Soutenu par un sous-projet du NIH P20 RR16440 et une subvention du pont de l&#39;Office West Virginia University de la recherche et aux études supérieures aux mauvaises herbes S.. L&#39;assistance technique de L. Lopez-Skinner pendant les premières phases de développement du projet est grandement appréciée. Les auteurs sont également reconnaissants pour l&#39;assistance technique et OSC19 cellules de J. Myers et M. Younes (département de chirurgie de la tête et du cou, du MD Anderson Cancer Center, Houston, TX); P. Turner et K. Secrest (West Virginia University Département de Banque de tissus de pathologie) pour le traitement histologique et des procédures, R. Wysolmerski (West Virginia University, département de neurobiologie et d&#39;anatomie) pour la construction LifeAct-mCherry et J. Bear (Université de Caroline du Nord) pour le vecteur lentiviral pLL7.0. L&#39;utilisation de la facilité de la West Virginia University Imaging Microscopy (soutenu par NIH et le P20 RR16440 Mary Babb Randolph Cancer Center) et ses non-linéaire laboratoire de microscopie optique (NLOM; soutenu par une collaboration entre le Centre West Virginia University for Neuroscience et l&#39;Université West Virginia Department of Physics / West Virginia Nanoscience Initiative) est également appréciée. Le NLOM est soutenu en partie par NIH P30 RR031155 le Center for Neuroscience.

