Les auteurs remercient chaleureusement le Dr KK Fenrich, le Dr MC. Amoureux, P. Weber et A. Jaouen pour des discussions utiles; M. Hocine, C. Meunier, M. Metwaly, S. Bensemmane, J. Bonnardel, le personnel de l&#39;animalerie à IBDML et le personnel de la plate-forme d&#39;imagerie PicSIL à IBDM pour le support technique. Ce travail a été soutenu par des subventions de l&#39;Institut national du cancer du (INCA-DGOS-INSERM6038) à GR, Agence Nationale de la Recherche (ANR JCJC PathoVisu3Dyn), Fédération pour la Recherche sur le Cerveau (FRC) à FD, par des bourses de la Fédération de la Recherche Médicale et Cancéropôle PACA CR.

Toutes les procédures expérimentales ont été effectuées en conformité avec la législation française et en conformité avec la directive du Conseil communautaire européen du 24 Novembre 1986 (86/609/CEE) pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire. La recherche sur les animaux a été autorisé par la Direction Départementale des Services Vétérinaires des Bouches-du-Rhône (licence D-13-055-21) et approuvé par le comité d&#39;éthique de la Provence Côte d&#39;Azur n ° 14 (Projet 87-04122012) . 1. Sphéroïdes Préparation <ol><li> Préparation des boîtes de Petri enrobées d&#39;agarose <ol><li> Mélanger 1 g d&#39;agarose dans 100 ml de milieu de culture de cellules non supplémenté avec du sérum bovin fœtal. Utilisation d&#39;un four à micro-ondes (850 watts pendant 40 secondes, puis 3 x 15 sec; agiter la solution entre chaque séance de micro-ondes) à faire bouillir la solution et pour dissoudre complètement l&#39;agarose. Autoclave cette solution d&#39;agarose à 1% pendant 20 min à 120 ° C pour assurer la stéri. lité Note: Prenez soin de dissoudre complètement le agarose avant le protocole de l&#39;autoclave. Inhomogénéité peut compromettre la formation de sphéroïdes. </li><li> Une fois récupéré à partir de l&#39;autoclave, verser 10 ml de la solution d&#39;agarose à 1% dans 100 x 20 mm boîtes de Pétri. Laisser le boîtes de Pétri de 20 min à température ambiante pour permettre à la solution d&#39;agarose à 1% à solidifier. </li><li> Ajouter 10 ml de PBS-dessus de l&#39;agarose pour maintenir l&#39;humidité. Sceller le couvercle des boîtes de Pétri agarose revêtues en les enveloppant avec du parafilm pour éviter l&#39;évaporation. Boîtes de Pétri peuvent être stockés jusqu&#39;à 2 mois à 4 ° C si bien humidifié par la couche PBS. </li></ol></li><li> Culture sphéroïde <ol><li> Dans un flacon de 75 cm2, la culture des cellules de gliome dans leur milieu recommandé que d&#39;une monocouche. </li><li> Remplacer le PBS à partir de l&#39;une d&#39;agarose revêtues boîte de Petri de 1% par 1,5 ml de &quot;milieu préconditionné&quot; prélevés dans la fiole contenant la monocouche 2D de cellules de gliomes. </li><li> Retirer le milieu de la fiole contenant la monocouche 2D de cellules de gliome. </li><li> Rincer délicatement la monocouche avec 10 ml de PBS. </li><li> Ajouter 2 ml de 0,05% d&#39;une solution de trypsine / EDTA et incuber le ballon à 4 min à 37 ° C. Remarque: Le temps d&#39;incubation peut varier en fonction de la lignée cellulaire utilisée. </li><li> Ajouter 8 ml de milieu de culture pour arrêter l&#39;action de la trypsine, rincer doucement la suspension de cellules. Remarque: Prenez soin de ne pas expulser l&#39;air dans la suspension cellulaire car elle augmente la mort cellulaire. </li><li> Mettre 6 ml de la suspension cellulaire dans un flacon stérile. </li><li> Centrifuger le flacon 4 min à 800 rpm. </li><li> Eliminer le surnageant et suspendre doucement le sédiment cellulaire dans 3 ml de milieu de culture. </li><li> Ensemencer la suspension de cellules dans le plat préparé d&#39;agarose revêtues de Pétri. </li><li> Mettre la boîte de Pétri à 37 ° C dans une atmosphère de CO2 à 5% pendant 2 à 3 jours jusqu&#39;à ce que des sphéroïdes de diamètre désiré sont formés. </li></ol></li></ol&gt; 2. Sphéroïde et fenêtre Implantation <ol><li> Préparation du système d&#39;injection <ol><li> Capillaires en verre propre (1 mm de diamètre) par sonication dans 70% d&#39;éthanol pendant 10 min. Rincer deux fois à l&#39;eau avant mise intérieur d&#39;un incubateur à sec. </li><li> Tirez plusieurs capillaires de verre nettoyés avec un extracteur de pipette afin de préparer un petit stock. </li><li> Casser le bout du capillaire tiré par grattage de l&#39;extrémité sur un morceau de papier de soie pour obtenir une extrémité biseautée de la taille souhaitée: typiquement un diamètre externe de 300 à 350 um et un diamètre interne de 250 à 300 um. Au cours de ce processus de mise en forme, de contrôler le diamètre du capillaire à l&#39;aide d&#39;un macroscope dont l&#39;oculaire est équipé d&#39;un mira graduée. </li><li> Connecter l&#39;extrémité non biseautée du tube capillaire à un collecteur 3 de manière à l&#39;aide d&#39;un morceau de tuyau en matière plastique dont le diamètre intérieur s&#39;adapte au diamètre extérieur du capillaire. </li><li> L&#39;utilisation de plastique tubing, connectez les deux autres façons de le collecteur à un 25 ul de seringue microlitre et à une seringue de 1 ml chargé avec de l&#39;huile minérale histo-compatible. </li><li> Réglez le sélecteur collecteur d&#39;établir une voie entre la seringue microlitre et la seringue de 1 ml. Supprimer le piston de la seringue microlitre et injecter de l&#39;huile minérale vers l&#39;arrière dans la seringue microlitre jusqu&#39;à ce qu&#39;il s&#39;échappe en poussant le piston de la seringue de 1 ml. Remplacer le piston de la seringue microlitre tout en prenant soin de ne pas laisser de bulles d&#39;air dans le tube. </li><li> Ajuster le sélecteur collecteur d&#39;établir une voie entre le capillaire