Nous remercions les Drs. Yuh-Nung Jan et Wes Grueber pour fournir des stocks volantes utilisées dans cette étude. Les auteurs remercient F. Thomas et Kate Miller Jeffress Memorial Trust pour le soutien de cette recherche (DNC) et le Bureau du l&#39;Université George Mason Provost (EPRI).

Commentaires généraux sur le tri des billes magnétiques neurones périphériques drosophile (Timing Total pour l&#39;achèvement du Protocole: 2.5-3 heures) Procédures de laboratoire standard pour maintenir un environnement propre, RNAse environnement libre doivent être respectées en tout temps pour prévenir la dégradation de l&#39;ARN. Lorsque la cuticule des larves de drosophile est disséqué et placé dans le buffer dissociation cellulaire, les neurones périphériques sont l&#39;une des dernières cellules de se détacher de la cuticule. Nous avons exploité cette propriété et conçu ce protocole pour éliminer la plupart des cellules non spécifiques de la cuticule comme le muscle et la graisse avant l&#39;isolation des neurones DA. Avec la pratique, le protocole de l&#39;ensemble peut être complété avec succès au sein d&#39;environ 2,5 heures. La préparation des billes revêtues d&#39;anticorps doit être rempli avant l&#39;expérience commence. 1. Préparation des billes magnétiques pour les piles à reliure: Cette étape doit être terminée avant le début de l&#39;expérience. Les billes préparées peuvent être préparés et conservés à 4 ° C jusqu&#39;à ce que nécessaire. <ol><li> Lavez 100 ul de billes streptavidine Dynabeads M-280 recouvert de trois fois en PBS en le remettant en suspension dans 500 ul de PBS frais et de granulation dans un champ magnétique fort à chaque fois. </li><li> Enfin remettre en suspension les perles directement dans 100 ul d&#39;anticorps biotinylé dilué rat anti-souris-CD8a (concentration d&#39;anticorps est de 100 pg / ml). </li><li> Incuber le mélange pendant 1 heure sur la glace avec des vortex légers occasionnels à empêcher la sédimentation. [1 pl de Dynabeads M-280 peuvent se lier de 0.05 à 0,10 pg d&#39;anticorps biotinylé]. </li><li> Laver le mélange billes-anticorps à trois reprises comme décrit dans l&#39;étape 1.1 de supprimer les excès d&#39;anticorps. Les billes magnétiques sont maintenant recouverts d&#39;anticorps et prêt à être utilisé. Stocker le mélange de perles d&#39;anticorps dans 100 ul de PBS 1X à 4 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li></ol> 2. Sélection et laver Larves: (10-15 minutes) <ol><li> Choisissez appariés pour l&#39;âge de 30 à 50 larves troisième stade et les placer dans un tube de 1,6 ml avec 1 à 1,2 microcentrifugeuse ml de phosphate 1X saline tamponnée (PBS). (3-5 minutes) </li><li> Fermer le tube et le vortex au réglage maximum trois fois pendant 1 seconde chacun. </li><li> Utiliser un feu poli pipette Pasteur jeter le surnageant complètement. Répéter le lavage (2,1) et le vortex (2,2) étapes 3-4 fois jusqu&#39;à ce que le surnageant est visiblement claire de toutes les particules de nourriture et de débris. </li><li> Brièvement répéter le lavage avec 1 ml d&#39;éthanol à 70% et jeter le surnageant. </li><li> Laver les larves à deux reprises avec 1 ml de ddH2O et jeter le surnageant. </li><li> Brièvement répéter les laver une fois avec 1 ml de RNase-AWAY et jeter le surnageant. </li><li> Laver les larves à trois reprises dans 1 ml de ddH2O pour assurer l&#39;élimination complète de RNase AWAY. </li></ol> 3. Dissection: (10-12 minutes) <ol><li> Placez 10-12 larves sur le centre d&#39;une plaque recouverte Sylgard 35mm de Pétri. Placez-les légèrement à l&#39;écart les uns des autres. [Etape critique: Jeter les larves qui ne semblent pas être au stade approprié de développement] </li><li> Coupez l&#39;extrémité antérieure de la larve à l&#39;aide d&#39;une paire de ciseaux de dissection fine pour toutes les larves. </li><li> En utilisant une paire de ternes Dumont n ° 5 pinces à inverser la larve à l&#39;envers. Insérez une pince à l&#39;intérieur de la cuticule des larves tout le chemin à l&#39;extrémité postérieure. Pincez le bout de la pince ensemble pour attraper l&#39;extrémité postérieure de la cuticule (figure 1a) (essayez d&#39;appuyer sur la cuticule sur la surface Sylgard pour le rendre plus facile). Utilisation de la deuxième paire de pinces, poussez la cuticule des larves intérieur. [Etape critique: Essayez de pratiquer cette méthode à quelques reprises avant de tenter l&#39;expérience d&#39;isolement cellulaire. Essayez d&#39;obtenir les larves complètement renversé, pour s&#39;assurer que tous les tissus mous sont exposées à la solution pour faciliter la dissociation.] </li><li> Après dissection des larves 3-4, les