1. Lignées cellulaires, Vector Construction et Production lentiviraux <ol><li> La tête et le cou de l&#39;homme les cellules tumorales lignes (ou OSC19 UMSCC1) ont été cultivées en milieu complet constitué de DMEM (chat Cellgro # 50-003-PB) complété avec 10% de FBS sérum bovin foetal (Hyclone chat # SH30070.03), 1% de pénicilline / streptomycine (chat Cellgro N ° 30-002-CI), et 1% de non-acides aminés essentiels (chat Cellgro n ° 25-025-CI). </li><li> Pour transférer la séquence de codage LifeAct-mCherry dans le vecteur lentiviral pLL7.0, le site de reconnaissance dans le Sbf1 mCherry parent d&#39;ADNc a été modifié en introduisant trois mutations silencieuses dans la séquence de reconnaissance en utilisant la mutagenèse dirigée (chat Stratagene # 200518-5). Le résultant modifiés LifeAct-mCherry séquence a ensuite été amplifié par PCR flanquant EcoR1/Sbf1 sites et sous-cloné dans pLL7.0 de générer la construction pLL7.0-LifeAct-mCherry. </li></ol> 2. La production de virus pLL7.0-LifeAct-mCherry <ol><li> Production virale a été réalisée selon l&#39;expression lentiviraux systèmes manuels (version du système Bioscience 2-051018). </li><li> La lignée cellulaire d&#39;emballage 293T/17 cellules (chat ATCC # CRL-11268) a été cultivées jusqu&#39;à confluence de 40% dans le même support complet utilisé pour les lignes CETC. </li><li> Les cellules ont été transfectées avec le pLL7.0-LifeAct-mCherry, psPAX2 et pVSV-G des vecteurs dans un rapport 3:2:1, respectivement en utilisant Calphos (cat # 631312 Clontech). </li><li> Après 24 heures, les médias initial de la transfection a été remplacé par du milieu frais. </li><li> Médias a ensuite été recueilli et reconstitué tous les 12 heures pendant 72 heures et conservés à 4 ° C. </li></ol> 3. Production de la tête et du cou avec des lignées cellulaires stables LifeAct-mCherry Expression <ol><li> Les médias collectées a été centrifugé à 2000 rpm pendant 10 minutes à 4 ° C. </li><li> Un ml de milieu contenant le virus a été clarifiée directement ajouté au OSC19 ou UMSCC1 cellules pendant 12 heures. Les cellules ont ensuite été rincés, et ajoutant un ml de virus a été ajouté pour une autre période de 12 heures. </li><li> Les cellules ont été traitées avec un milieu contenant 200mg/ml puromycine pendant deux semaines pour sélectionner les colonies résistantes. </li><li> Clones survivants ont été examinés visuellement pour LifeAct-mCherry expression par microscopie à fluorescence. Individuels colonies positives ont été typsinized utilisant le clonage de disques stériles 3mm (chat Fisher # 0790710A). </li><li> Cellules positives ont été maintenues dans les milieux contenant la puromycine 200mg/ml jusqu&#39;au congelés dos ou utilisés pour l&#39;injection orthotopique. </li></ol> 4. Orthotopique formation de xénogreffes de tumeurs <ol><li> Toutes les procédures d&#39;animaux ont été menées conformément à un protocole (09-0821) approuvé par les soins de West Virginia University et animale Comité utilisation. </li><li> LifeAct-mCherry cellules tumorales exprimant ont été trypsinées, centrifugé et 2,5 x 10 4 cellules ont été remises en suspension dans 50 pl média complet. </li><li> Les cellules tumorales ont été chargés dans une seringue d&#39;un ml attaché à une aiguille de calibre 27 ½. </li><li> Femme athymiques fox1 souris nu / nu 8 semaines d&#39;âge (Harlan Laboratories) ont été anesthésiés avec combinaison de kétamine et de xylazine 80mg/kg 10mg/kg. Souris anesthésiées ont été maintenus entre 37-40 ° C sur un coussin chauffant. </li><li> En utilisant une pince stérile, le bout de la langue a été doucement et soigneusement compris sorti de la cavité buccale. </li><li> Les cellules ont été injecté lentement dans un côté de chaque langue pour créer une masse bulbeuse dans le centre de langue, en évitant les artères linguales. </li><li> Les souris ont été injectées à la yohimbine 2.1mg/kg et retourné au coussin chauffant, où ils ont été suivis pendant 2-3 heures pendant la récupération de l&#39;anesthésie. </li><li> Une fois relancé, les souris ont été placées dans des cages stériles contenant une alimentation transgénique pâte molle (chat Bioserve # S3472). </li><li> Les souris ont été pesés tous les 2-3 jours et surveillés visuellement pour l&#39;apparition de tumeurs. </li></ol> 5. Préparation de la souris pour Tongues Ex-imagerie in vivo <ol><li> Souris hébergeant des tumeurs à différents moments (habituellement 2-4 semaines après l&#39;injection) ont été euthanasiés par inhalation de dioxyde de carbone. </li><li> Tongues ont été extraits, rincés avec du PBS 1X et attaché à un côté d&#39;une cassette inclusion dans la paraffine des tissus classiques (Cat # StatLab H104), en utilisant les fils à coudre à partir d&#39;un monofilament de magasin de modélisme local et une aiguille à coudre de taille 8. </li><li> Une fois que les langues ont été immobilisés, l&#39;assemblée entière était placée cassettes dans une boîte de culture tissulaire de 30 mm et plongés dans du PBS 1X. </li><li> Langues ont été immédiatement transformés utilisés pour la microscopie à deux photons d&#39;excitation. </li></ol> 6. Imagerie des tumeurs Langue avec microscopie à deux photons <ol><li> Langue cassettes ont été submergés dans un plat contenant du PBS 1X 60mm fixée dans un support sur mesure conçus sur un bras cantilever rétractable (Chambre navette, Siskiyou instruments) placé sous l&#39;objectif d&#39;un microscope droit (Microscope mobiles (MOM); Instruments Sutter). </li><li> Une eau 40X/0.8NA lentille d&#39;objectif trempage a été placé directement sur ou au-dessus de Tum visiblesou des lésions. Tongues ont été imagées par microscopie à deux photons avec le Ti: saphir laser (Mira, cohérent) d&#39;intensité à 60 mW et longueur d&#39;onde de 755 nm d&#39;entrée pour optimiser le signal mCherry. </li><li> Serial images 1mm balayage laser ont été recueillies à une profondeur um incrémentale sur une profondeur totale de tissu entre 15 et 100 um (selon le volume de la tumeur). Les images ont été capturées à l&#39;aide scanimage, un programme open source basé sur la plateforme de MATLAB qui a été développé par le laboratoire Karel Svoboda (Janelia Farms, HHMI). Scanimage génère une sortie à deux canaux de modèles balayage de trame pour contrôler le X / Y galvanométrique des miroirs de balayage, et en même temps, capte un signal d&#39;entrée maximale de quatre canaux simultanément à partir de tubes photomultiplicateurs (PMT) à travers un conseil d&#39;administration d&#39;acquisition de données (PCI-6610S , National Instruments). Le PMT signaux sont amplifiés par des préamplificateurs à faible bruit courant (SR570, Stanford Research System) avant d&#39;alimenter la carte NI-DAQ pour l&#39;affichage sur l&#39;écran du moniteur. Scanimage recueille z-stack images en contrôlant l&#39;axe z de l&#39;objectif et recueille time-lapse images dans un mode unique ou à vélo. Les images ont été enregistrées dans un seul fichier TIFF avec une profondeur de 16 bits. </li></ol> 7. Analyse d&#39;images à l&#39;aide du logiciel Amira <ol><li> Amira imagerie pour la quantification des tumeurs: Dans le logiciel Aimra, ouvrez le fichier TIFF contenant l&#39;ensemble des z-stack images. </li><li> Sélectionnez le nom du fichier, sélectionner et appliquer la fonction Voltex pour générer un rendu en trois dimensions. Une grande image principale tumeur avec plusieurs petits groupes dissociés invasives (IG) des cellules envahies collectivement est généralement apparente dans l&#39;image rendue (voir figure 6A). </li><li> Pour sélectionner la masse tumorale primaire, sélectionnez «Open Data», puis «Etiquetage», puis «Champ Label&quot;. </li><li> Seuillage des primaires de tumeurs sélectionner toutes les images Z-stack et faire défiler les images dans le plan z pour assurer l&#39;inclusion de seulement la masse tumorale primaire dans les trois dimensions. Cela est généralement le plus grand image de taille dans le domaine et apparaît souvent comme la segmentation imagé est traversée par le plan z. </li><li> Utilisez la baguette magique / seuil fonction pour corriger la fluorescence de fond et l&#39;éliminer de l&#39;image sans jeter tout du signal tumeur. Mettez en surbrillance le &quot;fichier à l&#39;intérieur&quot; étiquette et cliquez sur le bouton ⊕. Cochez la case &quot;Toutes les tranches« chèque. Cela produit une bordure de couleur autour de la zone de la tumeur primaire seuillée chaque incrément z-stack. </li><li> Pour sélectionner les GI, choisissez &quot;Nouveau&quot; fonction. Sélectionnez une seule IG et s&#39;assurer qu&#39;il n&#39;est pas associé à la tumeur primaire en faisant défiler le plan z. </li><li> Sélectionnez &quot;Toutes les tranches&quot; et cliquez sur le bouton ⊕. Renommez le fichier (ex: IG 1) </li><li> Répétez la procédure de seuillage en 7.4 et l&#39;étape en soulignant en 7.5 pour l&#39;IG déterminée. Sélectionnez une couleur de contour différent de la couleur utilisée pour désigner la masse tumorale primaire. </li><li> Répéter au besoin pour chaque tranche supplémentaire IG à travers l&#39;image, la numérisation à travers le plan z pour s&#39;assurer que tous les GI sont notées. En utilisant des couleurs différentes pour chacune identifiée aides IG dans l&#39;identification des futures sur l&#39;image. </li><li> Une fois la tumeur primaire et tous les GIs sont sélectionnées, choisissez «segmentation» dans le menu déroulant, puis sélectionnez &quot;Statistiques des matériaux&quot;. Cela donne la mesure du volume ainsi que les X, Y et le noyau tumoral coordonnées X de la tumeur primaire afin de calculer les distances des GIs à partir du point central de la tumeur. </li><li> Avec les volumes calculés, déterminer la distance pour chaque IG à partir du noyau central de la tumeur primaire. Sélectionnez &quot;segmentation&quot;, puis &quot;Statistiques matériel». Cette étape calcule toutes les mesures en pixels. Convertir pixels en micromètres basée sur l&#39;étalonnage de l&#39;objectif du microscope et de toute augmentation supplémentaire de grossissement (ie, les fonctions de zoom). Pour le microscope et les paramètres utilisés dans ces expériences, l&#39;objectif 40X a été utilisé sans zoom, donnant un étalonnage de 1 pixel = 0,298 um. Importer des données dans un tableur Excel, ce qui donne des paramètres pour la tumeur primaire en trois dimensions (X1, Y1, Z1) et pour chaque IG (ex: X2, Y2, Z2 pour la première IG). </li><li> La distance a envahi en microns pour chaque IG du centre de la tumeur primaire est calculé selon la formule √ ((X2-X1) 2 + (Y2-Y1) 2 + (Z2-Z1) 2). </li><li> L&#39;indice des tumeurs invasives (T I) est calculé selon la formule T = I N T x V T x D T, où T = N le nombre total de GI dans l&#39;image, V T = le volume total de tous les GI, D T = distance totale parcourue de tous les groupes invasif du centre de la tumeur primaire. </li></ol> 8. Trois dimensions des rendus avec Nikon NIS-Elements Software <ol><li> Trois dimensions avec des rendus plus détails topographiques peuvent être générés par l&#39;importation de l&#39;original 16-bit monochrome fichiers TIFF de l&#39;image dans la tumeur entière Nikon NIS-Elementspaquet (Nikon, Melville, NY). Choisissez &quot;Fichier&quot;, puis &quot;ND&quot;, puis &quot;Créer un fichier ND de la séquence de fichier&quot;. Sélectionnez la pile image TIFF série Z et spécifier la taille étape appropriée. </li><li> Calibrer le document ND dans le plan xy. Indiquez la taille d&#39;un pixel à l&#39;aide d&#39;un calibrage manuel. </li><li> Choisissez l&#39;option &quot;Afficher Volume&quot;. Utilisez le &quot;QG&quot; de fonction pour calculer les tranches supplémentaires dans le plan z pour une qualité supérieure. Dans les &quot;Paramètres de rendu 3D&quot;, utilisez le bouton &quot;Avancé Renderer&quot; avec une qualité de &quot;Ultra high details&quot; et &quot;pleine résolution&quot;. Choisissez &quot;Alpha Blending&quot; pour accentuer les surfaces tumeur. </li><li> Optimiser l&#39;image en trois dimensions pour la présentation. Zoom sur la tumeur et l&#39;IGS et des cultures associées en tant que de besoin. Faites pivoter l&#39;image dans les plans xyz et ajuster la LUT. </li><li> Capturer l&#39;image pour la présentation. Sélectionnez &quot;Edition-Créer Snapshot View (8 bits RVB)&quot;. Nommez et enregistrez le fichier en conséquence. </li></ol> 9. Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Schématique globale illustrant des étapes clé dans la production de tumeurs langue orthotopique et in situ deux imagerie photonique. <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Injection de LifeAct-mCherry exprimer OSC19 cellules dans la langue de la souris. <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3 Langue résection tumorale de souris contenant préparés pour deux d&#39;imagerie photonique. <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. Orientation d&#39;une languette de tumeurs contenant en position sur un microscope à deux photons prêt pour l&#39;imagerie. <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig5.jpg" alt="Figure 5" /> Figure 5. Écran représentant tir de scanimage démontrant l&#39;acquisition des données brutes de l&#39;initiale de deux photons de l&#39;image. <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig6.jpg" alt="Figure 6" /> Figure 6. L&#39;analyse d&#39;image et de quantification de l&#39;invasion tumorale dans une tumeur OSC19 orthotopique. Représentant des images capture d&#39;écran de Amira Voltex rendu (A) et un seul seuillée z-section (B) avec la tumeur primaire primaires décrits dans le pourpre, le groupe invasif 1 (IG-1) en bleu, IG-2 décrites dans le rouge et l&#39;IG -3 contour vert comme un exemple de la procédure d&#39;identification. Pointes de flèches dénotent LDI en (A) et (B). Parcelles C du volume par rapport a envahi la distance de huit GI individuels utilisés pour calculer l&#39;indice de l&#39;invasion tumorale (Ti). <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig7.jpg" alt="Figure 7" /> Images représentant la figure 7. Des tumeurs et des groupes de tumeurs ont envahi à partir de ce protocole par rapport aux images d&#39;une approche conventionnelle IHC. Paraffine section A. d&#39;une languette de souris toute hébergeant une tumeur UMSCC1 orthotopique. La coloration immunohistochimique a été réalisée en utilisant des procédures classiques avec un anticorps primaire contre les CETC marqueur spécifique des cellules EMMPRIN (Zymed; cat # 34-5600) à 1:1000 dilution et visualisé en utilisant le DAB OmniMap anti-Rb kit de détection (Ventana cat # 760 -149), suivi par le fer hématoxyline coloration. Images de la zone englobant la langue total ont été recueillis individuellement à un grossissement de 4x sur un microscope Olympus ZX70 Provis avec une caméra CCD Optronics MicroFire et reconstruite en utilisant le paquet d&#39;imagerie StereoINvestigator (Bioscience MBF). La tumeur est évident à la pointe de la langue. Une région agrandie montrant l&#39;avant invasive et individuels des groupes de cellules tumorales (flèches) est montré dans (B). C. Nikon NIS-Elements de rendu d&#39;une tumeur OSC19 représentant. Détails contours améliorée et la visualisation claire des IGS (flèches) est évidente. Bars à toutes les images = 100 um.