et la seringue de 1 ml. Remplir le capillaire à l&#39;huile minérale jusqu&#39;à ce qu&#39;il s&#39;échappe de la pointe tout en prenant soin de ne pas laisser de bulles d&#39;air dans le tube. </li><li> Ajuster le sélecteur de collecteur pour établir une connexion entre la seringue microlitre et le capillaire. Expulser environ 10 ul d&#39;huile minérale. </li><li> Trempez l&#39;extrémité du capillaire dans la solution PBSet l&#39;utilisation de la jauge de la seringue microlitre, sucer dans 5 ul de PBS dans le capillaire. A noter que le ménisque entre l&#39;huile et du PBS est clairement visible. </li><li> Fixer le capillaire sur un raccord sous le macroscope de la chirurgie micromanipulateur 3 axes. Ce système sera utilisé pour cibler la capillarité vers le site de l&#39;injection sous contrôle visuel. </li></ol></li><li> Implantation sphéroïde <ol><li> Légèrement endormir la souris par inhalation d&#39;isoflurane dans une chambre d&#39;induction (1,5% dans l&#39;air pendant 1 à 1,5 min). </li><li> Anesthésier les animaux par une injection intra-péritonéale d&#39;un mélange de kétamine / xylazine (120 mg / kg, 12 mg / kg). A noter que l&#39;anesthésie réduit souvent la température du corps de l&#39;animal. Il est recommandé de procéder à une chirurgie dans une pièce à 26 ° C et à garder au chaud des animaux avec un coussin chauffant thermo-régulé sous-jacent. </li><li> Appliquer une pommade pour les yeux pour éviter le dessèchement des yeux. </li><li> Raser le cuir chevelu de l&#39;animal. </li><li> Lieul&#39;animal dans un cadre stéréotaxique utilisant des barres d&#39;oreilles et un embout buccal. </li><li> Nettoyer la peau avec de la povidone iode (3% de savon, puis 10% solution). </li><li> Faire une incision de 1 cm de long dans la direction longitudinale médiane du cuir chevelu avec un scalpel. Avec des ciseaux couper et enlever la peau au-dessus des os pariétaux. </li><li> Avec une lame de scalpel retirez délicatement le périoste au-dessus du crâne. Appliquez généreusement cyanoacrylate sur le dessus de l&#39;os de générer une surface rugueuse pour l&#39;adhésion de ciment plus tard. </li><li> Percer l&#39;os pariétal sous un macroscope chirurgicale pour générer une craniotomie de 4 mm de diamètre. Généreusement ajouter du PBS glacé contenant pénicilline (1000 U / ml) et Streptomicin (1 mg / ml) au cours de toute la procédure d&#39;empêcher le chauffage. Retirez les petits fragments d&#39;os avec une pince et une gaze stérile humide. Prenez soin de percer au moins 1 mm à une distance de sutures crâniennes pariétales pour éviter les hémorragies. </li><li> Mince de l&#39;os à la frontière de la craniotomie, où la vitre de verre sera scellé. Le but est de eeiller tard plane positionnement de la fenêtre en verre avec une surface de contact maximale entre le cerveau et le verre. Retirer lentement l&#39;os en utilisant une pince et nettoyer la dure-mère exposée à la solution de PBS. </li><li> Prenez un tour lamelle de verre de 5 mm de diamètre, le nettoyer avec de l&#39;alcool et le sécher avec du papier absorbant. Essayez d&#39;utiliser la lamelle comme un couvercle pour la craniotomie et confirmer qu&#39;une grande surface plane du cerveau entre en contact avec le verre. Si nécessaire enlever la lamelle à plus d&#39;amincir les os latéraux. Continuez jusqu&#39;à ce que le cerveau peut se pressé plat si appuyant légèrement sur la lamelle, une fois en place. </li><li> Nettoyer à nouveau la lamelle avec de l&#39;alcool, le sécher avec du papier absorbant, et enregistrez-le dehors. </li><li> Avec une aiguille de calibre 26 de faire un trou dans la dure-mère dans le centre de la craniotomie en évitant toutefois les principaux vaisseaux sanguins. Assurez-vous de ne pas endommager le parenchyme cérébral que le but de cette étape est juste d&#39;ouvrir la dure-mère. </li><li> Nettoyez délicatement la dure-mère wième solution PBS pour éliminer le sang hémorragique. Couvrir avec un morceau de papier de soie, tout en préparant l&#39;injection sphéroïde. </li><li> Avec le système d&#39;injection sphéroïde préparé à l&#39;étape 2.1, aspirer un montage du diamètre intérieur du capillaire (environ 200 à 250 um) de la boîte de Pétri préparé à l&#39;étape 1.2 sphéroïde ronde. Sphéroïde devrait venir avec environ 5 milieu de culture de pi. Il devrait tomber à la pointe de la capillarité sous son poids. </li><li> Retirer le papier de soie humide utilisé pour couvrir la craniotomie et positionner l&#39;animal dans le système d&#39;injection. </li><li> Abaissez la pipette d&#39;injection jusqu&#39;à ce qu&#39;il touche le trou fait dans la dure-mère. Ensuite, abaisser à nouveau par 250 um. Attendez 30 secondes. </li><li> Injecter lentement le sphéroïde à l&#39;aide du piston de la seringue microlitre (2-3 ul) tout en pompant le liquide en excès d&#39;une mince feuille de papier de soie. Attendez 30 secondes, puis soulevez délicatement la pipette d&#39;injection de 50 um vers la surface. Attendez encore 30 secondes et s&#39;acquitt la procédure de levage par étapes de 50 um jusqu&#39;à la surface. Les temps d&#39;attente évite l&#39;extraction de l&#39;ellipsoïde qui collerait à la pipette. </li><li> Confirmer la présence de l&#39;ellipsoïde dans le cerveau à l&#39;aide d&#39;un macroscope de fluorescence. </li><li> Mélanger 100-300 diamètre um réticulés billes de gel de dextran avec une solution de PBS dans une boîte de Pétri. Attendez 1min et pêcher quelques perles hydratées. Placez-les sur l&#39;os adjacent à la craniotomie. </li><li> Sous le contrôle macroscopique, choisissez l&#39;une perle avec un diamètre similaire à la taille de l&#39;ouverture dure-mère. Couper le dextrane bille de gel réticulé à