Travail dans le laboratoire des auteurs est financé par une subvention de l&#39;Institut national des sciences médicales générales (GM41628) et par une subvention de l&#39;Institut Stowers pour la recherche médicale de Fonds de recherche médicale Nelson Helen à la Fondation communautaire du Grand Kansas City.

1. génération et de la culture de lignées cellulaires HEK293 stable exprimant Cadrage en pied ou versions mutantes de épitope FLAG-étiqueté Ino80 ou autres sous-unités INO80 complexes <ol><li> Clone ADNc codant pleine longueur ou mutant humain Ino80 ATPase ou d&#39;une autre sous-unité INO80 dans le vecteur d&#39;expression mammifère pcDNA5 / FRT avec un, N-terminal épitope FLAG tag dans le cadre. </li><li> Confirmer la séquence des ADNc insérés par séquençage de l&#39;ADN avant de poursuivre. </li><li> Pour effectuer la transfection, Flp-In croître des cellules HEK293 dans des plats de 10 cm pour culture de tissus dans un milieu contenant du DMEM (milieu de Eagle modifié par Dulbecco), 5% de glutamine, et 10% de FBS (sérum fœtal bovin). </li><li> Lorsque les cellules atteignent environ 70% de confluence, ajouter à chaque boîte de culture de tissu d&#39;un mélange de 40 ul de FuGENE6 réactif de transfection, 0,5 pg du pcDNA5 / FRT plasmide d&#39;expression approprié, et 9,5 pg de pOG44, qui code pour une recombinase Flp, dans un volume total de 800 ul. </li><li> 48 h plus tard, et s trypsiniserPLIT cellules dans un rapport de 1:30 en boîtes de 10 cm, et les cultiver dans du DMEM avec 5% de glutamine, 10% de FBS, et 100 pg / ml d&#39;hygromycine B pour 3 - 4 semaines. Changer le milieu de culture quand il commence à jaunir (généralement tous les 3 - 5 jours). </li><li> Pour identifier les clones positifs qui expriment le plus haut niveau de la protéine étiquetée FLAG, sélectionnez colonies hygromycine individu résistant B-et les transférer sur un seul puits d&#39;une plaque de 24 puits. <ol><li> Une fois que les cellules atteignent 80% de confluence, les cellules de prélèvement de chaque puits à ~ 1 ml de PBS et culot par centrifugation à 1000 xg pendant 5 min. </li><li> Après élimination du surnageant, remettre en suspension le culot cellulaire dans 60 pi de tampon d&#39;échantillon SDS-PAGE. </li><li> Sous réserve de la moitié du culot cellulaire remis en suspension à la page de SDS et transfert de Western pour surveiller l&#39;expression de la protéine étiquetée FLAG d&#39;appât; sauver l&#39;autre moitié pour les analyses futures. </li></ol></li><li> Si aucune protéine Ino80 humaine étiquetée FLAG est détectée dans des lysats cellulaires, étendre la première popu cellulaire clonalelation de plus par étalement des cellules provenant de puits individuels d&#39;une plaque de 24 puits dans 15 cm des boîtes de culture de tissus. <ol><li> Pour récolter des cellules de 15 cm plats, remettre en suspension près de cellules confluentes dans le froid de la glace PBS et transférer dans un tube conique de 50 ml. </li><li> Porter à un volume final de 50 ml par addition supplémentaire de PBS. </li><li> Cellules à granules à 1000 g pendant 5 min, et supprimer autant que possible de le surnageant. </li><li> Remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml de tampon Lys450 (20 mM de HEPES-NaOH à pH 7,9, NaCl 450, 0,5% de Triton X-100, 10 mM de KCl, 4 mM de MgCl2, EDTA 0,2 mM, glycerol à 10%, DTT 1 mM, 200 uM PMSF et 1: 1000 Inhibiteur de la protéase Cocktail). NOTE: ici et d&#39;ailleurs, toujours ajouter TNT, PMSF, et inhibiteur de la protéase cocktail de tampons immédiatement avant de commencer une expérience. </li><li> Protéines du lysat de cellules entières résultant immuno-précipité FLAG-balisé au moyen de 20 pi de gel d&#39;agarose anti-FLAG, et d&#39;analyser les éluats FLAG par western blot. [Pour plus de détails immunprocédure de oprecipitation, voir l&#39;étape 5] </li></ol></li><li> Préparer stocks congelés de lignées de cellules clonales souhaités 12 et rangez-les dans de l&#39;azote liquide jusqu&#39;à utilisation. </li></ol> 2. croissance des lignées cellulaires HEK293 dans des flacons roulants Pour une préparation à grande échelle de complexes INO80, dans des cellules de culture de 10 à 20 flacons roulants; un rendement typique de chaque bouteille de rouleau est ~ 1 ml de cellules tassées. <ol><li> Pour chaque bouteille à rouleaux, ajouter 200 ml de DMEM, 5% de glutamine, et 10% de sérum de veau, sans hygromycine B. </li><li> Transférer toutes les cellules d&#39;un seul près de confluence 15 cm plat dans chaque bouteille de rouleau </li><li> Placer les bouteilles de rouleaux dans un 37 ° C rouleau bouteille incubateur et tournent à 0,2 rpm. </li><li> Une fois que les cellules atteignent ~ 70% de confluence, versez-la et jetez le milieu. </li><li> Ajouter ~ 50 ml de PBS glacé à chaque bouteille. Soutenir des bouteilles horizontalement, agiter doucement pour desserrer la monocouche cellulaire. </li><li> Transférer les cellules remises en suspension à 250 ml plastbouteilles coniques ic et placer sur la glace. </li><li> Rincer les flacons roulants avec plus PBS, transférer séquentiellement d&#39;une bouteille à. Lorsque la solution de rinçage est plus claire (généralement après avoir été utilisée pour le rinçage environ 5 bouteilles), ajouter à la suspension de cellules. </li><li> Cellules granulés par centrifugation à 400 g pendant 10 min. </li><li> Resuspendre doucement les cellules dans du PBS, les combiner en une seule bouteille de 250 ml conique, et garder sur la glace jusqu&#39;à ce que le traitement ultérieur. </li></ol> 3 siRNA médiation knockdown de INO80 sous-unités dans les cellules exprimant autre étiquetée FLAG INO80 sous-unité Pour obtenir Subcomplexes INO80 qui n&#39;ont pas une seule unité, l&#39;utilisation FLAG-immunopurification pour purifier des complexes INO80 à partir de cellules ou de cellules siRNA traités exprimant de façon stable shRNA. Le siRNA &quot;reverse&quot; (petits ARN interférents) protocole de transfection décrit ici est optimisé pour les cellules HEK293 qui poussent dans 15 cm plats. Le protocole est pour un seul 15 cm plat de cellules et shoULD être mis à l&#39;échelle en conséquence, selon