de 10,0, 5,00, 2,50, 1,25, 0,625, et 0 mm ont été préparées. Autres solvants aqueux ou des tampons peuvent être utilisés, mais il est important d&#39;utiliser le solvant comme le vide. Le dernier volume de l&#39;échantillon est spécifique à l&#39;instrument qui est utilisé. </li><li> Placer un échantillon dans l&#39;instrument et laisser reposer pendant 5 min pour s&#39;équilibrer à la température de l&#39;instrument (37 ° C dans cette vidéo). </li><li> Déterminer le temps de relaxation (en unités de s) en ajustant les paramètres du logiciel pour obtenir une courbe lisse exponentielle pour T 1 ou T 2 (courbes représentatives de T 1 et T 2 sont présentés dans la figure 3). </li><li> Répétez les étapes 6.3 et 6.4 pour tous les échantillons, y compris le blanc. </li><li> Calculer l&#39;inverse de la mesure T 1 ou T 2 valeurs en unités de s -1. </li><li> Terrain T 1 ou T 2 -1 -1 valeurs par rapport Gd III de concentration (en unités de mm). En raison de la nature hygroscopique du Gd III complexes contenant, confirme la concentration de Gd III en utilisant la spectrophotométrie d&#39;absorption atomique ou spectrométrie de masse à couplage inductif plasma. Monter la parcelle avec une ligne droite. Un tracé représentatif est montré dans la figure 4. </li><li> La pente de la droite d&#39;ajustement est la relaxivité (R 1 ou R 2 pour T 1 et T 2, respectivement) et possède des unités de mm -1 s -1. </li></ol> 7. Les résultats représentatifs Des données représentatives pour les étapes de ce protocole ont été inclus dans les tableaux et figures section. En plus du numéro de l&#39;eau-de coordination et de la caractérisation relaxivité décrites dans le protocole, il est important de caractériser les produits finis en utilisant des techniques chimiques standard. L&#39;identité du composé peut être obtenu en utilisant la spectrométrie de masse, et des spectres de masse représentatives montrant les tendances des isotopes de diagnostic pour D.ieu III - et Eu III complexes contenant sont montrés dans la Figure 5. Par ailleurs, pour les non-Gd III </sjusqu&#39;à&gt; lanthanides complexes contenant, la spectroscopie RMN peut être utilisée pour l&#39;identification du produit. Pour caractériser la pureté du complexe, HPLC ou analyse élémentaire ou les deux peuvent être utilisés. <img src="/files/ftp_upload/2844/2844fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1 Schéma général d&#39;métallation et de purification:. Schéma illustrant la procédure générale de métallation et de raisons de choisir les routes de purification différent. <img src="/files/ftp_upload/2844/2844fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2 Luminescence intensité intrigue:. Tracé représentatif de le logarithme naturel de l&#39;intensité en fonction du temps de la section 5. Les pentes des lignes générées à partir des courbes similaires acquis pour les solutions d&#39;eau et D 2 O sont utilisés avec une égalisation à caractériser le nombre d&#39;eau-de coordination de l&#39;Eu III complexes contenant. <img src="/files/ftp_upload/2844/2844fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3 courbes de relaxation décroissance temporelle:. Données représentatives pour (à gauche) T 1 et (à droite) T 2 d&#39;acquisition. Les écarts par rapport à ces formes de courbe serait de produire des données fiables. <img src="/files/ftp_upload/2844/2844fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4 Détermination relaxivité:. Un tracé représentatif de 1 / T 1 versus la concentration de Gd III. La pente de la droite d&#39;ajustement est relaxivité et possède des unités de mm -1 s -1. <img src="/files/ftp_upload/2844/2844fig5.jpg" alt="Figure 5" /> Figure 5 Les spectres de masse:. Spectres de masse représentant montrant les tendances des isotopes de diagnostic pour (à gauche) Gd III contenant les complexes et (à droite) Eu III complexes contenant. Les pics noirs représentent la répartition gaussienne isotopes théoriques et les lignes rouges sont les données réelles.