l&#39;aide de deux demi-pinces. </li><li> Placez délicatement un gel de dextran hémi-perle réticulé dans le trou d&#39;injection avec la face convexe vers le sphéroïde. Prenez soin de ne pas enlever le sphéroïde et appuyez doucement vers le bas jusqu&#39;à la frontière de l&#39;concave entrer en contact avec la dure-mère environnante. </li><li> Mettre une goutte de colle cyanoacrylate sur une lame de verre; tremper la pointe d&#39;un cure-dent dans la drop pour prendre une petite quantité de colle. Sceller rapidement les bords de l&#39;hémi-gel de dextrane réticulé bourrelet à la dure-mère adjacent par estampage colle autour. Prenez soin d&#39;effectuer des mouvements rapides et précis afin d&#39;éviter le collage du dextran gel semi-perle réticulé au cure-dent. Éviter l&#39;excès de colle qui peut se propager et d&#39;empêcher sinon empêcher imagerie fois séché. Attendez 2 min pour que la colle sèche, puis nettoyer la craniotomie et l&#39;os environnant avec une solution PBS. </li></ol></li><li> Fenêtre implantation <ol><li> Mettez le diamètre de 5 mm ronde lamelle dessus de la craniotomie (voir 2.2.12). Les bords de la lamelle doit être amincie sur le crâne à l&#39;extérieur de la craniotomie. La lamelle couvre-objet doit être en contact avec la dure-mère et l&#39;os sur les bords amincis. Il est très important d&#39;avoir un contact direct entre la dure-mère et la lamelle de verre contraire tissu cicatriciel peut se développer et d&#39;entraver la clarté optique. </li><li> Avec un tissu, d&#39;absorber la PBS sur ee bords de lamelle sorte que la solution ne couvre pas entièrement la craniotomie lors de l&#39;application d&#39;une faible pression dans le centre de la lamelle. De cette manière, l&#39;os, le verre et le cerveau sont collées ensemble sur le côté de la région d&#39;intérêt. </li><li> Maintenir une faible pression au niveau du centre de la lamelle couvre-objet avec une pince tout en appliquant doucement cyanoacrylate à la frontière entre l&#39;os et la lamelle couvre-objet. La colle spontanément se propager jusqu&#39;à l&#39;interface avec une solution de PBS. Solution agira comme une barrière donné le caractère hydrophobe de la colle. Étanchéité devrait être effective en moins d&#39;une minute, mais prendre un soin extrême de ne pas bouger la lamelle jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit fixé. Ce serait par ailleurs entraîner une fuite de cyanoacrylate sur la dure-mère donc conduire à un échec de la chirurgie. </li><li> Dans le cas de la colle se serait répandue sur le dessus du verre, enlever à l&#39;aide d&#39;une lame micro-scalpel en faisant des mouvements en spirale comme il peut autrement réduire la clarté optique. Attention à ne pas casser la lamelle de verre During la procédure en raison d&#39;une pression excessive. </li><li> Consolider la fixation de verre par application d&#39;un ciment dentaire sur les bords de la lamelle vers le crâne adjacent. Assurez-vous de couvrir le crâne exposé ensemble jusqu&#39;à ce que le cuir chevelu. Utilisation de ciment supplémentaire, construire des parois latérales autour de la lamelle pour créer le pool nécessaire pour l&#39;immersion de l&#39;objectif. Le ciment dentaire permet de guérir en moins de 10 min. </li></ol></li></ol> 3. Soins post-opératoires et préparation pour l&#39;imagerie <ol><li> Soins post-opératoires <ol><li> Retirez la souris du cadre stéréotaxique, injecter Dexamethazon (0,2 mg / kg) et Rimadyl (5 mg / kg) sc sur les régions pelviennes et la déposer dans une cage avec un tissu nid chaud. </li><li> Surveillance de l&#39;animal jusqu&#39;à ce que les effets de l&#39;anesthésie ont disparu. En général de 2 à 3 heures après la chirurgie, les souris sont entièrement mobile. Assurez-vous que l&#39;animal a un accès facile à la nourriture et de l&#39;eau. Fournir à l&#39;animal avec de l&#39;agarose contenant du glucose (agarose3%, glucose 3%). </li><li> Surveiller le poids de l&#39;animal tous les jours et injecter Dexamethazon (0,2 mg / kg) et Rimadyl (5 mg / kg) sc pour la première 10d après la chirurgie. Pour des raisons éthiques, euthanasier les souris lorsque la perte dépasse 15% de son poids initial. La pression intracrânienne augmente avec la taille de la tumeur conduisant à une déficience motrice pour l&#39;animal. Cette lignée cellulaire tumorale est dépendante et se produit à divers délais après l&#39;intervention chirurgicale. Une attention particulière doit être prise pour caractériser le critère de l&#39;expérience avec la lignée cellulaire utilisée. </li></ol></li><li> Préparation pour l&#39;imagerie <ol><li> Légèrement endormir la souris par inhalation d&#39;isoflurane dans une chambre d&#39;induction (1,5% dans l&#39;air pour 1 à 1,5 min). </li><li> Anesthésier les animaux par une injection intra-péritonéale d&#39;un mélange de kétamine / xylazine (100 mg / kg, 10 mg / kg). Cette anesthésie permet généralement 45 min d&#39;observation. Pour effectuer les séances d&#39;imagerie plus, la souris est placé sous inhalation continue de l&#39;isoflurane dansair (0,25-0,75%). </li><li> Appliquer une pommade pour les yeux pour éviter le dessèchement des yeux. </li><li> Mettez l&#39;animal sur un cadre stéréotaxique et bloquer le crâne avec les earbars. </li><li> Pour visualiser les vaisseaux sanguins, un colorant fluorescent peut être injecté par voie intraveineuse. </li><li> Si la fenêtre est sale, il peut être nettoyé en retirant doucement les débris avec une lame mince et le coin d&#39;un tissu. Ne pas utiliser d&#39;alcool pour nettoyer la fenêtre comme il n&#39;est pas toujours compatible avec un ciment dentaire et il peut refroidir le cerveau en dessous de la fenêtre. </li></ol></li></ol>