le nombre de cellules nécessaires. Pour préparer des quantités utiles de biochimiquement complexe INO80 à partir de cellules de siARN traité, il faut intensifier les cultures cultivées dans 40 15 cm plats; ceux-ci donneront environ 2 - 4 ml de culot globulaire. <ol><li> Cultiver les cellules HEK293 exprimant de façon stable le sous-unité du complexe désiré INO80 à proximité de confluence dans des boîtes de 15 cm. </li><li> Ajouter un volume de tampon de remise en suspension de siRNA (20 mM de KCl, 6 mM HEPES, pH 7,5, et 0,2 mM de MgCl2), suffisante pour préparer une solution mère de 50 pM de siRNA à un tube lyophilisé contenant des siRNA. Introduire à la pipette la solution de haut en bas plusieurs fois et incuber sur un nutator pendant 30 min à température ambiante pour assurer le siRNA est entièrement dissous. </li><li> Préparer un cocktail de transfection contenant siRNA et réactif de transfection. Mélanger 10 ul de la solution mère de 50 uM de siRNA avec 32 ul Lipofectamine RNAiMAX et ajouter 4 ml d&#39;Opti-MEM milieu sérique réduit avec un mélange très doux; albas tous les réactifs s&#39;équilibrent à la température ambiante avant de l&#39;utiliser. </li><li> Incuber le mélange à température ambiante pendant 30 min. </li><li> Préparation des cellules Flp-In HEK293 exprimant de façon stable le sous-unité INO80 souhaitée pour la transfection. <ol><li> Au cours de l&#39;incubation de l&#39;étape 3.4, laver les cellules dans les plats 15 cm une fois avec RT PBS. </li><li> Après avoir retiré PBS, traiter les cellules avec 1 ml de trypsine juste jusqu&#39;à ce qu&#39;ils commencent à se décoller de la plaque. </li><li> Ajouter immédiatement 10 ml de milieu complet (DMEM + 5% de glutamine + 10% de FBS) à cellules trypsinisées et mélanger doucement. Recueillir les cellules par centrifugation à 1000 g pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Remettre en suspension le culot cellulaire dans ~ 4 ml de milieu complet, et compter la remise en suspension des cellules en utilisant un hématimètre. </li><li> Diluer les cellules avec du milieu complet à une concentration de 5,4 x 10 ~ 6 / ml. </li></ol></li><li> Pour chaque 15 cm plat, ajouter 15 ml de milieu de culture complet suivi par 4 ml de cocktail de transfection. Agiter doucement pour assurer le support et la transfection cocktail sont thoroughly mélangé. Enfin, ajouter un ml de suspension cellulaire et de nouveau agiter doucement pour disperser uniformément les cellules. </li><li> Après 60 h de culture dans un 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur, retirez délicatement moyen, remettre les cellules en PBS glacé, et procéder immédiatement à préparer des extraits nucléaires. </li></ol> 4 Préparation des extraits nucléaires Cette procédure a été modifiée par le protocole de Dignam 13 et peut être mise à l&#39;échelle vers le haut ou vers le bas selon la taille de départ culots cellulaires. Typiquement, 1 ml de rendements en emballage de pastilles de cellule 1 ml d&#39;extrait nucléaire final. Tous les tampons doivent être froid glace, et toutes les mesures doivent être effectuées dans une chambre froide ou sur de la glace d&#39;une chambre froide approprié n&#39;est pas disponible. <ol><li> Isolement des noyaux: <ol><li> Transférer en douceur les cellules à une taille appropriée (15 ou 50 ml) tube gradué et de spin conique à 1000 g pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Enlever le surnageant et mesurer le volume du pixel de l&#39;hématocritelaisser. 1 ml de cellules tassées correspond à ~ 3 x 10 8 cellules HEK293. </li><li> Ajouter 5 volumes conditionnés de cellules de tampon A (10 mM d&#39;HEPES, pH 7,9, 1,5 mM de MgCl2, 10 mM de KCl et fraîchement ajouté 1 mM de DTT, 200 uM de PMSF et 1: 1000 cocktail inhibiteur de la protéase). Remettre en suspension le culot de cellules par pipetage doux. </li><li> Incuber sur de la glace pendant exactement 10 minutes. </li><li> Pellet les cellules à 1000 g pendant 10 min à 4 ° C, et retirer le surnageant. </li><li> La taille du culot cellulaire devrait augmenter jusqu&#39;à deux fois au cours de l&#39;incubation dans le tampon A. </li><li> Remettre en suspension les cellules dans deux volumes de cellules tassées de tampon A, et transférer la suspension cellulaire à un homogénéisateur de taille appropriée du tissu Dounce. Si à partir de moins de 2 ml de cellules sont emballées, un homogénéisateur 7 ml; pour 2 - 4 ml cellules sont emballées, 15 ml d&#39;homogénéisation; et pour plus de 10 ml de cellules sont emballées, 40 ml d&#39;homogénéisation. </li><li> Homogénéiser la suspension cellulaire avec le pilon en verre LOOSE de l&#39;homogénéisation non Douncejusqu&#39;à 90% des cellules colorer positivement avec 1% de bleu de trypan. </li><li> Transférer la suspension dans un tube de centrifugeuse à grande vitesse 45 ml et centrifuger à 25 000 g pendant 20 min à 4 ° C dans un rotor JA-17 ou similaire (voir le tableau des Matériaux / Équipement). </li><li> Du culot nucléaire, éliminer le surnageant, qui contient des protéines ou des protéines qui s&#39;échappent du noyau lors du fractionnement du cytosol. </li></ol></li><li> Extraction des noyaux de sel: <ol><li> Ajouter du tampon C (20 mM de HEPES, pH 7,9, 25% de glycerol, 1,5 mM de MgCl2, 0,2 mM d&#39;EDTA, et fraîchement ajouté 1 mM de DTT, 200 uM de PMSF et 1: 1000 cocktail inhibiteur de protéase) pour le culot nucléaire; utiliser 2,5 ml de tampon C pour 3 ml de volume de départ de l&#39;hématocrite (~ 1 x 10 9 cellules). </li><li> L&#39;utilisation d&#39;une tige de verre ou d&#39;une pipette, déloger le culot nucléaire à partir de la paroi du tube et de transférer l&#39;ensemble du mélange dans un homogénéisateur Dounce d&#39;une taille appropriée. </li><li> Remettre en suspension les noyaux en homogénéisant emélange de e avec deux coups de pilon LOOSE. </li><li> Transférer la fraction nucléaire remis en suspension dans un bécher refroidi. Choisir un bécher de telle sorte que la suspension va remplir le récipient à au moins 0,5 cm de profondeur. </li><li> Pour extraire les protéines de la chromatine nucléaire ou d&#39;autres structures insolubles, augmenter