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Acta. 340, 44-48 (2002).</li><li>Menjoge, A. R., Kannan, R. M., Tomalia, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendrimer-based+drug+and+imaging+conjugates:+design+considerations+for+nanomedical+applications.">Dendrimer-based drug and imaging conjugates: design considerations for nanomedical applications.</a> Drug Discovery Today. 15, 171-185 (2010).</li><li>Que, E. L., Chang, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responsive+magnetic+resonance+imaging+contrast+agents+as+chemical+sensors+for+metals+in+biology+and+medicine.">Responsive magnetic resonance imaging contrast agents as chemical sensors for metals in biology and medicine.</a> Chem. Soc. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paramagnetic+metal+complexes+as+water+proton+relaxation+agents+for+NMR+imaging:+theory+and+design.">Paramagnetic metal complexes as water proton relaxation agents for NMR imaging: theory and design.</a> Chem. Rev. 87, 901-927 (1987).</li><li>Yoo, B., Pagel, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+responsive+MRI+contrast+agents+for+molecular+imaging.">An overview of responsive MRI contrast agents for molecular imaging.</a> Front. Biosci. 13, 1733-1752 (2008).</li><li>Pandya, S., Yu, J., Parker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+emissive+europium+and+terbium+complexes+for+molecular+imaging+and+sensing.">Engineering emissive europium and terbium complexes for molecular imaging and sensing.</a> Dalton Trans. 23, 2757-2766 (2006).</li><li>Nwe, K., Xu, H., Regino, C. A. S., Bernardo, M., Ileva, L., Riffle, L., Wong, K. J., Brechbiel, M. 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K., Kolodziej, A., Looby, R. J., Sun, W. -. C., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lysine+walk+to+high+relaxivity+collagen-targeted+MRI+contrast+agents.">A lysine walk to high relaxivity collagen-targeted MRI contrast agents.</a> Chem. Commun. , 430-432 (2009).</li><li>Le&#243;n-Rodr&#237;guez, L. M. D., Kovacs, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+synthesis+and+chelation+chemistry+of+DOTA-peptide+conjugates.">The synthesis and chelation chemistry of DOTA-peptide conjugates.</a> Bioconjugate Chem. 19, 391-402 (2008).</li><li>Boswell, C. A., Eck, P. K., Regino, C. A. S., Bernardo, M., Wong, K. J., Milenic, D. E., Choyke, P. L., Brechbiel, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis,+characterization,+and+biological+evaluation+of+integrin+&#945;V&#946;3-targeted+PAMAM+dendrimers.">Synthesis, characterization, and biological evaluation of integrin &#945;V&#946;3-targeted PAMAM dendrimers.</a> Mol. Pharm. 5, 527-539 (2008).</li></ol>

Vu le nombre croissant de publications qui comprennent des agents de contraste à base de lanthanides 4-14, il est important que l&#39;on prend soin dans la préparation, la purification et la caractérisation des produits pour assurer des résultats reproductibles et comparables. Ces complexes sont souvent considérés comme difficiles à purifier et de caractériser par rapport à des molécules organiques en raison de leur nature paramagnétique et la sensibilité d&#39;un groupe fonctionnel qui peut être...

<table border="1"><tbody><tr><th> Réactifs et appareillage </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th></tr><tr><td> Eucl 3 • 6H 2 O </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 203 254-5G </td></tr><tr><td> p-SCN-Bn-DTPA </td><td> Macrocyclics </td><td> B-305 </td></tr><tr><td> hydroxyde d&#39;ammonium </td><td> EMD </td><td> AX1303-3 </td></tr><tr><td> Membrane de dialyse Spectra / Por Biotech ester de cellulose (CE) - 500 D MWCO </td><td> Fisher Scientific </td><td> 68-671-24 </td></tr><tr><td> Millipore IC Millex-LG unités de filtration </td><td> Fisher Scientific </td><td> SLLG C13 NL </td></tr><tr><td> xylénol orange, sel tétrasodique </td><td> Alfa Aesar </td><td> 41379 </td></tr><tr><td> l&#39;acide acétique </td><td> Fluka </td><td> 49199 </td></tr><tr><td> D 2 O </td><td> Cambridge Isotope Laboratories, Inc </td><td> DLM-4-25 </td></tr><tr><td> purificateur d&#39;eau </td><td> ELGA </td><td> PURELAB Ultra </td></tr><tr><td> chromatographie liquide haute performance et spectrométrie de masse </td><td> Shimadzu </td><td> LCMS-2010EV </td></tr><tr><td> analyseur temps de relaxation </td><td> Bruker </td><td> mq60 Minispec </td></tr><tr><td> Spectrophotomètre UV-VIS </td><td> Fisher Scientific </td><td> 20-624-00092 </td></tr><tr><td> lyophilisateur </td><td> Fisher Scientific </td><td> 10-030-133 </td></tr><tr><td> pH-mètre </td><td> Hanna Instruments </td><td> HI 221 </td></tr><tr><td> spectrofluorimètre </td><td> HORIBA Jobin Yvon </td><td> Fluoromax-4 </td></tr><tr><td> Calculateur de poids moléculaire la version 6.46 par Matthew Monroe, téléchargé 17 Octobre, 2009 </td><td> <a href="http://ncrr.pnl.gov/software/">http://ncrr.pnl.gov/software/</a> </td><td> Calculatrice Poids Moléculaire </td></tr></tbody></table>