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Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Cette approche permet l&#39;utilisation de méthodes d&#39;imagerie optique pour surveiller au fil des jours et des semaines, la croissance d&#39;un gliome orthotopique implanté. Le même animal peut ensuite être soumis à pratiquement n&#39;importe quelle modalité d&#39;imagerie cérébrale au cours de la pathologie; encore la préparation spécifique microscopie à deux photons offre l&#39;occasion unique de parvenir à la résolution subcellulaire dans le cerveau de l&#39;animal vivant. Notre protocole présente l...

Le glioblastome multiforme apparaît comme la forme la plus agressive de tumeur cérébrale chez les adultes avec une survie médiane de 12 mois et un taux de survie à 5 ans de 5%. Gestion clinique repose sur la chirurgie, la radiothérapie et la chimiothérapie souvent utilisé en combinaison. Cependant, les effets de ces traitements restent palliatifs 1-3. Jusqu&#39;à présent, la plupart des études de neuro-oncologie reposent sur ​​des techniques qui ne sont en mesure de fournir une vision statique et exécutées sur de grandes cohortes de tumeurs des animaux portant sacrifiés à différents points dans le temps (voir par exemple 4,5). Le développement récent de méthodes de suivi basé sur l&#39;imagerie intravitale permet d&#39;étudier la croissance des gliomes et les interactions entre les cellules tumorales et leur microenvironnement physiopathologique sur le même animal au fil du temps. Cela ouvre la voie à pièce exclusive de l&#39;information qui était jusqu&#39;ici irréalisable 6. Les animaux transgéniques exprimant des marqueurs fluorescents dans les cellules d&#39;intérêt peuvent être utiliséd pour étudier les interactions spécifiques entre les cellules tumorales et par exemple les neurones dans le présent document. Au cours de la dernière décennie, intravitale microscopie à deux photons 7 est devenu un standard de l&#39;or dans les études de neuro-oncologie fondamentales et des essais précliniques 8,9 pour sa capacité à effectuer observation intravitale profonde de cerveau de souris (&gt; 500 um en dessous de la dure-mère) avec une résolution spatiale micrométrique 10. Utilisation intravitale microscopie à deux photons avec des modèles animaux orthotopique implantés avec une fenêtre crânienne 11 chronique, il est possible de suivre la progression de la tumeur au cours du temps sur le même 9,12 de la souris. L&#39;un des inconvénients majeurs de ces modèles animaux précédemment publiés est cependant qu&#39;ils n&#39;imitent pas les contraintes physiques qui régissent l&#39;évolution de la tumeur comme la dure-mère n&#39;est pas scellé après l&#39;injection de la suspension de cellules 9,13,14. cellules de gliome peuvent fuir dans leespace extradural transformer un modèle de gliome orthotopique en un hétérotopique. Le modèle animal présenté ici consiste dans l&#39;injection d&#39;un sphéroïde de cellules de gliome fluorescents dans le cortex cérébral, à une profondeur de 200 pm, suivie par la fermeture de la dure-mère avec un dextrane gel hémi-bourrelet réticulé et de la colle d&#39;histo-compatible . La croissance de la tumeur est alors limité au parenchyme cérébral qui maintient contraintes physiques physiopathologiques. Une fenêtre de verre chronique implanté au-dessus de la tumeur permet un accès facile pour optique intravitale microscopie à deux photons. L&#39;utilisation d&#39;animaux transgéniques exprimant des marqueurs fluorescents dans les cellules d&#39;intérêt, il est possible d&#39;effectuer un suivi de la croissance des gliomes au fil du temps et à étudier son interaction avec son micro-environnement (ici avec les neurones et le système vasculaire en surbrillance avec des dextranes fluorescents).