transférer immédiatement à frais, PBS glacé (placer le tube sur la glace) dans un tube à centrifuger 1,6 ml. </li><li> Répétez les étapes 3.1 à 3.4 jusqu&#39;à ce que toutes les larves exigées sont recueillies (30-40 larves de ce protocole). [Etape critique:. Anticiper 10-20% de perte lors de la dissection et la dissociation, et planifier en conséquence] </li></ol> 4. Retrait de faiblement adhérentes non spécifiques des cellules: (2-3 minutes) [Cette étape aides de compensation des faiblement adhérentes non spécifiques des tissus tels que les corps gras et du SNC.] <ol><li> Prenez le tube de microcentrifugation 1,6 ml contenant les cuticules larvaires inversé et remplacer le surnageant avec environ 700 à 800 l de frais PBS glacé. </li><li> Pulse-vortex du tube de centrifugeuse 5 fois (3 secondes par impulsion) à pleine vitesse. </li><li> Jeter le surnageant et le remplacer par quelque 700 à 800 ul frais, PBS glacé. </li><li> Répétez les étapes 4.2 et 4.3 à trois reprises. </li><li> Resuspend les cuticules des larves dans 400 ul de frais, PBS glacé </li></ol> 5. Dissociation du tissu dans une suspension cellulaire unique: (18-20 minutes) [Etape critique: Plus-dissociation peut entraîner la perte du marqueur de surface cellulaire menant à rendement cellulaire pauvres et la viabilité cellulaire faible. Le tissu larvaire peut être dissociée ni par dissociation mécanique (sonication, douncing), dissociation enzymatique (trypsine, la collagénase etc) ou une combinaison des deux. Comme ces tissus larvaires sont difficiles à dissocier, nous avons constaté que la combinaison des deux mécaniques et dissociation enzymatique donné les meilleurs résultats.] <ol><li> Ajouter 1,5 l de Libérase 1X Blendzyme 3 (28 W unités nsch / flacon) à la cuticule des larves en suspension dans 400 ul de PBS. </li><li> Vortex la solution 2-3 fois pendant 1 seconde au réglage maximum (Cela devrait éliminer les cellules faiblement adhérentes de la cuticule dans la solution). </li><li> Incuber la solution à température ambiante (22-25 ° C) pendant 5 minutes. [Etape critique: temps d&#39;incubation affecte grandement l&#39;efficacité de cellules finales de tri. Le temps d&#39;incubation recommandée devrait être suffisante pour desserrer le tissu. Ne pas dépasser 15 minutes.] </li><li> Pulse-vortex le tube 20-30 fois au maximum de paramètres pour 2 secondes par impulsion à pleine vitesse. Cela devrait libère les muscles et autres tissus dans la solution. Inspectez un petit échantillon de la solution sous une lampe fluorescente stéréomicroscope à chaque étape. (Avec l&#39;expérience on devrait être capable de déterminer le niveau de dissociation en observant le tube de micro directement sous une fluorescence activée stéréomicroscope) </li><li> Lavez les cuticules larvaires 2-3 fois avec frais, PBS glacé et enfin de les remettre en suspension dans 500 ul de frais, PBS glacé contenant 1% de BSA. </li><li> Pour éviter la cuticule des larves coller à la surface de verre de la broyeur de tissus Kontes 2 ml et un pilon grand dégagement, pré-enduire le broyeur de tissus et d&#39;un pilon avec un BSA à 1% dans une solution PBS et après un bref rinçage jeter la solution de BSA. Par la suite, à l&#39;aide d&#39;une pipette Pasteur polie au feu, transférer les cuticules à l&#39;étape 5.5 de la BSA broyeur de tissus enduits. [Etape critique: Pré-refroidir le broyeur de tissus / pilon en le plaçant sur ​​la glace pendant quelques minutes afin de prévenir les dommages cellulaires / lyse]. </li><li> Dounce le tissu avec des coups lente et régulière, en évitant moussage (environ 20-30 coups). [Etape critique:. Dounce lentement et régulièrement, sinon les cellules peuvent lyser] </li><li> Pour évaluer les niveaux de dissociation cellulaire, essuyez la paroi extérieure du broyeur de tissus avec un tissu Kimwipe propre, et l&#39;inspecter sous une lampe fluorescente stéréomicroscope. Les neurones doivent avoir détaché de la cuticule, et peut être vu dans la solution. Si cela s&#39;avère difficile, sinon la pipette sur un petit échantillon de la solution, et l&#39;observer sous une lampe fluorescente stéréomicroscope. Une bonne indication de la dissociation cellulaire est l&#39;absence de neurones à partir de la cuticule larvaire. Toutefois, si l&#39;on observe encore des neurones attaché à la cuticule, ou observe des cellules incomplètement dissocié, Dounce encore jusqu&#39;à ce que la cellules obtenir une suspension cellulaire unique. </li><li> Triturer la solution 5 fois avec une pipette Pasteur polie au feu réduit à environ 50% du diamètre de la pointe standard, suivie par 10 fois avec une pipette Pasteur polie au feu réduit à