preparation, purification, and characterization of lanthanide complexes for use as contrast agents for magnetic resonance imaging

Polyaminopolycarboxylate basée sur les ligands sont couramment utilisés pour chélater les ions lanthanides, et les complexes qui en résultent sont utiles comme agents de contraste pour imagerie par résonance magnétique (IRM). Beaucoup de ligands disponibles dans le commerce sont particulièrement utiles car ils contiennent des groupes fonctionnels qui permettent de rapides et de haute pureté et à haut rendement conjugaison à des macromolécules et des biomolécules par des amines réactives esters activés et des groupes isothiocyanate ou thiol-réactive maléimides. Bien métallation de ces ligands est considérée comme connaissance commune dans le domaine de la chimie bioconjugaison, de subtiles différences dans les procédures de métallation doivent être prises en compte lors du choix des matériaux métalliques de départ. Par ailleurs, de multiples options pour la purification et la caractérisation existent, et la sélection de la procédure la plus efficace dépend en partie de la sélection des matières premières. Ces subtiles différences sont souvent négligés dans les protocoles publiés. Ici, notre but est de démontrer des méthodes communes de métallation, la purification et la caractérisation des complexes de lanthanides qui peuvent être utilisés comme agents de contraste pour l&#39;IRM (figure 1). Nous espérons que cette publication permettra aux chercheurs en sciences biomédicales à intégrer les réactions de complexation de lanthanides dans leur répertoire de réactions couramment utilisé par l&#39;assouplissement de la sélection des matières premières et des méthodes de purification.

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Preparation, Purification, and Characterization of Lanthanide Complexes for Use as Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging

Nous démontrons la métallation, la purification et la caractérisation des complexes de lanthanides. Les complexes décrites ici peuvent être conjugués à des macromolécules pour permettre le suivi de ces molécules en utilisant l&#39;imagerie par résonance magnétique.

Préparation, la purification et la caractérisation des complexes de lanthanides pour utilisation comme agents de contraste pour imagerie par résonance magnétique

Polyaminopolycarboxylate-based ligands are commonly used to chelate lanthanide ions, and the resulting complexes are 
useful as contrast agents for ...

preparation-purification-characterization-lanthanide-complexes-for

Research

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Biology

14.9K vues.  Wayne State University. Nous démontrons la métallation, la purification et la caractérisation des complexes de lanthanides. Les complexes décrites ici peuvent être conjugués à des macromolécules pour permettre le suivi de ces molécules en utilisant l'imagerie par résonance magnétique.

Vidéo: Preparation, Purification, and Characterization of Lanthanide Complexes for Use as Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging

Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative medicine. A non-invasive method to monitor the transplanted stem cells repeatedly in vivo would greatly enhance our ability to understand the mechanisms that control stem cell death and identify trophic factors and signaling pathways that improve stem cell engraftment. MR imaging has been proven to be an effective tool for the in vivo depiction of stem cells with near microscopic anatomical resolution. In order to detect stem cells with MR, the cells have to be labeled with cell specific MR contrast agents. For this purpose, iron oxide nanoparticles, such as superparamagnetic iron oxide particles (SPIO), are applied, because of their high sensitivity for cell detection and their excellent biocompatibility. SPIO particles are composed of an iron oxide core and a dextran, carboxydextran or starch coat, and function by creating local field inhomogeneities, that cause a decreased signal on T2-weighted MR images. This presentation will demonstrate techniques for labeling of stem cells with clinically applicable MR contrast agents for subsequent non-invasive in vivo tracking of the labeled cells with MR imaging.