progressivement la concentration en sel de la suspension à 0,42 M de NaCl par addition goutte à goutte de 5 M de NaCl, tout en agitant doucement la suspension avec une pipette ou une tige de verre sur de la glace; une fois la totalité du NaCl 5 M ont été ajoutées, la solution doit devenir très visqueux ou de type gel. Calculer le volume de NaCl 5 M nécessaire pour porter la solution à une concentration finale de 0,42 M de NaCl selon la formule suivante: <img alt="L&#39;équation 1" fo:content-width="4.5in" src="/files/ftp_upload/51720/51720equation1.jpg" width="500" /></li><li> Soigneusement transférer la suspension visqueuse dans 10 ml tubes en polycarbonate pour un type 70,1 Ti rotor (ou l&#39;équivalent) des bouteilles de polycarbonate ou 70 ml pour un type 45 Ti or rotor similaire (voir le tableau des Matériaux / Équipement). Fermer hermétiquement avec du parafilm si vous utilisez tubes de 10 ml ou avec l&#39;ensemble de bouchon si vous utilisez 70 ml bouteilles. </li><li> Basculer lentement les tubes scellés à 4 ° C pendant 30 min en utilisant un nutator. </li><li> Faites tourner les échantillons dans un type de 45 ou 70,1 Ti Ti rotor pendant 30 min à 120 000 xg à 4 ° C. </li><li> Transférer le surnageant dans un tube en matière plastique unique ou d&#39;une bouteille. Ce surnageant est l&#39;extrait nucléaire, et le culot contenant la chromatine nucléaire et d&#39;autres débris. </li><li> Diviser l&#39;extrait nucléaire en aliquotes de taille conventionnelle, le congeler dans l&#39;azote liquide, et de le stocker à -80 ° C. </li></ol></li></ol> 5. immunoaffinité Purification de la INO80 humaine ou INO80 Subcomplexes <ol><li> Pour décongeler extrait nucléaire congelés, placez les tubes contenant l&#39;extrait sur la paillasse ou faire rouler les tubes entre les mains jusqu&#39;à ce que la matière congelée devient une bouillie. Ensuite, placer les tubes sur de la glace ou dans la chambre froide jusqu&#39;à ce que l&#39;extrait est totalement thawed. </li><li> Transférer l&#39;extrait nucléaire décongelé à tubes de 10 ml en polycarbonate d&#39;ultracentrifugation, et essorage à 100 000 g pendant 20 min à 4 ° C dans un rotor de type Ti 70.1 ou équivalent pour éliminer tout précipité qui s&#39;est formée au cours du cycle de gel-dégel. </li><li> Transférer le surnageant dans un tube conique de 15 ml. Ajouter frais Cocktail TNT, PMSF, et l&#39;inhibiteur de protéase à des concentrations finales de 1 mM de DTT, 200 uM PMSF et 1: 1000 Inhibiteur de la protéase Cocktail. </li><li> Pour préparer anti-FLAG agarose pour la immunopurification, transférer 200 pl de 50% suspension de billes d&#39;agarose anti-FLAG à un tube de 1,5 ml à l&#39;aide d&#39;un P200 ou d&#39;une pipette similaire avec une pointe dont l&#39;extrémité a été coupée avec un scalpel propre ou une lame de rasoir. </li><li> Pellet les billes par centrifugation dans une microcentrifugeuse de paillasse à 8000 xg pendant 30 sec. Enlever le surnageant et laver les billes en remettant en suspension les billes dans 1 ml de tampon Lys450, et sédimenter les billes à 8000 g pendant 30 sec. Laver le bEADS deux fois de plus. </li><li> Remettre en suspension les billes d&#39;agarose anti-FLAG lavées dans environ 100 ul de l&#39;extrait nucléaire au moyen d&#39;un P200 ou similaire pipette de volume variable avec une pointe à partir de laquelle l&#39;extrémité a été coupée avec un scalpel propre ou une lame de rasoir et, en utilisant la même extrémité, le transfert les billes en suspension au tube de 15 ml conique contenant l&#39;extrait. Répétez plusieurs fois jusqu&#39;à ce que toutes les perles ont été transférés dans le tube de 15 ml. </li><li> Incuber le mélange extrait / perle pendant 4 heures à 4 ° C avec une rotation lente sur un agitateur de laboratoire. OPTION: Inclure benzonase à une concentration de 25 unités / ml pour éliminer l&#39;ADN contaminant. </li><li> Recueillir l&#39;agarose FLAG par centrifugation à 1 000 g pendant 5 min à 4 ° C. </li><li> Remettre en suspension dans 10 ml Lys450 à laver, incuber 5 min à 4 ° C avec un doux balancement sur nutator. Pellet les perles à 1000 g pendant 5 min à 4 ° C. </li><li> Remettre en suspension dans 100 - 150 pi de Lys450 et perles de transfert à un tube de 1,5 ml. Continue pour rincer le tube de 15 ml conique avec 100 - 150 pi de Lys450 jusqu&#39;à ce que toutes les perles ont été transférés dans le tube à centrifuger. </li><li> Isoler les perles à 8000 g pendant 30 sec à 4 ° C dans une microcentrifugeuse. Laver trois fois de plus avec 1 ml Lys450 et une fois avec un tampon de 1 ml d&#39;EB100 (10 mM HEPES pH 7,9, 10% de glycerol, 100 mM de NaCl, 1,5 mM de MgCl2, 0,05% de Triton X-100, et fraîchement ajouté mM DTT 1, 200 uM de PMSF , et 1: 1000 Inhibiteur de la protéase Cocktail). </li><li> Pour éluer les protéines liées, ajouter du tampon de EB100 200 pi contenant 0,25 mg / ml de peptide FLAG 1x. Incuber 30 min à 4 ° C sur une nutator chacun. </li><li> Pellet les perles à 8000 g pendant 30 sec à 4 ° C dans une microcentrifugeuse. Transférer le surnageant, qui contient le complexe de INO80 élue, à un microtube frais. </li><li> Répétez l&#39;élution quatre fois, et mettre en commun toutes les surnageants dans un seul tube. </li><li> Pour éliminer les billes d&#39;agarose-FLAG résiduel à partir de la fraction protéique éluée,passer l&#39;éluat à travers une colonne de centrifugation vide. </li><li> Concentrer la fraction de protéine éluée ~ 10 fois en utilisant un dispositif de filtre centrifuge ultra (50000 moléculaire de coupure de poids). </li><li> Pour éliminer le peptide FLAG, passer le concentré fraction protéique séquentiellement par deux colonnes de dessalage. </li><li> Diviser la fraction protéique purifiée, débarrassée des sels dans 20 aliquotes, congelés dans l&#39;azote liquide et stockés à -80 ° C. </li><li> Analyser la composition de sous-unité de INO80 ou Subcomplexes de INO80 sur des gels colorés à l&#39;argent ou par western blot, et estimer leurs concentrations en semi-quantitative western blot en utilisant des préparations de sous-unités de INO80 recombinantes de concentration connue en tant que normes. </li></ol>