environ 25% du diamètre de la pointe standard. [Etape critique: la trituration énergique peut endommager les cellules. Surveiller les cellules entre les étapes, et d&#39;ajuster la procédure en conséquence]. </li><li> Filtrer la solution à travers un filtre 30 um cellulaire et recueillir le filtrat de cellules dans un tube à centrifuger 1,6 ml. La solution obtenue doit consister en une suspension cellulaire unique et est maintenant prêt pour le tri magnétique de cellules. </li></ol> 6. Magnétique tri cellulaire perle: (45 - 75 minutes, dépendant de la durée d&#39;incubation d&#39;anticorps) <ol><li> Ajouter 15 ul de billes magnétiques recouvertes d&#39;anticorps à 500 pl de suspension cellulaire (étape 5.10). Les autres anticorps conjugués billes magnétiques peuvent être stockées jusqu&#39;à ce que nécessaire pour les isolements cellulaires ultérieures. </li><li> Incuber les cellules avec des billes magnétiques recouvertes d&#39;anticorps pendant 30-60 minutes sur la glace avec parfois la main de mélange. [Etape critique: Incubation à une température plus élevée ou plus de temps peut entraîner la liaison d&#39;anticorps non spécifiques.] </li><li> Placez le tube de centrifugeuse dans un fort champ magnétique pendant 2 minutes. Toutes les cellules sélectionnés positivement le long avec des perles non liée seront séparés sur le côté du tube. </li><li> Lentement la pipette le surnageant en veillant à ne pas perturber le culot cellulaire. </li><li> Laver les cellules 3-4 fois en eau douce, PBS glacé pour enlever tout reste non spécifique des cellules. </li><li> Resuspendre les cellules dans 30 ul de frais, PBS glacé. </li><li> Pour estimer la pureté et le rendement des cellules, des pipettes de 5 pl de la cellule de suspension sur la surface polie d&#39;un hémocytomètre et compter toutes les cellules visibles fluorescentes sous une lampe fluorescente stéréomicroscope. Vérifiez également la quantité de cellules non fluorescentes et de tout signe d&#39;impuretés. Typiquement, l&#39;échantillon sera hautement enrichi pour les cellules fluorescentes. </li></ol> 7. Isolement d&#39;ARN à partir de billes magnétiques cellules triées: (60 - 75 minutes) <ol><li> Après le dépouillement, un culot cellulaire dans un champ magnétique, éliminer le surnageant et ajouter 20 ul de tampon d&#39;extraction de l&#39;ARN PicoPure ™ Kit d&#39;isolation (Molecular Devices). Selon le nombre de cellules on peut avoir besoin d&#39;ajouter un volume plus élevé de tampon d&#39;extraction. </li><li> Vortexer le tube à la vitesse maximale pour permettre le mélange de culot cellulaire avec un tampon d&#39;extraction. </li><li> Incuber le tube à 42 ° C pendant 30 minutes. </li><li> Pour assurer l&#39;enlèvement des billes magnétiques avant purification sur colonne de l&#39;ARN (voir étape 7.5), le tube est centrifugé à 2000 brièvement (x) g pendant 2 minutes pour sédimenter les billes magnétiques. Le tube est ensuite placé dans un champ magnétique fort pour conserver le culot et le surnageant est transféré à un tube de centrifugeuse nouvelle. </li><li> Extraire et purifier la colonne de l&#39;ARN conformément aux instructions du fabricant de kit d&#39;extraction d&#39;ARN PicoPure est. Traitement à la DNase est facultative et peut être effectuée sur une colonne lors de la purification d&#39;ARN selon l&#39;exigence d&#39;analyse. Enfin, éluer l&#39;ARN lié au total dans un petit volume (11-30 pi) de tampon d&#39;élution et conserver à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation. Si vous le souhaitez une aliquote de 1 ul peuvent être utilisés pour évaluer la qualité totale ARN sur un bioanalyseur 2100 (Agilent Technologies, Inc.) </li></ol> Les résultats représentatifs: Magnétique de tri perle a été utilisée pour isoler des drosophile da neurones (figure 1). Les ARN purifiés à partir de ces neurones isolés da (figure 2a) a été jugée d&#39;excellente qualité, comme indiqué par la présence de 5.8S forte, 18S et 28S du ribosome pics ARN lorsqu&#39;il est analysé sur une bioanalyseur Agilent 2100 (Agilent Technologies, Inc) ( Figure 2b). Début avec 30-40 larves du troisième que nous étions capables d&#39;isoler, en moyenne 300 à 500 neurones da classe IV en utilisant le pilote PPK-GAL4, et 1500-2000 neurones DA (classe I, II, III et IV) en utilisant le pan- da spécifique des neurones GAL4 21-7 conducteur. Pour évaluer l&#39;enrichissement neuronaux spécifiques de nos cellules isolées nous avons effectué quantitative reverse transcription PCR (qRT-PCR) en utilisant deux gènes spécifiques neuronaux marqueurs (elav et futsch). Ces analyses ont révélé un enrichissement significatif pli de gènes marqueurs indiquant