For the evaluation of new stem cell therapies it is important to non-invasively track the injected cells in vivo. This video will show you how to label human mesenchymal and embryonic stem cells with iron oxide based contrast agents in vivo for subsequent MR imaging in vivo.

Étiquetage CSEh et hMSCs d&#39;oxyde de fer nanoparticules pour les non-invasives dans le suivi in ​​vivo avec IRM

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative ...

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Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

Étiquetage des cellules souches avec des colorants fluorescents pour les non-invasive de détection avec l&#39;imagerie optique

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

In vitro Labeling of Human Embryonic Stem Cells for Magnetic Resonance Imaging

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of the predominant imaging modalities to assess the restoration of the injured myocardium. Furthermore, ex-vivo labeling agents, such as iron-oxide nanoparticles, have been employed to track and localize the transplanted stem cells. However, this method does not monitor a fundamental cellular biology property regarding the viability of transplanted cells. It has been known that manganese chloride (MnCl2) enters the cells via voltage-gated calcium (Ca2+) channels when the cells are biologically active, and accumulates intracellularly to generate T1 shortening effect. Therefore, we suggest that manganese-guided MRI can be useful to monitor cell viability after the transplantation of hESC into the myocardium.
In this video, we will show how to label hESC with MnCl2 and how those cells can be clearly seen by using MRI in vitro. At the same time, biological activity of Ca2+-channels will be modulated utilizing both Ca2+-channel agonist and antagonist to evaluate concomitant signal changes.

In this video, we are showing how to label human embryonic stem cells (hESC) with manganese chloride (MnCl2) which can enter cells via voltage-gated calcium channels when the cells are biologically active. Additionally, we show the use of MnCl2 as cellular MRI contrast agent to determine the in vitro viability of hESC.

Marquage in vitro des cellules souches embryonnaires humaines pour l&#39;imagerie par résonance magnétique

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of ...

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by Zernike, in 1942, who received the Nobel prize for his achievement. DIC microscopy, introduced in the late 1960s, has been popular in biomedical research because it highlights edges of specimen structural detail, provides high-resolution optical sections of thick specimens including tissue cells, eggs, and embryos and does not suffer from the  phase halos  typical of phase-contrast images. This protocol highlights the principles and practical applications of these microscopy techniques.

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

This protocol highlights the principles and practical applications of Phase and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Contraste de phase et les interférences de contraste différentiel (DIC) Microscopie

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite morphogenesis at the functional and molecular levels. To aid in these analyses, we have developed a strategy for the isolation of a subclass of PNS neurons called dendritic arborization (da) neurons that have been widely used for studying dendrite morphogenesis1,2. These neurons are very difficult to isolate as a pure population, due in part to their extremely low occurrence and their difficult-to-reach location below the tough chitinous larval cuticle. Our newly developed method overcomes these challenges, and is based on a fast and specific cell enrichment using antibody-coated magnetic beads. For our magnetic bead sorting studies, we have used age-matched third instar larvae expressing a mouse CD8 tagged GFP fusion protein (UAS-mCD8-GFP)3 under the control of either the class IV dendritic arborization (da) neuron-specific pickpocket (ppk)-GAL4 driver4 or the control of the pan-da neuron-specific GAL421-7 driver5. Although this protocol has been optimized for isolating PNS cells which are attached to the inner wall of the larval cuticle, by varying a few parameters, the same protocol could be used to isolate many different cell types attached to the cuticle at larval or pupal stages of development (e.g. epithelia, muscle, oenocytes etc.), or other cell types from larval organs depending upon the GAL4-specific driver expression pattern. The RNA isolated by this method is of high quality and can be readily used for downstream genomic analyses such as microarray gene expression profiling studies. This approach offers a powerful new tool to perform studies on isolated Drosophila dendritic arborization (da) neurons thereby providing novel insights into the molecular mechanisms underlying dendrite morphogenesis.

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

In this video-article we present a method for the isolation and purification of Drosophila peripheral neurons using a fast magnetic bead assisted cell sorting strategy. RNA obtained from the isolated cells can be readily used for downstream applications including microarray analyses.