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Des modèles de souris orthotopique sont révélés utiles pour étudier de nombreux aspects de la tête et du cou 1,2. Nous avons combiné un système bien établi orthotopique du SCOT 3 avec imagerie par microscopie à deux photons de cellules mCherry-étiqueté comme un système pour étudier les événements précoces de la tête et l&#39;invasion des cellules tumorales du cou. Dans cette procédure, nous avons noté que les cellules peuvent s&#39;échapper du site de l&#39;injection de tumeurs, en particulier dans des souris de six semaines ou plus jeune en raison de la taille insuffisante la langue. Nous utilisons des souris plus âgées afin d&#39;éviter ce problème. La grande taille de la langue avec les souris plus âgées contribue également à éviter la rupture d&#39;une artère linguale et l&#39;hémorragie excessive de la langue. Prendre la tumeur est grandement améliorée quand la langue enfle considérablement sur le site de l&#39;injection initiale. Ce gonflement disparaît dans les une à deux heures que le fluide injecté est absorbé. La croissance tumorale semble évident de une à deux semaines après l&#39;injection avec le nombre de cellules injectées indiqué comme une petite bosse blanche sur la surface de la langue. Nous notons également que l&#39;objectif 40X utilisés dans nos études présentées ici, nous ne pouvons pas distinguer les cellules tumorales individuelles mais ne identifier les GIs que des amas de cellules envahissantes qui récapitulent le mode typique de l&#39;invasion CETC. À ce jour, ce modèle a été largement utilisée pour tester le rôle de molécules spécifiques, ainsi que plusieurs médicaments anti-tumoraux sur la croissance SCOT une invasion, avec une efficacité mesurée par métastases ganglionnaires cervicales surveillée en utilisant des méthodes IHC ou bioluminescentes 4-7. Tumeurs formées dans ce système de se manifester à proximité de la surface de la langue (Figure 7), permettant l&#39;application de la microscopie à deux photons pour les tumeurs in situ image entière comme envahissantes multi-cellulaires grappes. La procédure peut également être utilisé pour visualiser l&#39;invasion tumorale avec une résolution cellulaire. Microscopie à deux photons a déjà été utilisé pour étudier les traitements expérimentaux pour cancer tête et cou dans 8,9 orthotopique et xénogreffe 8,10 modèles. Cependant, il ya deux différences majeures entre ces rapports et notre protocole. Premièrement, ces études utilisent des étiquettes extracellulaire de cibler / identifier la tête et du cou cellules tumorales, éventuellement en limitant uniquement à la détection des cellules tumorales avec un large accès à la circulation. Deuxièmement, l&#39;invasion des cellules tumorales à proximité du site principal qui récapitule l&#39;activité susceptible début métastatique n&#39;a pas été évalué comme un paramètre expérimental. Notre protocole permet de quantifier directement l&#39;invasion des cellules tumorales à tout moment pendant la progression tumorale dans les langues de la souris. Alors que la méthode décrite ici décrit la procédure à l&#39;aide langues disséqués, nous sommes actuellement en train d&#39;adapter cette méthode à l&#39;invasion tumorale chez la souris l&#39;image en direct pour une utilisation en combinaison avec la bioluminescence de surveiller simultanément l&#39;invasion précoce locale des ganglions lymphatiques et métastases à distance dans le même animal. Modifications du protocole pour l&#39;imagerie in vivo nécessitent la conception d&#39;un stade approprié pour le positionnement et le maintien des souris lors de l&#39;imagerie, ainsi que d&#39;un système pratique pour bien irriguer la cavité buccale des souris anesthésiées pendant la procédure d&#39;imagerie. Une fois optimisé, ces adaptations offrira la possibilité d&#39;étudier le rôle du potentiel pro-invasif molécules et les tests anti-invasive composés sur l&#39;invasion locale et plus éloignés des métastases chez des animaux sur de longues périodes.