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		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:425px;">Drill</td>
			<td style="width:383px;">Dremel (Germany)</td>
			<td style="width:156px;">398</td>
			<td style="width:375px;">any high quality surgical bone drill would suffice</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:425px;">Drill burr (#1/4 Carbide Round Burr)</td>
			<td style="width:383px;">World Precision Instruments (USA)</td>
			<td>501860 (#1/4)</td>
			<td>also sold by Harvard Apparatus</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Tissue scissors</td>
			<td style="width:383px;">World Precision Instruments (USA)</td>
			<td>14395</td>
			<td style="width:375px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Dumont tweezers M5S</td>
			<td style="width:383px;">World Precision Instruments (USA)</td>
			<td>501764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Dental cement</td>
			<td>GACD (USA)</td>
			<td>12-565 &#38; 12-568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Cyanoacrylate</td>
			<td>Eleco-EFD (France)</td>
			<td>Cyanolit 201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Glass capillaries without filament</td>
			<td>Clark Electromedical Instruments (UK)</td>
			<td>GC100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Microliter syringe (25 &#181;l)</td>
			<td>Hamilton (USA)</td>
			<td>702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:383px;">World Precision Instruments (USA)</td>
			<td>Kite-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">T derivation (3-way stopcock - Luer lock)</td>
			<td style="width:383px;">World Precision Instruments (USA)</td>
			<td>14035-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Stereotactic frame (mouse adaptor)</td>
			<td style="width:383px;">World Precision Instruments (USA)</td>
			<td>502063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Glass coverslips</td>
			<td>Warner Instruments (USA)</td>
			<td>CS-5R (64-0700)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Cross-linked dextran gel (Sephadex) G50 Coarse 100-300 &#181;m beads</td>
			<td>Available from various suppliers including Sigma (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Eye ointment</td>
			<td>TVM (France)</td>
			<td>Ocry-gel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Fluorescence macroscope</td>
			<td>Leica MZFLIII (Germany)</td>
			<td></td>
			<td>also sold by other companies</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Two-photon microscope</td>
			<td>Zeiss LSM 7MP (Germany)</td>
			<td></td>
			<td>also sold by other companies (Nikon, &#8230;)</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Infrared tunable femtosecond laser (Ma&#239;-Ta&#239;)</td>
			<td>Spectra Physics (USA)</td>
			<td></td>
			<td>also sold by other companies</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an orthotopic glioblastoma mouse model maintaining brain parenchymal physical constraints and suitable for intravital two-photon microscopy

Le glioblastome multiforme (GBM) est la forme la plus agressive des tumeurs cérébrales avec aucun des traitements curatifs disponibles à ce jour. Les modèles murins de cette pathologie reposent sur l&#39;injection d&#39;une suspension de cellules de gliome dans le parenchyme du cerveau suite à une incision de la dure-mère. Alors que les cellules doivent être injectés superficiellement pour être accessible à intravitale microscopie à deux photons, injections superficielles ne parviennent pas à récapituler les conditions physiopathologiques. En effet, s&#39;échappant par le tube d&#39;injection plupart des cellules tumorales parviennent de l&#39;espace extra-dural où ils se détendent anormalement rapide en l&#39;absence de contraintes mécaniques du parenchyme. Nos améliorations consistent non seulement dans l&#39;implantation focalement un sphéroïde de gliome, plutôt que l&#39;injection d&#39;une suspension de cellules de gliome dans les couches superficielles du cortex cérébral, mais aussi dans le colmatage du site d&#39;injection par un dextrane gel hémi-bourrelet réticulé qui est collée à la surrounding parenchyme et scellé dure-mère avec cyanoacrylate. Au total, ces mesures imposent l&#39;expansion physiologique et l&#39;infiltration des cellules tumorales à l&#39;intérieur du parenchyme cérébral. Craniotomie a été finalement fermé par une fenêtre en verre collée sur le crâne pour permettre l&#39;imagerie chronique pendant des semaines en l&#39;absence de développement de tissu cicatriciel. Profitant d&#39;animaux transgéniques fluorescentes greffées avec des cellules tumorales fluorescentes, nous avons montré que la dynamique des interactions qui se produisent entre les cellules de gliome, les neurones (par exemple souris Thy1-PCP) et vasculaire (mis en évidence par une injection intraveineuse d&#39;un colorant fluorescent) peuvent être visualisés par intravitale microscopie à deux photons au cours de la progression de la maladie. La possibilité à l&#39;image d&#39;une tumeur à la résolution microscopique dans un environnement cérébrale peu compromis représente une amélioration de modèles animaux GBM actuelles qui devraient bénéficier le domaine de la neuro-oncologie et de dépistage des drogues. </p&gt;