à la fois un enrichissement très spécifiques pour les neurones da par rapport à circuler à travers l&#39;aide de notre protocole (Figure 3). Enfin, l&#39;ARN isolé à la fois pan-da neurones et de classe-IV neurones DA a été utilisé pour effectuer des profils d&#39;expression transcriptionnelle sur Agilent Drosophila melanogaster microarrays oligo génome entier (4 x 44K) (figure 4). Ces analyses identifié de nombreux régulateurs préalablement impliqués de da neurone dendrite morphogenèse en plus à un large éventail de molécules non définies auparavant et putatifs voies de transduction de signal qui pourrait jouer des rôles fonctionnels importants dans les neurones da développement. Des études visant à évaluer le rôle potentiel (s) de ces molécules non définies auparavant dans la médiation da neurone développement, et de la morphogenèse spécifiquement dendrite, sont actuellement en cours. <img src="/files/ftp_upload/1599/1599figure1tmb.jpg" border="0" /> Figure 1:. Schéma de tri bille magnétique des neurones DA drosophile (a) appariés pour l&#39;âge des larves du troisième stade portant da spécifique des neurones GAL4, journaliste UAS-GFP-mCD8 transgène sont disséqués en inversant la cuticule des larves dedans-dehors, pour exposer les SNP à la dissociation de tampon et stocké dans PBS glacé. (b) la dissociation enzymatique est effectuée en ajoutant Libérase Blendzyme 3 à la solution contenant la cuticule larvaire. (c) Les tissus larvaires sont encore dissociés par une combinaison de vortex, la trituration et douncing pour enlever les tissus non spécifiquement étiquetés comme les graisses des organismes, des intestins et du SNC. (d, e) Les cellules sont alors filtrés en utilisant un filtre de 30 um cellule. La solution contient une suspension cellulaire unique de différents types cellulaires, y compris les épithéliums, les muscles et les neurones. (F) anti-souris CD8a-anticorps revêtement Dynabeads M-280 sont ajoutés à la suspension de cellules et incubé sur glace pendant 30-60 minutes. ( g) Les billes magnétiques se lie à des neurones qui expriment da une souris CD8 marqués protéine de fusion GFP. (h, i) La bille magnétique cellules enrobées sont séparés en plaçant la solution dans un fort champ magnétique. Le surnageant est jeté et les cellules sont lavées trois fois pour éliminer tout résidu non-spécifique des cellules, ce qui entraîne (j) highly purifiée populations de neurones DA. S&#39;il vous plaît <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1599/1599figure1.jpg">cliquez ici</a> pour voir une version agrandie de la figure 1. <img src="/files/ftp_upload/1599/1599figure2tmb.jpg" border="0" /> Figure 2: Image représentant (a) de la sélection positive des neurones, la GFP fluorescente da classe IV isolés par dissociation cellulaire et magnétiques de tri de billes. La population résultant de neurones a été jugée hautement enrichi pour les neurones da classe IV avec peu ou pas d&#39;impuretés de cellules contaminantes. (B) Une bioanalyseur Agilent 2100 (Agilent Technologies, Inc) électrophérogramme de l&#39;ARN total isolé à partir bille magnétique neurones da triés , montrant une excellente qualité d&#39;ARN total, comme indiqué par la présence de 5.8S, 18S, 28S et ARNr. S&#39;il vous plaît <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1599/1599figure2.jpg">cliquez ici</a> pour voir une version agrandie de la figure 2. <img src="/files/ftp_upload/1599/1599figure3.jpg" border="0" /> Figure 3: qRT-PCR de l&#39;expression du gène marqueur de neurones isolés dans les neurones da (GAL421-7, SAMU-mCD8-GFP) et le débit à travers fraction a été réalisée en trois exemplaires. Les niveaux d&#39;expression des deux gènes marqueurs neuronaux spécifiques (elav et futsch) ont été évalués par qRT-PCR. Les valeurs obtenues à partir de ces analyses ont été normalisées pour le contrôle endogène (rp49), et les niveaux par rapport à ceux observés dans traversent fraction ont été calculés en utilisant la méthode ΔΔCτ 6. Les deux elav et futsch ont été considérablement enrichie dans la population isolée da neurone par rapport à l&#39;écoulement à travers fraction. <img src="/files/ftp_upload/1599/1599figure4tmb.jpg" border="0" /> Figure 4: Représentant de classe IV da spécifique des neurones marqués Cy3 fichier image de biopuces. On voit ici une Agilent Drosophila melanogaster génome entier oligo biopuces (4 x 44K) hybridées avec Cy3 labeld ARN total isolé à partir de neurones da classe IV purifié par le tri bille magnétique. S&#39;il vous plaît <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1599/1599figure4.jpg">cliquez ici</a> pour voir une version agrandie de la figure 4.