Isolement et purification de Drosophile Neurones périphériques en triant bille magnétique

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1, as in zebrafish and the mouse. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions.
To take advantage of medaka fish whose embryos are transparent and develop externally, microinjection is an essential technique to inject cell-tracers for labeling cells, mRNAs or anti-sense oligonucleotides for over-expressing and knocking-down genes of interest, and DNAs for making transgenic lines.

Medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions. This protocol highlights the key points for successful microinjection into medaka embryos, an important technique for embryological and genetic analysis using medaka and zebrafish in a laboratory.

Microinjection d&#39;embryons Medaka pour être utilisé comme un organisme modèle génétique

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Quantifying Mixing using Magnetic Resonance Imaging

Mixing is a unit operation that combines two or more components into a homogeneous mixture. This work involves mixing two viscous liquid streams using an in-line static mixer. The mixer is a split-and-recombine design that employs shear and extensional flow to increase the interfacial contact between the components. A prototype split-and-recombine (SAR) mixer was constructed by aligning a series of thin laser-cut Poly (methyl methacrylate) (PMMA) plates held in place in a PVC pipe. Mixing in this device is illustrated in the photograph in Fig. 1. Red dye was added to a portion of the test fluid and used as the minor component being mixed into the major (undyed) component. At the inlet of the mixer, the injected layer of tracer fluid is split into two layers as it flows through the mixing section. On each subsequent mixing section, the number of horizontal layers is duplicated. Ultimately, the single stream of dye is uniformly dispersed throughout the cross section of the device.
 Using a non-Newtonian test fluid of 0.2% Carbopol and a doped tracer fluid of similar composition, mixing in the unit is visualized using magnetic resonance imaging (MRI). MRI is a very powerful experimental probe of molecular chemical and physical environment as well as sample structure on the length scales from microns to centimeters. This sensitivity has resulted in broad application of these techniques to characterize physical, chemical and/or biological properties of materials ranging from humans to foods to porous media 1, 2. The equipment and conditions used here are suitable for imaging liquids containing substantial amounts of NMR mobile 1H such as ordinary water and organic liquids including oils. Traditionally MRI has utilized super conducting magnets which are not suitable for industrial environments and not portable within a laboratory (Fig. 2). Recent advances in magnet technology have permitted the construction of large volume industrially compatible magnets suitable for imaging process flows. Here, MRI provides spatially resolved component concentrations at different axial locations during the mixing process. This work documents real-time mixing of highly viscous fluids via distributive mixing with an application to personal care products.

Magnetic resonance imaging (MRI) provides a powerful tool to evaluate the effectiveness of process equipment during operation. We discuss the use of MRI to visualize mixing in a static mixer. The application is relevant to personal care products, but can be applied to a broad range of food, chemical, biomass and biological fluids.

Quantifier mélange à l&#39;aide d&#39;imagerie par résonance magnétique

Mixing is a unit operation that combines two or more components into a homogeneous mixture.  This work involves mixing two viscous liquid streams using an ...

Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes

INO80 chromatin remodeling complexes regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Human INO80 complexes consist of 14 protein subunits including Ino80, a SNF2-like ATPase, which serves both as the catalytic subunit and the scaffold for assembly of the complexes. Functions of the other subunits and the mechanisms by which they contribute to the INO80 complex&#39;s chromatin remodeling activity remain poorly understood, in part due to the challenge of generating INO80 subassemblies in human cells or heterologous expression systems. This JOVE protocol describes a procedure that allows purification of human INO80 chromatin remodeling subcomplexes that are lacking a subunit or a subset of subunits. N-terminally FLAG epitope tagged Ino80 cDNA are stably introduced into human embryonic kidney (HEK) 293 cell lines using Flp-mediated recombination. In the event that a subset of subunits of the INO80 complex is to be deleted, one expresses instead mutant Ino80 proteins that lack the platform needed for assembly of those subunits. In the event an individual subunit is to be depleted, one transfects siRNAs targeting this subunit into an HEK 293 cell line stably expressing FLAG tagged Ino80 ATPase. Nuclear extracts are prepared, and FLAG immunoprecipitation is performed to enrich protein fractions containing Ino80 derivatives. The compositions of purified INO80 subcomplexes can then be analyzed using methods such as immunoblotting, silver staining, and mass spectrometry. The INO80 and INO80 subcomplexes generated according to this protocol can be further analyzed using various biochemical assays, which are described in the accompanying JOVE protocol. The methods described here can be adapted for studies of the structural and functional properties of any mammalian multi-subunit chromatin remodeling and modifying complexes.