multi-photon imaging of tumor cell invasion in an orthotopic mouse model of oral squamous cell carcinoma

Loco-régionale invasion de la tête et du cou est liée à un risque métastatique et présente un défi difficile à relever dans la conception et la mise en œuvre des stratégies de gestion des patients. Des modèles de souris orthotopique de cancer par voie orale ont été développés pour faciliter l&#39;étude des facteurs que l&#39;invasion de l&#39;impact et de servir comme système modèle pour évaluer la thérapeutique anti-tumorale. Dans ces systèmes, la visualisation des cellules tumorales disséminées dans les tissus cavité buccale a généralement été menée soit par histologie conventionnelle ou avec des méthodes bioluminescentes vivo. Un inconvénient majeur de ces techniques est l&#39;incapacité inhérente à visualiser et de quantifier précisément au début d&#39;invasion des cellules tumorales provenant du site primaire en trois dimensions. Nous décrivons ici un protocole qui associe un modèle établi pour carcinome épidermoïde de la langue (SCOT) avec l&#39;imagerie à deux photons pour permettre multi-vectorielle de visualisation de la propagation des tumeurs linguales. La CVMO-19 la tête et du cou lignée cellulaire tumorale a été stable pour exprimer l&#39;LifeAct F-actine de liaison peptidique fusionnée à la protéine fluorescente mCherry (LifeAct-mCherry). Fox1 souris nu / nu injecté ces cellules de manière fiable former des tumeurs qui permettent la langue pour être visualisé par l&#39;ex-vivo application de microscopie à deux photons. Cette technique permet la visualisation orthotopique de la masse tumorale et localement envahir les cellules en langues excisée sans perturbation du microenvironnement tumoral régional. En outre, ce système permet la quantification de l&#39;invasion des cellules tumorales par le calcul de distances qui ont envahi déplacer des cellules à partir du site primaire tumeur. Globalement, cette procédure prévoit un système modèle amélioré d&#39;analyse des facteurs qui contribuent à l&#39;invasion SCOT et des traitements thérapeutiques adaptés pour prévenir l&#39;invasion locale et distante dissémination métastatique. Cette méthode a également le potentiel pour être couplée éventuellement à d&#39;autres modalités d&#39;imagerie dans un dans la mise en vivo.

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Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Un aperçu complet des techniques impliquées dans la génération d&#39;un modèle murin de cancer de la bouche et le suivi quantitatif de l&#39;invasion tumorale au sein de la langue grâce à la microscopie multi-photons de cellules marquées est présenté. Ce système peut servir de plate-forme utile pour l&#39;évaluation de l&#39;efficacité des médicaments moléculaires et des composés anti-invasive.

Multi-photon imagerie de l&#39;invasion des cellules tumorales dans un modèle de souris orthotopique du carcinome épidermoïde oral

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

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Research

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Medicine

18.9K vues.  Mary Babb Randolph Cancer Center, West Virginia University. Un aperçu complet des techniques impliquées dans la génération d'un modèle murin de cancer de la bouche et le suivi quantitatif de l'invasion tumorale au sein de la langue grâce à la microscopie multi-photons de cellules marquées est présenté. Ce système peut servir de plate-forme utile pour l'évaluation de l'efficacité des médicaments moléculaires et des composés anti-invasive.

Vidéo: Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

An Orthotopic Model of Murine Bladder Cancer

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and subsequent cell adhesion. After their bladders are transurethrally catheterized and drained, animals are again catheterized to permit insertion of a platinum wire into bladders without damaging the urethra or bladder. The catheters are made of Teflon to serve as an insulator for the wire, which will conduct electrical current into the bladder to create a burn injury. An electrocautery unit is used to deliver 2.5W to the exposed end of the wire, burning away extracellular layers and providing attachment sites for carcinoma cells that are delivered in suspension to the bladder through a subsequent catheterization. Cells remain in the bladder for 90 minutes, after which the catheters are removed and the bladders allowed to drain naturally. The development of tumor is monitored via ultrasound. Specific attention is paid to the catheterization technique in the accompanying video.

Bladder tumors are established in female mice in a minimally invasive fashion through catheterization, local cauterization, and subsequent adhesion of carcinoma cells to the burn sites.

Un modèle orthotopique de cancer de la vessie murin

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and ...