Une fois que le protocole opératoire est réalisée (figure 1), les animaux peuvent être observés par microscopie de fluorescence au fil des semaines jusqu&#39;au sacrifice. Une réaction inflammatoire peut être observée après la chirurgie qui disparaît dans une ou deux semaines. La croissance tumorale peut être observé par différentes techniques de microscopie à fluorescence et dont macroscopie microscopie biphotonique (Figure 2). Exemple images représentées ici ont été ...

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An Orthotopic Glioblastoma Mouse Model Maintaining Brain Parenchymal Physical Constraints and Suitable for Intravital Two-photon Microscopy

Nous avons établi un modèle de glioblastome orthotopique corticale chez la souris pour intravitale microscopie à deux photons qui récapitule les contraintes biophysiques normalement en jeu au cours de la croissance de la tumeur. Une fenêtre en verre chronique remplaçant le crâne au-dessus de la tumeur permet le suivi de la progression de la tumeur au cours du temps par microscopie à deux photons.

Un modèle de souris orthotopique glioblastome maintien contraintes physiques et parenchyme cérébral Convient pour intravitale deux microscopie biphotonique

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

19.6K vues.  Aix Marseille University.  Nous avons établi un modèle de glioblastome orthotopique corticale chez la souris pour intravitale microscopie à deux photons qui récapitule les contraintes biophysiques normalement en jeu au cours de la croissance de la tumeur. Une fenêtre en verre chronique remplaçant le crâne au-dessus de la tumeur permet le suivi de la progression de la tumeur au cours du temps par microscopie à deux photons. 

Vidéo: An Orthotopic Glioblastoma Mouse Model Maintaining Brain Parenchymal Physical Constraints and Suitable for Intravital Two-photon Microscopy

An Orthotopic Model of Murine Bladder Cancer

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and subsequent cell adhesion. After their bladders are transurethrally catheterized and drained, animals are again catheterized to permit insertion of a platinum wire into bladders without damaging the urethra or bladder. The catheters are made of Teflon to serve as an insulator for the wire, which will conduct electrical current into the bladder to create a burn injury. An electrocautery unit is used to deliver 2.5W to the exposed end of the wire, burning away extracellular layers and providing attachment sites for carcinoma cells that are delivered in suspension to the bladder through a subsequent catheterization. Cells remain in the bladder for 90 minutes, after which the catheters are removed and the bladders allowed to drain naturally. The development of tumor is monitored via ultrasound. Specific attention is paid to the catheterization technique in the accompanying video.

Bladder tumors are established in female mice in a minimally invasive fashion through catheterization, local cauterization, and subsequent adhesion of carcinoma cells to the burn sites.

Un modèle orthotopique de cancer de la vessie murin

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and ...

Recherche

Médecine

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-photon imagerie de l&#39;invasion des cellules tumorales dans un modèle de souris orthotopique du carcinome épidermoïde oral

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Combination Radiotherapy in an Orthotopic Mouse Brain Tumor Model

Glioblastoma multiforme (GBM) are the most common and aggressive adult primary brain tumors1. In recent years there has been substantial progress in the understanding of the mechanics of tumor invasion, and direct intracerebral inoculation of tumor provides the opportunity of observing the invasive process in a physiologically appropriate environment2. As far as human brain tumors are concerned, the orthotopic models currently available are established either by stereotaxic injection of cell suspensions or implantation of a solid piece of tumor through a complicated craniotomy procedure3. In our technique we harvest cells from tissue culture to create a cell suspension used to implant directly into the brain. The duration of the surgery is approximately 30 minutes, and as the mouse needs to be in a constant surgical plane, an injectable anesthetic is used. The mouse is placed in a stereotaxic jig made by Stoetling (figure 1). After the surgical area is cleaned and prepared, an incision is made; and the bregma is located to determine the location of the craniotomy. The location of the craniotomy is 2 mm to the right and 1 mm rostral to the bregma. The depth is 3 mm from the surface of the skull, and cells are injected at a rate of 2 &mu;l every 2 minutes. The skin is sutured with 5-0 PDS, and the mouse is allowed to wake up on a heating pad. From our experience, depending on the cell line, treatment can take place from 7-10 days after surgery. Drug delivery is dependent on the drug composition. For radiation treatment the mice are anesthetized, and put into a custom made jig. Lead covers the mouse's body and exposes only the brain of the mouse. The study of tumorigenesis and the evaluation of new therapies for GBM require accurate and reproducible brain tumor animal models. Thus we use this orthotopic brain model to study the interaction of the microenvironment of the brain and the tumor, to test the effectiveness of different therapeutic agents with and without radiation.

The purpose of this article is to describe the use of an orthotopic glioblastoma model for chemoradiation studies. This article will go though cell processing, implanting, and radiotherapy of the mouse using an intracranial model.