<ol>
	<li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila.">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136, 1049-1061 (2009).</li><li>Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim, ., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+that+regulate+establishment,+maintenance,+and+remodeling+of+dendritic+fields.">Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields.</a> Ann. Rev. Neurosci. 30, 399-423 (2007).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis.">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li><li>Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system:+links+with+peripheral+dendrite+morphology.">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134, 55-64 (2007).</li><li>Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+multidendritic+sensory+neurons+are+necessary+for+rhythmic+locomotion+behavior+in+Drosophila+larvae.">Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 5199-5204 (2007).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+methods.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) methods.</a> Methods. 25, 402-408 (2001).</li></ol>

Le protocole présenté ici est optimisé pour l&#39;isolement et la purification des neurones périphériques qui adhèrent fermement à la surface interne de la cuticule drosophile troisième stade larvaire en utilisant une stratégie de billes magnétiques tri cellulaire. Alors que nous avons utilisé ce protocole pour isoler spécifiquement drosophile neurones DA, les applications de ce protocole à l&#39;isolement des autres types de cellules qui adhèrent à la cuticule larvaire ou pupal de développement (par exe...

Équipement <ul><li> (10) aimants néodyme de bloc (Magnetics J &amp; K, Inc, Cat. # B444B), alternativement dynamag ™ -2 (Invitrogen, Cat. # 123-21D) peut être utilisé. </li><li> Grinder Kontes tissu de verre, 2 ml de capacité de travail, avec un pilon grand dégagement (Cat. # 885300-0002) </li><li> Filtres cellulaire, par exemple MACS Pré-Séparation Filtre (Miltenyi Biotec, Cat. # 130-041-407) </li><li> Pétri de 35 mm-plats revêtus d&#39;Sylgard (Dow Corning Corporation, Cat. # 3097358-1004) </li><li> Des outils de dissection: deux paires de pinces à Dumont n ° 5 (Outils Fine Science, n ° de cat 11251-20.) </li><li> Vannas printemps micro-dissection ciseaux (Outils Fine Science, Cat. # 15000-08) </li><li> Pipettes (P-1000, P-100, P-10) avec embouts jetables </li><li> Hémocytomètre standard pour compter les cellules et la pureté devis </li><li> Pipettes Pasteur avec des conseils polies au feu de diamètre standard, réduit à ~ 50% du diamètre standard et réduit à ~ 25% du diamètre standard pour la trituration </li><li> Table top micro-centrifugeuse (1-16,000 (x) g) </li><li> Vortex </li><li> Fluorescent stéréomicroscope (une MZ16FA Leica a été utilisé dans ce protocole) </li></ul>