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Combination Radiotherapy in an Orthotopic Mouse Brain Tumor Model

Glioblastoma multiforme (GBM) are the most common and aggressive adult primary brain tumors1. In recent years there has been substantial progress in the understanding of the mechanics of tumor invasion, and direct intracerebral inoculation of tumor provides the opportunity of observing the invasive process in a physiologically appropriate environment2. As far as human brain tumors are concerned, the orthotopic models currently available are established either by stereotaxic injection of cell suspensions or implantation of a solid piece of tumor through a complicated craniotomy procedure3. In our technique we harvest cells from tissue culture to create a cell suspension used to implant directly into the brain. The duration of the surgery is approximately 30 minutes, and as the mouse needs to be in a constant surgical plane, an injectable anesthetic is used. The mouse is placed in a stereotaxic jig made by Stoetling (figure 1). After the surgical area is cleaned and prepared, an incision is made; and the bregma is located to determine the location of the craniotomy. The location of the craniotomy is 2 mm to the right and 1 mm rostral to the bregma. The depth is 3 mm from the surface of the skull, and cells are injected at a rate of 2 &mu;l every 2 minutes. The skin is sutured with 5-0 PDS, and the mouse is allowed to wake up on a heating pad. From our experience, depending on the cell line, treatment can take place from 7-10 days after surgery. Drug delivery is dependent on the drug composition. For radiation treatment the mice are anesthetized, and put into a custom made jig. Lead covers the mouse's body and exposes only the brain of the mouse. The study of tumorigenesis and the evaluation of new therapies for GBM require accurate and reproducible brain tumor animal models. Thus we use this orthotopic brain model to study the interaction of the microenvironment of the brain and the tumor, to test the effectiveness of different therapeutic agents with and without radiation.

The purpose of this article is to describe the use of an orthotopic glioblastoma model for chemoradiation studies. This article will go though cell processing, implanting, and radiotherapy of the mouse using an intracranial model.

La radiothérapie combinée à un modèle de tumeur de cerveau de souris orthotopique

Glioblastoma multiforme (GBM) are the most common and aggressive adult primary brain tumors1. In recent years there has been substantial progress in the ...

Modeling and Imaging 3-Dimensional Collective Cell Invasion

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy tissue is the root cause of disease and death. For other cancers (e.g. breast, lung, etc.), it is the process of metastasis, in which tumor cells move from a primary tumor mass, colonize distal sites and ultimately contribute to organ failure, that eventually leads to morbidity and mortality 3. It has been estimated that invasion and metastasis are responsible for 90&#37; of cancer deaths 4. As a result, there has been intense interest in identifying the molecular processes and critical protein mediators of invasion and metastasis for the purposes of improving diagnosis and treatment 5.
A challenge for cancer scientists is to develop invasion assays that sufficiently resemble the in vivo situation to enable accurate disease modeling 6. Two-dimensional cell motility assays are only informative about one aspect of invasion and do not take into account extracellular matrix (ECM) protein remodeling which is also a critical element. Recently, research has refined our understanding of tumor cell invasion and revealed that individual cells may move by elongated or rounded modes 7. In addition, there has been greater appreciation of the contribution of collective invasion, in which cells invade in strands, sheets and clusters, particularly in highly differentiated tumors that maintain epithelial characteristics, to the spread of cancer 8.
We present a refined method 9 for examining the contributions of candidate proteins to collective invasion 10. In particular, by engineering separate pools of cells to express different fluorescent proteins, it is possible to molecularly dissect the activities and proteins required in leading cells versus those required in following cells. The use of RNAi provides the molecular tool to experimentally disassemble the processes involved in individual cell invasion as well as in different positions of collective invasion. In this procedure, mixtures of fluorescently-labeled cells are plated on the bottom of a Transwell insert previously filled with Matrigel ECM protein, then allowed to invade "upwards" through the filter and into the Matrigel. Reconstruction of z-series image stacks, obtained by confocal imaging, into three-dimensional representations allows for visualization of collectively invading strands and analysis of the representation of fluorescently-labeled cells in leading versus following positions.

Models of tumor cell invasion into three-dimensional extracellular matrix better reflect the in vivo situation than two-dimensional motility assays. Using matrix invasion assays combined with confocal imaging of fluorescently-labeled cells, detailed information on invasion modes and the distinct contributions of leading versus following cells can be obtained.

Modélisation et Imagerie en 3 dimensions l&#39;invasion des cellules collectives

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy ...

An Orthotopic Bladder Tumor Model and the Evaluation of Intravesical saRNA Treatment

We present a novel method for treating bladder cancer with intravesically delivered small activating RNA (saRNA) in an orthotopic xenograft mouse bladder tumor model. The mouse model is established by urethral catheterization under inhaled general anesthetic. Chemical burn is then introduced to the bladder mucosa using intravesical silver nitrate solution to disrupt the bladder glycosaminoglycan layer and allows cells to attach. Following several washes with sterile water, human bladder cancer KU-7-luc2-GFP cells are instilled through the catheter into the bladder to dwell for 2 hours. Subsequent growth of bladder tumors is confirmed and monitored by in vivo bladder ultrasound and bioluminescent imaging. The tumors are then treated intravesically with saRNA formulated in lipid nanoparticles (LNPs). Tumor growth is monitored with ultrasound and bioluminescence. All steps of this procedure are demonstrated in the accompanying video.

Establishing an orthotopic bladder tumor model to evaluate antitumor effects of intravesically delivered saRNA and monitoring tumor growth by ultrasound and bioluminescent imaging.

Un modèle de la vessie orthotopique tumorale et l&#39;évaluation de Sarna traitement intravésicale

We present a novel method for treating bladder cancer with intravesically delivered small activating RNA (saRNA) in an orthotopic xenograft mouse bladder ...