La radiothérapie combinée à un modèle de tumeur de cerveau de souris orthotopique

Glioblastoma multiforme (GBM) are the most common and aggressive adult primary brain tumors1. In recent years there has been substantial progress in the ...

An Orthotopic Mouse Model of Anaplastic Thyroid Carcinoma

Several types of animal models of human thyroid carcinomas have been established, including subcutaneous xenograft and orthotopic implantation of cancer cells into immunodeficient mice. Subcutaneous xenograft models have been valuable for preclinical screening and evaluation of new therapeutic treatments. There are a number of advantages to using a subcutaneous model; 1) rapid, 2) reproducible, and 3) tumor establishment, growth, and response to therapeutic agents may be monitored by visual inspection. However, substantial evidence has shed light on the short-comings of subcutaneous xenograft models1-3. For instance, medicinal treatments demonstrating curative properties in subcutaneous xenograft models often have no notable impact on the human disease. The microenvironment of the site of xenographic transplantation or injection lies at the heart of this dissimilarity.
Orthotopic tumor xenograft models provide a more biologically relevant context in which to study the disease. The advantages of implanting diseased cells or tissue into their anatomical origin equivalent within a host animal includes a suitable site for tumor-host interactions, development of disease-related metastases and the ability to examine site-specific influence on investigational therapeutic remedies. Therefore, orthotopic xenograft models harbor far more clinical value because they closely reproduce human disease. For these reasons, a number of groups have taken advantage of an orthotopic thyroid cancer model as a research tool4-7.
Here, we describe an approach that establishes an orthotopic model for the study of anaplastic thyroid carcinoma (ATC), which is highly invasive, resists treatment, and is virtually fatal in all diagnosed patients. Cultured ATC cells are prepared as a dissociated cellular suspension in a solution containing a basement membrane matrix. A small volume is slowly injected into the right thyroid gland. Overall appearance and health of the mice are monitored to ensure minimal post-operative complications and to gauge pathological penetrance of the cancer. Mice are sacrificed at 4 weeks, and tissue is collected for histological analysis. Animals may be taken at later time-points to examine more advance progression of the disease. Production of this orthotopic mouse model establishes a platform that accomplishes two objectives: 1) further our understanding of ATC pathology, and 2) screen current and future therapeutic agents for efficacy in combating ATC.

Generation of an orthotopic mouse model of anaplastic thyroid carcinoma is described here. This technique employs surgical placement of human anaplastic thyroid cancer cells into the thyroid of immunodeficient mice, thus creating a more clinically relevant setting to study disease progression as well as screen innovative therapeutic interventions.

Un modèle de souris orthotopique de cancer de la thyroïde anaplasique

Several types of animal models of human thyroid carcinomas have been established, including subcutaneous xenograft and orthotopic implantation of cancer ...

An Orthotopic Bladder Cancer Model for Gene Delivery Studies

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are needed. The tumor microenvironment can significantly influence tumor development and therapy response. It is therefore often desirable to grow tumor cells in the organ from which they originated. This protocol describes an orthotopic model of bladder cancer, in which MB49 murine bladder carcinoma cells are instilled into the bladder via catheterization. Successful tumor cell implantation in this model requires disruption of the protective glycosaminoglycan layer, which can be accomplished by physical or chemical means. In our protocol the bladder is treated with trypsin prior to cell instillation. Catheterization of the bladder can also be used to deliver therapeutics once the tumors are established. This protocol describes the delivery of an adenoviral construct that expresses a luciferase reporter gene. While our protocol has been optimized for short-term studies and focuses on gene delivery, the methodology of mouse bladder catheterization has broad applications.

Implantation of cancer cells into the organ of origin can serve as a useful preclinical model to evaluate novel therapies. MB49 bladder carcinoma cells can be grown within the bladder following intravesical instillation. This protocol demonstrates catheterization of the mouse bladder for the purpose of tumor implantation and adenoviral delivery.

Un modèle de cancer de la vessie orthotopique d&#39;études livraison Gene

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

Un modèle murin orthotopique de cancer de la prostate humain métastases

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Acute Brain Trauma in Mice Followed By Longitudinal Two-photon Imaging

Although acute brain trauma often results from head damage in different accidents and affects a substantial fraction of the population, there is no effective treatment for it yet. Limitations of currently used animal models impede understanding of the pathology mechanism. Multiphoton microscopy allows studying cells and tissues within intact animal brains longitudinally under physiological and pathological conditions. Here, we describe two models of acute brain injury studied by means of two-photon imaging of brain cell behavior under posttraumatic conditions. A selected brain region is injured with a sharp needle to produce a trauma of a controlled width and depth in the brain parenchyma. Our method uses stereotaxic prick with a syringe needle, which can be combined with simultaneous drug application. We propose that this method can be used as an advanced tool to study cellular mechanisms of pathophysiological consequences of acute trauma in mammalian brain in vivo. In this video, we combine acute brain injury with two preparations: cranial window and skull thinning. We also discuss advantages and limitations of both preparations for multisession imaging of brain regeneration after trauma.

Acute brain trauma is a severe injury that has no adequate treatment to date. Multiphoton microscopy allows studying longitudinally the process of acute brain trauma development and probing therapeutical strategies in rodents. Two models of acute brain trauma studied with in vivo two-photon imaging of brain are demonstrated in this protocol.