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Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Études structurales et fonctionnelles de plusieurs sous-unités des complexes de mammifères de remodelage du eucaryotes supérieurs ont été entravés par la difficulté de préparer biochimiquement des quantités utiles de ces complexes contenant des sous-unités mutantes ou manquant certaines sous-unités au total. Il ya un certain nombre d&#39;obstacles techniques: d&#39;abord, la manipulation génétique dans les cellules de mammifères a été techniquement difficile et de longue haleine. A la différence des ce...

Complexes de remodelage de la famille SNF2 évolutives conservées sont des régulateurs clés de l&#39;organisation de la chromatine et de l&#39;ADN accessibilité 1. Ces complexes de remodelage comprennent toujours une sous-unité ATPase de SNF2 central en forme, ce qui, dans certains cas, les assemble avec différents accessoires et des protéines formant des ensembles de macro-moléculaire sous-unités multiples. Pour étudier les détails moléculaires des processus de remodelage de la chromatine dépendant de l&#39;ATP, il est important de comprendre les contributions des sous-ensembles de données de sous-unités et / ou des structures de domaine pour les activités des complexes. Ces analyses doivent être capables de générer des complexes mutants hautement purifiés qui manquent particulier sous-unités protéiques ou des structures de domaine. Des études antérieures structure-fonction de complexes de remodelage de la chromatine dépendant de l&#39;ATP ont largement centrée sur le système de levure modèle en raison de la manipulabilité supérieure du génome de la levure (voir, par exemple, 1-4) refs. Compte tenu de la conservation decomposition de la sous-unité et la fonctionnalité entre complexes de remodelage orthologues, des études de la structure et la fonction des complexes de remodelage de levure ont fourni des informations importantes sur leurs homologues chez les eucaryotes supérieurs. Néanmoins, il n&#39;existe spécifiques aux espèces sensibles différences entre les complexes de remodelage, résultant de gain ou de perte de sous-unités spécifiques de l&#39;espèce, le gain ou la perte de domaines spécifiques à l&#39;espèce de sous-unités conservées, et la variabilité de séquence dans des domaines conservés de sous-unités conservées. Ces différences ne peuvent en principe être motivées par la nécessité pour les cellules eucaryotes supérieures à s&#39;adapter à de nouveaux environnements moléculaires et cellulaires. Ainsi, comprendre comment les sous-unités de complexes de remodelage eucaryotes supérieurs contribuent au processus de remodelage du nucléosome est précieux, non seulement parce qu&#39;il met en lumière les mécanismes de base du processus de remodelage de la chromatine dépendant de l&#39;ATP, mais peut également fournir de précieuses informations sur les mécanismes par lesquels la structure de la chromatine et l&#39;expression des gènes dans higses eucaryotes sont réglementés. Jusqu&#39;à présent, il ya eu seulement limité études structurales et fonctionnelles de plusieurs sous-unités de mammifères complexes de remodelage, en partie en raison des difficultés à obtenir des complexes de remodelage de la chromatine biochimiquement définies et Subcomplexes. Nous avons partiellement contourné ces difficultés avec les procédures décrites ci-dessous, dans lequel la purification par immuno-affinité est utilisé pour préparer intactes INO80 ou INO80 Subcomplexes de cellules humaines exprimant de façon stable N-terminale épitope FLAG étiqueté de type sauvage ou des versions mutantes de Ino80 5-7 (Figure 1) . Pour obtenir des complexes de INO80 intactes à partir de cellules humaines, la recombinaison médiée par Flp est utilisée pour générer des lignées de cellules HEK293 exprimant de manière stable transgéniques épitope FLAG ADNc codant pour des sous-unités de la catégorie du complexe INO80 8-10. Étant donné que la surexpression de sous-unités de INO80 peut être quelque peu toxique, il est nécessaire d&#39;isoler et de conserver les lignées cellulaires clonales de moins de co sélectifnditions pour assurer l&#39;expression stable du transgène au cours des nombreux passages nécessaires à l&#39;expansion de cultures cellulaires à grande échelle. Pour obtenir Subcomplexes de INO80 petits qui contiennent un sous-ensemble de sous-unités, nous avons utilisé avec succès deux approches (Figure 2A, B). Dans la première, on génère des lignées cellulaires HEK293 Flp-In exprimant de manière stable les versions mutantes de Ino80 domaines qui n&#39;ont pas requis pour l&#39;interaction avec les sous-unités spécifiques 5. Sinon, knockdown siARN médiation est utilisée pour épuiser la sous-unité souhaitée à partir de cellules exprimant une sous-unité de INO80 étiquetée FLAG approprié (données non publiées). Enfin, pour purifier les complexes INO80 humaines, FLAG chromatographie à base d&#39;agarose 11 est utilisé pour enrichir une fraction contenant INO80-à partir d&#39;extraits nucléaires, réduisant ainsi efficacement la présence de protéines contaminantes cytosoliques dans la fraction finale contenant INO80 ou INO80 Subcomplexes purifiés.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="890">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Name of Reagent/Material</td>
			<td style="width:212px;">Company</td>
			<td style="width:147px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:173px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:212px;">Cellgro</td>
			<td style="width:147px;">10-013-CV</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamax-I (stablized glutamine)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">35050-079</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>SAFC</td>
			<td style="width:147px;">12176C</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FuGENE6 transfection reagent&#160;&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td style="width:147px;">E2312</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hygromycin B, sterile in PBS</td>
			<td>AG Scientific</td>
			<td style="width:147px;">H-1012-PBS</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pcDNA5/FRT vector</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">V6010-20</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Flp-In HEK293 cells&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">R780-07</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">pOG44 Flp-Recombinase Expression Vector</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">V600520</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZview&#160; Red ANTI-FLAG&#160; M2 Affinity Gel&#160;</td>
			<td style="width:212px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">F2426</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">calf serum</td>
			<td>SAFC</td>
			<td style="width:147px;">12138C</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TARGETplus SMARTsiRNA pool</td>
			<td>Dharmacon / Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">various</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5x siRNA resuspension buffer&#160;</td>
			<td>Dharmacon / Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">#B-002000-UB-100</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine RNAiMAX&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">13778</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Opti-MEM Reduced Serum Medium&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">51985-091</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS&#160;</td>
			<td style="width:212px;">Cellgro</td>
			<td style="width:147px;">45000</td>
			<td style="width:173px;">VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">TrypLE (trypsin)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">12604</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1x FLAG Peptide</td>
			<td style="width:212px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">F3290</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro Bio-Spin Chromatography Column</td>
			<td style="width:212px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:147px;">737-5021</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon Ultra Centrifugal Filter Device (50k MWCO)</td>
			<td style="width:212px;">Amicon</td>
			<td style="width:147px;">UFC805024&#160;</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zeba Desalting Columns&#160;</td>
			<td style="width:212px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">89882</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Anti-FLAG M2 antibody, mouse</td>
			<td style="width:212px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">F3165</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Anti-FLAG M2 antibody, rabbit</td>
			<td style="width:212px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">F7425</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:212px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">P8340</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">benzonase&#160;</td>
			<td>Novagen</td>
			<td style="width:147px;">70664</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;"></td>
			<td style="width:212px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Equipment</td>
			<td style="width:212px;">Company</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wheaton Dounce Tissue Grinders</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td style="width:147px;">06-435C&#160;</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">JS-4.2 rotor in a J6 centrifuge&#160;</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:147px;">339080</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">JA-17 rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:147px;">369691</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 ml polycarbonate tubes&#160;</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:147px;">355630</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70 ml polycarbonate bottles&#160;</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:147px;">355655</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Type 45 Ti rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:147px;">339160</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Type 70.1 Ti rotor&#160;</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:147px;">342184</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Clay Adams Nutator Mixer</td>
			<td style="width:212px;">BD Diagnostics</td>
			<td style="width:147px;">15172-203&#160;</td>
			<td style="width:173px;">VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glas-Col Tube/Vial Rotator</td>
			<td style="width:212px;">Glas-Col</td>
			<td style="width:147px;">099A RD4512</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR thermal cycler PTC 200</td>
			<td>MJ Research</td>
			<td style="width:147px;">PTC 200</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">roller bottle incubator</td>
			<td style="width:212px;">Bellco biotechnology</td>
			<td style="width:147px;">353348</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4</td>
			<td style="width:212px;">Millipore</td>
			<td style="width:147px;">IPFL07810</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">lubricated 1.5ml microcentrifuge tubes&#160;</td>
			<td style="width:212px;">Costar</td>
			<td style="width:147px;">3207</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and purification of human ino80 chromatin remodeling complexes and subcomplexes