An Orthotopic Mouse Model of Anaplastic Thyroid Carcinoma

Several types of animal models of human thyroid carcinomas have been established, including subcutaneous xenograft and orthotopic implantation of cancer cells into immunodeficient mice. Subcutaneous xenograft models have been valuable for preclinical screening and evaluation of new therapeutic treatments. There are a number of advantages to using a subcutaneous model; 1) rapid, 2) reproducible, and 3) tumor establishment, growth, and response to therapeutic agents may be monitored by visual inspection. However, substantial evidence has shed light on the short-comings of subcutaneous xenograft models1-3. For instance, medicinal treatments demonstrating curative properties in subcutaneous xenograft models often have no notable impact on the human disease. The microenvironment of the site of xenographic transplantation or injection lies at the heart of this dissimilarity.
Orthotopic tumor xenograft models provide a more biologically relevant context in which to study the disease. The advantages of implanting diseased cells or tissue into their anatomical origin equivalent within a host animal includes a suitable site for tumor-host interactions, development of disease-related metastases and the ability to examine site-specific influence on investigational therapeutic remedies. Therefore, orthotopic xenograft models harbor far more clinical value because they closely reproduce human disease. For these reasons, a number of groups have taken advantage of an orthotopic thyroid cancer model as a research tool4-7.
Here, we describe an approach that establishes an orthotopic model for the study of anaplastic thyroid carcinoma (ATC), which is highly invasive, resists treatment, and is virtually fatal in all diagnosed patients. Cultured ATC cells are prepared as a dissociated cellular suspension in a solution containing a basement membrane matrix. A small volume is slowly injected into the right thyroid gland. Overall appearance and health of the mice are monitored to ensure minimal post-operative complications and to gauge pathological penetrance of the cancer. Mice are sacrificed at 4 weeks, and tissue is collected for histological analysis. Animals may be taken at later time-points to examine more advance progression of the disease. Production of this orthotopic mouse model establishes a platform that accomplishes two objectives: 1) further our understanding of ATC pathology, and 2) screen current and future therapeutic agents for efficacy in combating ATC.

Generation of an orthotopic mouse model of anaplastic thyroid carcinoma is described here. This technique employs surgical placement of human anaplastic thyroid cancer cells into the thyroid of immunodeficient mice, thus creating a more clinically relevant setting to study disease progression as well as screen innovative therapeutic interventions.

Un modèle de souris orthotopique de cancer de la thyroïde anaplasique

Several types of animal models of human thyroid carcinomas have been established, including subcutaneous xenograft and orthotopic implantation of cancer ...

An Orthotopic Glioblastoma Mouse Model Maintaining Brain Parenchymal Physical Constraints and Suitable for Intravital Two-photon Microscopy

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology rely on the injection of a suspension of glioma cells into the brain parenchyma following incision of the dura-mater. Whereas the cells have to be injected superficially to be accessible to intravital two-photon microscopy, superficial injections fail to recapitulate the physiopathological conditions. Indeed, escaping through the injection tract most tumor cells reach the extra-dural space where they expand abnormally fast in absence of mechanical constraints from the parenchyma.
Our improvements consist not only in focally implanting a glioma spheroid rather than injecting a suspension of glioma cells in the superficial layers of the cerebral cortex but also in clogging the injection site by a cross-linked dextran gel hemi-bead that is glued to the surrounding parenchyma and sealed to dura-mater with cyanoacrylate. Altogether these measures enforce the physiological expansion and infiltration of the tumor cells inside the brain parenchyma. Craniotomy was finally closed with a glass window cemented to the skull to allow chronic imaging over weeks in absence of scar tissue development.
Taking advantage of fluorescent transgenic animals grafted with fluorescent tumor cells we have shown that the dynamics of interactions occurring between glioma cells, neurons (e.g. Thy1-CFP mice) and vasculature (highlighted by an intravenous injection of a fluorescent dye) can be visualized by intravital two-photon microscopy during the progression of the disease.
The possibility to image a tumor at microscopic resolution in a minimally compromised cerebral environment represents an improvement of current GBM animal models which should benefit the field of neuro-oncology and drug testing.

We have established a cortical orthotopic glioblastoma model in mice for intravital two-photon microscopy that recapitulates the biophysical constraints normally at play during the growth of the tumor. A chronic glass window replacing the skull above the tumor enables the follow-up of the tumor progression over time by two-photon microscopy.

Un modèle de souris orthotopique glioblastome maintien contraintes physiques et parenchyme cérébral Convient pour intravitale deux microscopie biphotonique

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology ...

An Alkali-burn Injury Model of Corneal Neovascularization in the Mouse

Under normal conditions, the cornea is avascular, and this transparency is essential for maintaining good visual acuity. Neovascularization (NV) of the cornea, which can be caused by trauma, keratoplasty or infectious disease, breaks down the so called &lsquo;angiogenic privilege' of the cornea and forms the basis of multiple visual pathologies that may even lead to blindness. Although there are several treatment options available, the fundamental medical need presented by corneal neovascular pathologies remains unmet. In order to develop safe, effective, and targeted therapies, a reliable model of corneal NV and pharmacological intervention is required. Here, we describe an alkali-burn injury corneal neovascularization model in the mouse. This protocol provides a method for the application of a controlled alkali-burn injury to the cornea, administration of a pharmacological compound of interest, and visualization of the result. This method could prove instrumental for studying the mechanisms and opportunities for intervention in corneal NV and other neovascular disorders.