isolation and purification of drosophila peripheral neurons by magnetic bead sorting

L&#39;<em&gt; Drosophile</em&gt; Système nerveux périphérique (SNP) est un modèle puissant pour étudier les processus complexes du développement neuronal et la morphogenèse des dendrites au niveau moléculaire et fonctionnelle. Pour faciliter ces analyses, nous avons développé une stratégie pour l&#39;isolement d&#39;une sous-classe de neurones du SNP appelé arborisation dendritique (bis) les neurones qui ont été largement utilisées pour l&#39;étude de la morphogenèse dendrite<sup&gt; 1,2</sup&gt;. Ces neurones sont très difficiles à isoler comme une population pure, due en partie à leur occurrence extrêmement faible et leur difficulté à atteindre l&#39;emplacement ci-dessous la cuticule larvaire dure de chitine. Notre méthode nouvellement développée permet de surmonter ces défis, et est basé sur un enrichissement cellulaire rapide et précis à l&#39;aide d&#39;anticorps billes magnétiques recouvertes. Pour nos études de tri magnétique perles, nous avons utilisé appariés selon l&#39;âge des larves troisième stade exprimer une souris CD8 marqués protéine de fusion GFP (<em&gt; UAS-GFP-mCD8</em&gt;)<sup&gt; 3</sup&gt; Sous le contrôle de soit l&#39;arborisation dendritique de classe IV (da) spécifique des neurones<em&gt; Pickpocket (PPK)-GAL4</em&gt; Chauffeur<sup&gt; 4</sup&gt; Ou le contrôle de la pan-da spécifique des neurones GAL4<sup&gt; 21-7</sup&gt; Chauffeur<sup&gt; 5</sup&gt;. Bien que ce protocole a été optimisé pour isoler les cellules du SNP qui sont attachés à la paroi interne de la cuticule des larves, en faisant varier quelques paramètres, le même protocole pourrait être utilisé pour isoler de nombreux types cellulaires différents attaché à la cuticule au stade larvaire ou nymphal des développement (par exemple l&#39;épithélium, le muscle, oenocytes etc), ou d&#39;autres types cellulaires à partir d&#39;organes larvaires en fonction du motif de GAL4-pilote spécifique d&#39;expression. L&#39;ARN isolé par cette méthode est de haute qualité et peut être facilement utilisé pour les analyses génomiques aval telles que les études génétiques biopuces profilage de l&#39;expression. Cette approche offre un nouvel outil puissant pour effectuer des études sur les isolés<em&gt; Drosophile</em&gt; Dendritiques arborisation (da) neurones fournissant ainsi de nouvelles connaissances sur les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la morphogenèse des dendrites.

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Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

Dans cette vidéo, article, nous présentons une méthode pour l&#39;isolement et la purification de<em&gt; Drosophile</em&gt; Neurones périphériques en utilisant une bille magnétique rapide stratégie assisté tri cellulaire. ARN obtenu à partir des cellules isolées peuvent être facilement utilisés pour des applications en aval y compris les analyses de biopuces.

Isolement et purification de Drosophile Neurones périphériques en triant bille magnétique

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

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Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

13.3K vues.  George Mason University. Dans cette vidéo, article, nous présentons une méthode pour l'isolement et la purification de Drosophile Neurones périphériques en utilisant une bille magnétique rapide stratégie assisté tri cellulaire. ARN obtenu à partir des cellules isolées peuvent être facilement utilisés pour des applications en aval y compris les analyses de biopuces.