INO80 complexes de remodelage réguler la dynamique du nucléosome et l&#39;accessibilité de l&#39;ADN en catalysant ATP-dépendant nucléosome remodelage. Complexes INO80 humaines se composent de 14 sous-unités protéiques dont Ino80, une ATPase SNF2 comme, qui sert à la fois de la sous-unité catalytique et l&#39;échafaud pour l&#39;assemblage des complexes. Fonctions des autres sous-unités et les mécanismes par lesquels ils contribuent à l&#39;activité de remodelage de la chromatine du complexe INO80 restent mal connus, en partie en raison de la difficulté de générer des sous-ensembles de INO80 dans les cellules humaines ou systèmes d&#39;expression hétérologues. Ce protocole de JOVE décrit une procédure qui permet la purification de INO80 chromatine Subcomplexes de remodelage humaines qui font défaut une sous-unité ou un sous-ensemble de sous-unités. N-terminale de l&#39;épitope FLAG Ino80 ADNc marqués de manière stable sont introduits dans le rein embryonnaire humain (HEK) 293 lignes de cellules en utilisant la recombinaison médiée par Flp. Dans le cas où un sous-ensemble des sous-unités du complexe à b est INO80e supprimé, on exprime des protéines mutantes INO80 place qui n&#39;ont pas la plate-forme nécessaire pour l&#39;assemblage de ces sous-unités. Dans le cas d&#39;une sous-unité individuelle doit être appauvri, un transfecte siRNA ciblant cette sous-unité dans une ligne HEK 293 cellules exprimant de façon stable FLAG marqués Ino80 ATPase. Des extraits nucléaires sont préparés, et FLAG immumoprécipitées d&#39;enrichir fractions protéiques contenant des dérivés de INO80. Les compositions de sous-complexes de INO80 purifiés peuvent ensuite être analysées en utilisant des méthodes telles que immunoblot, coloration à l&#39;argent, et la spectrométrie de masse. Les Subcomplexes INO80 et INO80 générés selon ce protocole peuvent être analysées en utilisant différents dosages biochimiques, qui sont décrites dans le protocole de JOVE d&#39;accompagnement. Les méthodes décrites ici peuvent être adaptées pour l&#39;étude des propriétés structurales et fonctionnelles de tout sous-unités multiples remodelage de la chromatine chez les mammifères et les complexes de modification.