This protocol describes a procedure for generating and purifying wild type and mutant versions of the human INO80 chromatin remodeling complex. Epitope tagged versions of INO80 subunits are stably expressed in HEK293 cells, and complete complexes and complexes lacking specific sets of subunits are purified by immunoaffinity chromatography.

Production et purification des droits de INO80 remodelage de la chromatine Complexes et Subcomplexes

INO80 chromatin remodeling complexes regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Human INO80 ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly employ two-dimensional (2D) culture, which does not mimic the three-dimensional (3D) cellular microenvironment. A method to perform quenched emission FRET imaging using conventional widefield epifluorescence microscopy of cells within a 3D hydrogel environment is presented. Here an analysis method for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the probe activation range is described. Measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) levels is demonstrated in chondrocytes under forskolin stimulation using a probe for EPAC1 activation (ICUE1) and the ability to detect differences in cAMP signaling dependent on hydrogel material type, herein a photocrosslinking hydrogel (PC-gel, polyethylene glycol dimethacrylate) and a thermoresponsive hydrogel (TR-gel). Compared with 2D FRET methods, this method requires little additional work. Laboratories already utilizing FRET imaging in 2D can easily adopt this method to perform cellular studies in a 3D microenvironment. It can further be applied to high throughput drug screening in engineered 3D microtissues. Additionally, it is compatible with other forms of FRET imaging, such as anisotropy measurement and fluorescence lifetime imaging (FLIM), and with advanced microscopy platforms using confocal, pulsed, or modulated illumination.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging is a powerful tool for real-time cell biology studies. Here a method for FRET imaging cells in physiologic three-dimensional (3D) hydrogel microenvironments using conventional epifluorescence microscopy is presented. An analysis for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the activation range is described.

FRET Imaging en hydrogels en trois dimensions

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Synthesis of 68Ga Core-doped Iron Oxide Nanoparticles for Dual Positron Emission Tomography /(T1)Magnetic Resonance Imaging

Here, we describe a microwave synthesis to obtain iron oxide nanoparticles core-doped with 68Ga. Microwave technology enables fast and reproducible synthetic procedures. In this case, starting from FeCl3 and citrate trisodium salt, iron oxide nanoparticles coated with citric acid are obtained in 10 min in the microwave. These nanoparticles present a small core size of 4.2 &#177; 1.1 nm and a hydrodynamic size of 7.5 &#177; 2.1 nm. Moreover, they have a high longitudinal relaxivity (r1) value of 11.9 mM-1&#183;s-1 and a modest transversal relaxivity value (r2) of 22.9 mM-1&#183;s-1, which results in a low r2/r1 ratio of 1.9. These values enable positive contrast generation in magnetic resonance imaging (MRI) instead of negative contrast, commonly used with iron oxide nanoparticles. In addition, if a 68GaCl3 elution from a 68Ge/68Ga generator is added to the starting materials, a nano-radiotracer doped with 68Ga is obtained. The product is obtained with a high radiolabeling yield (&#62; 90%), regardless of the initial activity used. Furthermore, a single purification step renders the nano-radiomaterial ready to be used in vivo.

Synthesis of 68Ga Core-doped Iron Oxide Nanoparticles for Dual Positron Emission Tomography /T1Magnetic Resonance Imaging

Here, we present a protocol to obtain 68Ga core-doped iron oxide nanoparticles via fast microwave-driven synthesis. The methodology renders PET/(T1)MRI nanoparticles with radiolabeling efficiencies higher than 90% and radiochemical purity of 99% in a 20-min synthesis.

Synthèse de 68Ga dopée à base d’oxyde de fer nanoparticules pour tomographie par émission de double/imagerie de résonance magnétique (T1)

Here, we describe a microwave synthesis to obtain iron oxide nanoparticles core-doped with 68Ga. Microwave technology enables fast and reproducible ...