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Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Coloration des protéines dans les gels de Coomassie G-250, sans solvant et l&#39;acide acétique organique

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

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Biologie

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

Isolement des Drosophila melanogaster Testicules

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Isolement et purification de la kinésine de Drosophila Embryons

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

Isolement de la chromatine par purification d&#39;ARN (CHIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their prominent presence is often associated with poor prognosis1,2. CAFs are an activated subpopulation of stromal fibroblasts, many of which express the myofibroblast marker &alpha;-SMA3. CAFs originate from local tissue fibroblasts as well as from bone marrow-derived cells recruited into the developing tumor and adopt a CAF phenotype under the influence of the tumor microenvironment4. CAFs were shown to facilitate tumor initiation, growth and progression through signaling that promotes tumor cell proliferation, angiogenesis, and invasion5-8. We demonstrated that CAFs enhance tumor growth by mediating tumor-promoting inflammation, starting at the earliest pre-neoplastic stages9. Despite increasing evidence of the key role CAFs play in facilitating tumor growth, studying CAFs has been an on-going challenge due to the lack of CAF-specific markers and the vast heterogeneity of these cells, with many subtypes co-existing in the tumor microenvironment10. Moreover, studying fibroblasts in vitro is hindered by the fact that their gene expression profile is often altered in tissue culture11,12 . To address this problem and to allow unbiased gene expression profiling of fibroblasts from fresh mouse and human tissues, we developed a method based on previous protocols for Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)13,14. Our approach relies on utilizing PDGFR&alpha; as a surface marker to isolate fibroblasts from fresh mouse and human tissue. PDGFR&alpha; is abundantly expressed by both normal fibroblasts and CAFs9,15 . This method allows isolation of pure populations of normal fibroblasts and CAFs, including, but not restricted to &alpha;-SMA+ activated myofibroblasts. Isolated fibroblasts can then be used for characterization and comparison of the evolution of gene expression that occurs in CAFs during tumorigenesis. Indeed, we and others reported expression profiling of fibroblasts isolated by cell sorting16. This protocol was successfully performed to isolate and profile highly enriched populations of fibroblasts from skin, mammary, pancreas and lung tissues. Moreover, our method also allows culturing of sorted cells, in order to perform functional experiments and to avoid contamination by tumor cells, which is often a big obstacle when trying to culture CAFs.

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Cancer Associated Fibroblasts (CAFs) facilitate tumor initiation, growth and progression through signaling that promotes proliferation, angiogenesis, and inflammation. Here we describe a method to isolate pure populations of normal fibroblasts and CAFs from fresh mouse and human tissues by cell sorting, using PDGFR&#x03B1; as a surface marker.

Isolation des fibroblastes normales et cancéreuses associées à partir de tissus frais par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. Although fruit flies provide obvious experimental advantages, research on neurodegenerative diseases has mostly relied on traditional techniques, including genetic interaction, histology, immunofluorescence, and protein biochemistry. These techniques are effective for mechanistic, hypothesis-driven studies, which lead to a detailed understanding of the role of single genes in well-defined biological problems. However, neurodegenerative diseases are highly complex and affect multiple cellular organelles and processes over time. The advent of new technologies and the omics age provides a unique opportunity to understand the global cellular perturbations underlying complex diseases. Flexible model organisms such as Drosophila are ideal for adapting these new technologies because of their strong annotation and high tractability. One challenge with these small animals, though, is the purification of enough informational molecules (DNA, mRNA, protein, metabolites) from highly relevant tissues such as fly brains. Other challenges consist of collecting large numbers of flies for experimental replicates (critical for statistical robustness) and developing consistent procedures for the purification of high-quality biological material. Here, we describe the procedures for collecting thousands of fly heads and the extraction of transcripts and metabolites to understand how global changes in gene expression and metabolism contribute to neurodegenerative diseases. These procedures are easily scalable and can be applied to the study of proteomic and epigenomic contributions to disease.

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

We describe here the procedures for the extraction and purification of mRNA and metabolites from Drosophila heads. We are applying these techniques to better understand the cellular perturbations underlying neuronal degeneration. These methodologies can be easily scaled and adapted for other "omic" projects.