La figure 1 montre un diagramme résumant les procédures utilisées pour produire, purifier et de caractériser des complexes humains de remodelage de la chromatine INO80 dépendant de l&#39;ATP. Comme illustré dans les figures 2 et 3, ces procédures permettent la génération de deux types INO80 et INO80 Subcomplexes sauvages qui manquent diverses sous-unités, permettant ainsi des analyses biochimiques ultérieures de la contribution de...

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Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes

Ce protocole décrit un procédé pour la production et la purification de type sauvage et les versions mutantes du complexe de remodelage de la chromatine humaine INO80. Marquage épitopique versions de sous-unités INO80 sont exprimés de manière stable dans des cellules HEK293, et les complexes et les complexes dépourvus complets des ensembles spécifiques de sous-unités sont purifiés par chromatographie d&#39;immuno-affinité.

Production et purification des droits de INO80 remodelage de la chromatine Complexes et Subcomplexes

INO80 chromatin remodeling complexes regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Human INO80 ...

generation-purification-human-ino80-chromatin-remodeling-complexes

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DNA and Chromosome Structure

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9.7K vues.  Stowers Institute for Medical Research.  Ce protocole décrit un procédé pour la production et la purification de type sauvage et les versions mutantes du complexe de remodelage de la chromatine humaine INO80. Marquage épitopique versions de sous-unités INO80 sont exprimés de manière stable dans des cellules HEK293, et les complexes et les complexes dépourvus complets des ensembles spécifiques de sous-unités sont purifiés par chromatographie d'immuno-affinité. 

Vidéo: Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes

Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A nucleoprotein (NP) into viral ribonulceoprotein particles (vRNPs). The influenza vRNPs are enclosed within the viral envelope. During cell entry, however, these vRNP complexes are released into the cytoplasm, where they gain access to the host nuclear transport machinery. In order to study the nuclear import of influenza vRNPs and the replication of the influenza genome, it is useful to work with isolated vRNPs so that other components of the virus do not interfere with these processes. Here, we describe a procedure to purify these vRNPs from the influenza A virus. The procedure starts with the disruption of the influenza A virion with detergents in order to release the vRNP complexes from the enveloped virion. The vRNPs are then separated from the other components of the influenza A virion on a 33-70% discontinuous glycerol gradient by velocity sedimentation. The fractions obtained from the glycerol gradient are then analyzed on via SDS-PAGE after staining with Coomassie blue. The peak fractions containing NP are then pooled together and concentrated by centrifugation. After concentration, the integrity of the vRNPs is verified by visualization of the vRNPs by transmission electron microscopy after negative staining. The glycerol gradient purification is a modification of that from Kemler et al. (1994)1, and the negative staining has been performed by Wu et al. (2007).2

The genome of the influenza A virus consists of eight separate complexes of RNA and proteins, termed viral ribonucleoprotein complexes (vRNPs). This paper describes the glycerol gradient purification and transmission electron microscopy visualization of influenza A vRNPs.

Purification et visualisation de la grippe A complexes ribonucléoprotéiques virale

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A ...