Neovascularization (NV) of the cornea can complicate multiple visual pathologies. Utilizing a controlled, alkali-burn injury model, a quantifiable level of corneal NV can be produced for mechanistic study of corneal NV and evaluation of potential therapies for neovascular disorders.

Un Alkali-brûlures modèle de néovascularisation cornéenne chez la souris

Under normal conditions, the cornea is avascular, and this transparency is essential for maintaining good visual acuity. Neovascularization (NV) of the ...

RNAscope for In situ Detection of Transcriptionally Active Human Papillomavirus in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

The &#39;gold standard&#39; for oncogenic HPV detection is the demonstration of transcriptionally active high-risk HPV in tumor tissue. However, detection of E6/E7 mRNA by quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) requires RNA extraction which destroys the tumor tissue context critical for morphological correlation and has been difficult to be adopted in routine clinical practice. Our recently developed RNA in situ hybridization technology, RNAscope, permits direct visualization of RNA in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue with single molecule sensitivity and single cell resolution, which enables highly sensitive and specific in situ analysis of any RNA biomarker in routine clinical specimens. The RNAscope HPV assay was designed to detect the E6/E7 mRNA of seven high-risk HPV genotypes (HPV16, 18, 31, 33, 35, 52, and 58) using a pool of genotype-specific probes. It has demonstrated excellent sensitivity and specificity against the current &#39;gold standard&#39; method of detecting E6/E7 mRNA by qRT-PCR. HPV status determined by RNAscope is strongly prognostic of clinical outcome in oropharyngeal cancer patients.

RNAscope for In situ Detection of Transcriptionally Active Human Papillomavirus in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

The presence of high-risk HPV in head and neck tumor tissue is associated with favorable outcomes. The recently developed RNA in situ hybridization technique called RNAscope allows direct visualization of HPV E6/E7 mRNA in FFPE tissue sections.

RNAscope pour<em&gt; In situ</em&gt; Détection des actifs de transcription virus du papillome humain dans la tête et du cou carcinome spinocellulaire

The &#39;gold standard&#39; for oncogenic HPV detection is the demonstration of transcriptionally active high-risk HPV in tumor tissue. However, detection ...

Dynamic Contrast Enhanced Magnetic Resonance Imaging of an Orthotopic Pancreatic Cancer Mouse Model

Dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging (DCE-MRI) has been limitedly used for orthotopic pancreatic tumor xenografts due to severe respiratory motion artifact in the abdominal area. Orthotopic tumor models offer advantages over subcutaneous ones, because those can reflect the primary tumor microenvironment affecting blood supply, neovascularization, and tumor cell invasion. We have recently established a protocol of DCE-MRI of orthotopic pancreatic tumor xenografts in mouse models by securing tumors with an orthogonally bent plastic board to prevent motion transfer from the chest region during imaging. The pressure by this board was localized on the abdominal area, and has not resulted in respiratory difficulty of the animals. This article demonstrates the detailed procedure of orthotopic pancreatic tumor modeling using small animals and DCE-MRI of the tumor xenografts. Quantification method of pharmacokinetic parameters in DCE-MRI is also introduced. The procedure described in this article will assist investigators to apply DCE-MRI for orthotopic gastrointestinal cancer mouse models.

The goal of this protocol is to apply dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging (DCE-MRI) for orthotopic pancreatic tumor xenografts in mice. DCE-MRI is a non-invasive method to analyze microvasculature in a target tissue, and useful to assess vascular response in a tumor following a novel therapy.

Contraste dynamique amélioré imagerie par résonance magnétique d&#39;un modèle orthotopique cancer du pancréas de souris

Dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging (DCE-MRI) has been limitedly used for orthotopic pancreatic tumor xenografts due to severe ...

A "Patient-Like" Orthotopic Syngeneic Mouse Model of Hepatocellular Carcinoma Metastasis

The majority of cancer-related deaths are caused by the metastasis of the cancer rather than the primary tumor itself. Yet, the underlying mechanisms of cancer metastasis are still unclear. Animal models are essential for elucidating the mechanisms and for evaluating novel strategies for the treatment of metastatic cancers. Here, an in-depth description of a &#8220;patient-like&#8221; orthotopic syngeneic mouse model for exploring the mechanisms of metastasis of solid organ tumors is provided. The survival surgical implantation of BNL 1ME A.7R.1 mouse hepatocellular carcinoma cells directly into the liver (the organ of origin) of the inbred wild-type immune competent laboratory mouse strain, BALB/c is described. The success and reproducibility of this methodology recommends it for widespread use in elucidating the biological mechanisms of solid organ cancer metastasis.

A &quot;Patient-Like&quot; Orthotopic Syngeneic Mouse Model of Hepatocellular Carcinoma Metastasis

The metastatic spread of cancer is the major cause of cancer-related deaths. We provide an in-depth description of our survival surgery methodology for establishing a &#8220;patient-like&#8221; orthotopic syngeneic mouse model system for studying the mechanisms of metastasis in solid organ tumors.

Un «Patient-Like&quot; Orthotopique Syngénique modèle de souris de carcinome hépatocellulaire Métastases

The majority of cancer-related deaths are caused by the metastasis of the cancer rather than the primary tumor itself. Yet, the underlying mechanisms of ...