Aiguë traumatisme cérébral chez la souris Suivi par longitudinale à deux photons imagerie

Although acute brain trauma often results from head damage in different accidents and affects a substantial fraction of the population, there is no ...

Bioluminescence Imaging of an Immunocompetent Animal Model for Glioblastoma

In contrast to commonly reported human glioma xenograft animal models, GL261 murine glioma xenografts recapitulate nearly all relevant clinical and histopathologic features of the human disease. When GL261 cells are implanted intracranially in syngeneic C57BL/6 mice, the model has the added advantage of maintaining an intact immune microenvironment. Stable expression of luciferase in GL261 cells allows non-invasive cost effective bioluminescence monitoring of intracranial tumor growth. We have recently demonstrated that luciferase expression in GL261 cells does not affect the tumor growth properties, tumor cell immunomodulatory cytokine expression, infiltration of immune cells into the tumor, or overall survival of animals bearing the intracranial tumor. Therefore, it appears that the GL261 luciferase glioma model can be useful in the study of novel chemotherapeutic and immunotherapeutic modalities. Here we report the technique for generating stable luciferase expression in GL261 cells and how to study the in vitro and in vivo growth of the tumor cells by bioluminescence imaging.

GL261 glioma cells provide a useful immunocompetent animal model of glioblastoma. The goals of this protocol are to demonstrate proper techniques for monitoring intracranial tumor growth using in vivo bioluminescence imaging, and to verify the utility of luciferase-modified GL261 cells for studying tumor immunology and immunotherapeutic approaches for treating glioblastoma.

Bioluminescence imagerie d&#39;un modèle animal pour immunocompétentes glioblastome

In contrast to commonly reported human glioma xenograft animal models, GL261 murine glioma xenografts recapitulate nearly all relevant clinical and ...

An Orthotopic Mouse Model of Spontaneous Breast Cancer Metastasis

Metastasis is the primary cause of mortality of breast cancer patients. The mechanism underlying cancer cell metastasis, including breast cancer metastasis, is largely unknown and is a focus in cancer research. Various breast cancer spontaneous metastasis mouse models have been established. Here, we report a simplified procedure to establish orthotopic transplanted breast cancer primary tumor and resultant spontaneous metastasis that mimic human breast cancer metastasis. Combined with the bioluminescence live tumor imaging, this mouse model allows tumor growth and progression kinetics to be monitored and quantified. In this model, a low dose (1 x 104 cells) of 4T1-Luc breast cancer cells was injected into BALB/c mouse mammary fat pad using a tuberculin syringe. Mice were injected with luciferin and imaged at various time points using a bioluminescent imaging system. When the primary tumors grew to the size limit as in the IACUC-approved protocol (approximately 30 days), mice were anesthetized under constant flow of 2% isoflurane and oxygen. The tumor area was sterilized with 70% ethanol. The mouse skin around the tumor was excised to expose the tumor which was removed with a pair of sterile scissors. Removal of the primary tumor extends the survival of the 4T-1 tumor-bearing mice for one month. The mice were then repeatedly imaged for metastatic tumor spreading to distant organs. Therapeutic agents can be administered to suppress tumor metastasis at this point. This model is simple and yet sensitive in quantifying breast cancer cell growth in the primary site and progression kinetics to distant organs, and thus is an excellent model for studying breast cancer growth and progression, and for testing anti-metastasis therapeutic and immunotherapeutic agents in vivo.

An orthotopic breast cancer primary tumor model and surgical removal of primary tumor to extend mouse life to generate spontaneous metastasis are described. The tumor growth and progression are monitored and quantified by luciferase fluorescence imaging.

Un modèle de souris orthotopique du sein spontané Cancer Métastase

Metastasis is the primary cause of mortality of breast cancer patients. The mechanism underlying cancer cell metastasis, including breast cancer ...

Intravital Microscopy and Thrombus Induction in the Earlobe of a Hairless Mouse

Thrombotic complications of vascular diseases are one leading cause of morbidity and mortality in industrial nations. Due to the complex interactions between cellular and non-cellular blood components during thrombus formation, reliable studies of the physiology and pathophysiology of thrombosis can only be performed in vivo. Therefore, this article presents an ear model in hairless mice and focuses on the in vivo analysis of microcirculation, thrombus formation, and thrombus evolution. By using intravital fluorescence microscopy and the intravenous (iv) application of the respective fluorescent dyes, a repetitive analysis of microcirculation in the auricle can easily be performed, without the need for surgical preparation. Furthermore, this model can be adapted for in vivo studies of different issues, including wound healing, reperfusion injury, or angiogenesis. In summary, the ear of hairless mice is an ideal model for the in vivo study of skin microcirculation in physiological or pathophysiological conditions and for the evaluation of its reaction to different systemic or topical treatments.

The ear model of the hairless SKH1-Hrhr mouse enables intravital fluorescence microscopy of microcirculation and phototoxic thrombus induction without prior surgical preparation in the examined microvascular bed. Therefore, the ear of the hairless mouse is an excellent in vivo model to study the complex interactions during microvascular thrombus formation, thrombus evolution, and thrombolysis.

Microscopie intravitale et thrombus induction dans le lobe de l&#39;oreille d&#39;une souris sans poils

Thrombotic complications of vascular diseases are one leading cause of morbidity and mortality in industrial nations. Due to the complex interactions ...