Recherche

Biologie

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of glucose monitoring and new insulin formulations, many individuals still develop devastating secondary complications. Pancreatic islet transplantation can restore near normal glucose control in diabetic patients 1, without the risk of serious hypoglycemic episodes that are associated with intensive insulin therapy. Providing sufficient islet mass is important for successful islet transplantation. However, donor characteristics, organ procurement and preservation affect the isolation outcome 2. At University of Illinois at Chicago (UIC) we developed a successful isolation protocol with an improved purification gradient 3. The program started in January 2004 and more than 300 isolations were performed up to November 2008. The pancreata were sent in cold preservation solutions (UW, University of Wisconsin or HTK, Histidine-Tryptophan Ketoglutarate) 4-7 to the Cell Isolation Laboratory at UIC for islet isolation. Pancreatic islets were isolated using the UIC method, which is a modified version of the method originally described by Ricordi et al 8. As described in Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue, human pancreas was trimmed, cannulated, perfused, and digested. After collection and at least 30 minutes of incubation in UW solution, the tissue was loaded in the cell separator (COBE 2991, Cobe, Lakewood, CO) for purification 3. Following purification, islet yield (expressed as islet equivalents, IEQ), tissue volume, and purity was determined according to standard methods 9. Isolated islets were cultured in CMRL-1066 media (Mediatech, Herndon, VA), supplemented with 1.5% human albumin, 0.1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 1 ml of Ciprofloxacin, 5 ml o f 1M HEPES, and 14.5 ml of 7.5% Sodium Bicarbonate in T175 flasks at 37&deg;C overnight culture before islets were transplanted or used for research.

Achieving high quality and appropriate quantity of human islets is one of the prominent prerequisites for successful islet transplantation. In this video, we describe step by step the procedures for human pancreatic islet isolation (part II: purification and culture of human islets) using a modified automated method.

Isolement îlots pancréatiques humaines: Partie II: Purification et culture d&#39;îlots humains

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Coloration des protéines dans les gels de Coomassie G-250, sans solvant et l&#39;acide acétique organique

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal (ICC) Network in Mice

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves required for peristalsis and mediate neuronal input from the enteric nervous system1. Different subtypes of ICC form distinct networks in the muscularis of the GI tract 2,3. Loss or injury to these networks is associated with a number of motility disorders4. ICC cells express the KIT receptor tyrosine kinase on the plasma membrane and KIT immunostaining has been used for the past 15 years to label the ICC network5,6. Importantly, normal KIT activity is required for ICC development5,6. Neoplastic transformation of ICC cells results in gastrointestinal stromal tumor (GIST), that frequently harbor gain-of-function KIT mutations7,8. We recently showed that ETV1 is a lineage-specific survival factor expressed in the ICC/GIST lineage and is a master transcriptional regulator required for both normal ICC network formation and for of GIST tumorigenesis9. We further demonstrate that it cooperates with activating KIT mutations in tumorigenesis. Here, we describe methods for visualization of ICC networks in mice, largely based on previously published protocols10,11. More recently, the chloride channel anoctamin 1 (ANO1) has also been characterized as a specific membrane marker of ICC11,12. Because of their plasma membrane localization, immunofluorescence of both proteins can be used to visualize the ICC networks. Here, we describe visualization of the ICC networks by fixed-frozen cyrosections and whole mount preparations.

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal ICC Network in Mice

The interstitial cells of Cajal (ICC) are the pacemaker cells of the gastrointestinal (GI) tract. They form complex networks between smooth muscle cells and post-ganglionic neuronal fibers to regulate GI contractility. Here, we present immunofluorescence methods cross-sectional and whole-mount visualization of murine ICC networks.

Visualisation des cellules interstitielles de Cajal (CIC) Réseau Souris

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves ...

Preparation, Purification, and Characterization of Lanthanide Complexes for Use as Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging

Polyaminopolycarboxylate-based ligands are commonly used to chelate lanthanide ions, and the resulting complexes are 
useful as contrast agents for magnetic resonance imaging (MRI). Many commercially available ligands are especially useful because they contain 
functional groups that allow for fast, high-purity, and high-yielding conjugation to macromolecules and biomolecules via amine-reactive 
activated esters and isothiocyanate groups or thiol-reactive maleimides. While metalation of these ligands is considered common 
knowledge in the field of bioconjugation chemistry, subtle differences in metalation procedures must be taken into account when 
selecting metal starting materials. Furthermore, multiple options for purification and characterization exist, and selection of the most 
effective procedure partially depends on the selection of starting materials. These subtle differences are often neglected in published 
protocols. Here, our goal is to demonstrate common methods for metalation, purification, and characterization of lanthanide complexes 
that can be used as contrast agents for MRI (Figure 1). We expect that this publication will enable biomedical scientists to incorporate 
lanthanide complexation reactions into their repertoire of commonly used reactions by easing the selection of starting materials and 
purification methods.

We demonstrate the metalation, purification, and characterization of lanthanide complexes. The complexes described here can be conjugated to macromolecules to enable tracking of these molecules using magnetic resonance imaging.

Préparation, la purification et la caractérisation des complexes de lanthanides pour utilisation comme agents de contraste pour imagerie par résonance magnétique

Polyaminopolycarboxylate-based ligands are commonly used to chelate lanthanide ions, and the resulting complexes are 
useful as contrast agents for ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

Isolement de la chromatine par purification d&#39;ARN (CHIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species