Purification des relevés de notes et de métabolites<em&gt; Drosophila</em&gt; Têtes

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. However, the use of biochemical screens aimed at extending the knowledge gained from genetic analysis was explored only recently. Here we describe a method to purify the protein complex that associates with any protein of interest from adult fly heads. This method takes advantage of the Drosophila GAL4/UAS system to express a bait protein fused with a Tandem Affinity Purification (TAP) tag in fly neurons in vivo, and then implements two rounds of purification using a TAP procedure similar to the one originally established in yeast1 to purify the interacting protein complex. At the end of this procedure, a mixture of multiple protein complexes is obtained whose molecular identities can be determined by mass spectrometry. Validation of the candidate proteins will benefit from the resource and ease of performing loss-of-function studies in flies. Similar approaches can be applied to other fly tissues. We believe that the combination of genetic manipulations and this proteomic approach in the fly model system holds tremendous potential for tackling fundamental problems in the field of neurobiology and beyond.

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Drosophila is famous for its powerful genetic manipulation, but not for its suitability of in-depth biochemical analysis. Here we present a TAP-based procedure to identify interacting partners of any protein of interest from the fly brain. This procedure can potentially lead to new avenues of research.

Identifier les interactions protéine-protéine dans<em&gt; Drosophila</em&gt; Têtes de Tandem Affinity Purification adultes (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to complete. We describe a method for the rapid isolation of mitochondria from mammalian biopsies using a commercial tissue dissociator and differential filtration. In this protocol, manual homogenization is replaced with the tissue dissociator&#8217;s standardized homogenization cycle. This allows for uniform and consistent homogenization of tissue that is not easily achieved with manual homogenization. Following tissue dissociation, the homogenate is filtered through nylon mesh filters, which eliminate repetitive centrifugation steps. As a result, mitochondrial isolation can be performed in less than 30 min. This isolation protocol yields approximately 2 x 1010 viable and respiration competent mitochondria from 0.18 &#177; 0.04 g (wet weight) tissue sample.

A method for rapid isolation of mitochondria from mammalian tissue biopsies is described. Rat liver or skeletal muscle preparations were homogenized with a commercial tissue dissociator and mitochondria were isolated by differential filtration through nylon mesh filters. Mitochondrial isolation time is &#60;30 min compared to 60 - 100 min using alternative methods.

Isolement rapide et la purification des mitochondries pour la transplantation par la dissociation des tissus et différencié Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived microvesicles (MVs, diameter &#62; 100 nm) is a fundamental cellular process that occurs in all living cells. These vesicles transport proteins, lipids and nucleic acids specific for their cell of origin and in vitro studies have highlighted their importance as mediators of intercellular communication. EVs have been successfully isolated from various body fluids and especially EVs in blood have been identified as promising biomarkers for cancer or infectious diseases. In order to allow the study of MV subpopulations in blood, we present a protocol for the standardized isolation and characterization of MVs from peripheral blood samples. MVs are pelleted from EDTA-anticoagulated plasma samples by differential centrifugation and typically possess a diameter of 100 - 600 nm. Due to their larger size, they can easily be studied by flow cytometry, a technique that is routinely used in clinical diagnostics and available in most laboratories. Several examples for quality control assays of the isolated MVs will be given and markers that can be used for the discrimination of different MV subpopulations in blood will be presented.

Extracellular vesicles present in blood have been suggested as novel biomarkers for various diseases. Here, we present a protocol for the isolation of large plasma membrane-derived microvesicles from peripheral blood samples and their subsequent analysis by conventional flow cytometry and Western Blotting.

Isolement et caractérisation de microvésicules dans le sang périphérique

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived ...

Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the mechanisms are not well understood. To investigate coral response to stressors, we need tools for analyzing cellular responses. In particular, we need tools that facilitate the application of functional assays to better understand how cell populations are reacting to stress. In the current study, we use fluorescence-activated cell sorting (FACS) to isolate and separate different cell populations in stony corals. This protocol includes: (1) the separation of coral tissues from the skeleton, (2) creation of a single cell suspension, (3) labeling the coral cells using various markers for flow cytometry, and (4) gating and cell sorting strategies. This method will enable researchers to work on corals at the cellular level for analysis, functional assays, and gene expression studies of different cell populations.

Corals create biodiverse ecosystems important for both humans and marine organisms. However, we still do not understand the full potential and function of many coral cells. Here, we present a protocol developed for the isolation, labeling, and separation of stony coral cell populations.

Tri cellulaire activée par fluorescence pour l’isolement des populations de cellules sclérosiennes

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the ...