Protein aggregation is seen as a general hallmark of chronic, degenerative brain conditions like, for example, in the neurodegenerative diseases Alzheimer's disease (A&beta;, tau), Parkinson's Disease (&alpha;-synuclein), Huntington's disease (polyglutamine, huntingtin), and others. Protein aggregation is thought to occur due to disturbed proteostasis, i.e. the imbalance between the arising and degradation of misfolded proteins. Of note, the same proteins are found aggregated in sporadic forms of these diseases that are mutant in rare variants of familial forms.
Schizophrenia is a chronic progressive brain condition that in many cases goes along with a permanent and irreversible cognitive deficit. In a candidate gene approach, we investigated whether Disrupted-in-schizophrenia 1 (DISC1), a gene cloned in a Scottish family with linkage to chronic mental disease1, 2, could be found as insoluble aggregates in the brain of sporadic cases of schizophrenia3. Using the SMRI CC, we identified in approximately 20 % of cases with CMD but not normal controls or patients with neurodegenerative diseases sarkosyl-insoluble DISC1 immunoreactivity after biochemical fractionation. Subsequent studies in vitro revealed that the aggregation propensity of DISC1 was influenced by disease-associated polymorphism S704C4, and that DISC1 aggresomes generated in vitro were cell-invasive5, similar to what had been shown for A&beta;6, tau7-9, &alpha;-synuclein10, polyglutamine11, or SOD1 aggregates12. These findings prompted us to propose that at least a subset of cases with CMD, those with aggregated DISC1 might be protein conformational disorders.
 Here we describe how we generate DISC1 aggresomes in mammalian cells, purify them on a sucrose gradient and use them for cell-invasiveness studies. Similarly, we describe how we generate an exclusively multimeric C-terminal DISC1 fragment, label and purify it for cell invasiveness studies. Using the recombinant multimers of DISC1 we achieve similar cell invasiveness as for a similarly labeled synthetic &alpha;-synuclein fragment. We also show that this fragment is taken up in vivo when stereotactically injected into the brain of recipient animals.

The generation, purification and cell invasion of intracellular, cytoplasmic full length DISC1 protein aggresomes from cell cultures and of a labeled, multimeric recombinant DISC1 protein fragment in E. coli are described. Cell invasiveness is shown for recipient cells in cell culture and for neurons in vivo after stereotactical brain inoculation.

Production, de conditionnement, et la caractérisation des cellules invasives Espèces protéine DISC1

Protein aggregation is seen as a general hallmark of chronic, degenerative brain conditions like, for example, in the neurodegenerative diseases ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation (ChIP) and massively parallel sequencing can be utilized to identify the repertoire of mammalian DNA sequences bound by transcription factors in vivo. "Next-generation" genome sequencing technologies provide 1-2 orders of magnitude increase in the amount of sequence that can be cost-effectively generated over older technologies thus allowing for ChIP-seq methods to directly provide whole-genome coverage for effective profiling of mammalian protein-DNA interactions.
For successful ChIP-seq approaches, one must generate high quality ChIP DNA template to obtain the best sequencing outcomes. The description is based around experience with the protein product of the gene most strongly implicated in the pathogenesis of type 2 diabetes, namely the transcription factor transcription factor 7-like 2 (TCF7L2). This factor has also been implicated in various cancers.
Outlined is how to generate high quality ChIP DNA template derived from the colorectal carcinoma cell line, HCT116, in order to build a high-resolution map through sequencing to determine the genes bound by TCF7L2, giving further insight in to its key role in the pathogenesis of complex traits.

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

The combination of chromatin immunoprecipitation and ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) can identify and map protein-DNA interactions in a given tissue or cell line. Outlined is how to generate a high quality ChIP template for subsequent sequencing, using experience with the transcription factor TCF7L2 as an example.

Génération de haute qualité Immunoprécipitation de la chromatine Patron de l&#39;ADN pour le séquençage à haut débit (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and the control of gene transcription in the cell nucleus. The kindlins are ~75 kDa multidomain proteins and bind to an NPxY motif and upstream T/S cluster of the integrin &#946;-subunit cytoplasmic tail. The hematopoietically-important kindlin isoform, kindlin-3, is critical for platelet aggregation during thrombus formation, leukocyte rolling in response to infection and inflammation and osteoclast podocyte formation in bone resorption. Kindlin-3&#39;s role in these processes has resulted in extensive cellular and physiological studies. However, there is a need for an efficient method of acquiring high quality milligram quantities of the protein for further studies. We have developed a protocol, here described, for the efficient expression and purification of recombinant murine kindlin-3 by use of a baculovirus-driven expression system in Sf9 cells yielding sufficient amounts of high purity full-length protein to allow its biophysical characterization. The same approach could be taken in the study of the other mammalian kindlin isoforms.

Kindlins are fundamental to cell adhesion through integrins but studies of them have been hampered by the difficulty encountered in expressing them recombinantly in bacterial hosts. We describe here methods for their efficient production in baculovirus-infected insect cells.

La production efficace et purification de recombinant murin Kindlin-3 à partir de cellules d&#39;insectes pour les études biophysiques

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Biochemical Assays for Analyzing Activities of ATP-dependent Chromatin Remodeling Enzymes

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Biochemically dissecting the contributions of individual subunits of such complexes to the multi-step ATP-dependent chromatin remodeling reaction requires the use of assays that monitor the production of reaction products and measure the formation of reaction intermediates. This JOVE protocol describes assays that allow one to measure the biochemical activities of chromatin remodeling complexes or subcomplexes containing various combinations of subunits. Chromatin remodeling is measured using an ATP-dependent nucleosome sliding assay, which monitors the movement of a nucleosome on a DNA molecule using an electrophoretic mobility shift assay (EMSA)-based method. Nucleosome binding activity is measured by monitoring the formation of remodeling complex-bound mononucleosomes using a similar EMSA-based method, and DNA- or nucleosome-dependent ATPase activity is assayed using thin layer chromatography (TLC) to measure the rate of conversion of ATP to ADP and phosphate in the presence of either DNA or nucleosomes. Using these assays, one can examine the functions of subunits of a chromatin remodeling complex by comparing the activities of the complete complex to those lacking one or more subunits. The human INO80 chromatin remodeling complex is used as an example; however, the methods described here can be adapted to the study of other chromatin remodeling complexes.

Here we describe biochemical assays that can be used to characterize ATP-dependent chromatin remodeling enzymes for their abilities to 1) catalyze ATP-dependent nucleosome sliding, 2) engage with nucleosome substrates, and 3) hydrolyze ATP in a nucleosome- or DNA-dependent manner.

Les dosages biochimiques pour l&#39;analyse des activités de l&#39;ATP-dépendant remodelage de la chromatine enzymes

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and ...