Pris en charge dans le cadre de subvention du NIH (R43/44CA122444) et subvention DOD BRCP (W81XWH-06-1-0682) à YL.

Une. Échantillon, équipements et Préparation des réactifs <ol><li> Couper échantillon de tissu en blocs de 3-4 mm d&#39;épaisseur, fixer à 10% de formol tamponné frais pour 16-32 heures à température ambiante (25 ° C) et de l&#39;intégrer dans de la paraffine. Couper FFPE en sections de 5 ± 1 um d&#39;épaisseur à partir de blocs FFPE, monter les coupes sur des lames et l&#39;air sec. Remarque: Les lames peuvent être stockées à température ambiante sous une dessiccation pendant jusqu&#39;à 3 mois. Les lames de tissus montés doivent être cuits dans un sèche-dessus à 60 ° C pendant 1 h avant l&#39;essai RNAscope. </li><li> Apportez hybridation Four à 40 ° C. Placez un papier d&#39;humidification dans le contrôle de l&#39;humidité du bac. Ajouter 50 ml dH 2 O au Livre d&#39;humidification pour mouiller complètement. Insérez le plateau couvert dans le four à préchauffer pendant au moins 30 min avant utilisation. </li><li> Faire 700 ml 1x Prétraitez 2 Solution (10 nl, tampon pH 6 citrate) par dilution 10x solution de prétraitement dans dH 2 O. Chauffer le 2 Solution 1x Pré-traiter à ébullition et maintain la température entre 100-104 ° C, tout en empêchant au cours d&#39;ébullition. </li><li> Assurez-3 L 1x Wash Buffer (0,1 x SSC) en diluant préchauffé 50x tampon de lavage en DH 2 O. </li><li> Préparer 2 x 200 ml de xylene et 2 x 200 ml d&#39;EtOH à 100% pour le déparaffinage sous une hotte de laboratoire. </li><li> Préparer solution à 50% de coloration hématoxyline et réactif de bleuissement (0,01% de l&#39;eau ammoniacale) pour le post-coloration sous une hotte. </li><li> Préparer 200 ml de xylène, 200 ml de 70% et 2 x 200 ml d&#39;EtOH à 100% pour la déshydratation sous une hotte de laboratoire. </li><li> Sondes Préchauffer cibles à 40 ° C pendant 10 min et apportent détection RTU réactif du kit à température ambiante, y compris RTU Amp1, Amp2, Amp3, AMP4, Amp 5-Brown, et AMP6-Brown, à l&#39;exception chromogène DAB Brown-A et Brown-B . </li></ol> 2. RNAscope Assay Déparaffinage et déshydratation Après la cuisson, Déparaffiner les coupes de tissus dans le xylène pour 2 x 5 min en agitant fréquemment, et déshydraterdans EtOH à 100% pour 2 x 3 min en agitant fréquemment. Séchage pendant 5 min et dessiner une barrière hydrophobe autour de la section de tissu avec une barrière hydrophobe Pen. Prétraitements <ol><li> Incuber les coupes de tissu avec une Pré-traiter pendant 10 min à température ambiante pendant la trempe de l&#39;activité de la peroxydase endogène, les rincer à dH 2 O. </li><li> Incuber les coupes de tissu avec Prétraitement deux maintenus à une température d&#39;ébullition pendant 15 minutes pour l&#39;extraction de l&#39;ARN, rincer deux fois dans dH 2 O. </li><li> Incuber les coupes de tissus avec Prétraitez 3 pendant 30 min à 40 ° C pour la digestion des protéines dans HybEZ four, rincer deux fois dans dH 2 O. </li></ol> Cible hybridation de la sonde sondes cibles HPV-HR 7 piscine comprennent: HPV16, 18, 31, 33, 35, 52, et 58. Ajouter sondes HPV, ubiquitine C (UBC) et bactériennes sondes dapB gène séparément sur trois sections de tissus de manière adjacente. S&#39;hybride à 40 ° C en étuve pendant 2h, puis rincer dans du tampon de lavage 1x pour 2 x 2 min à température ambiante. Amplification du signal <ol><li> Incuber les coupes de tissu avec Amp1 (préamplificateur) pendant 30 min à 40 ° C, Amp2 (fond réducteur) pendant 15 min à 40 ° C, Amp3 (amplificateur) pendant 30 min à 40 ° C, et AMP4 (sonde marqueur) pendant 15 min à 40 ° C dans un four HybEZ. Après chaque étape d&#39;hybridation, rincer dans du tampon de lavage 1x pour 2 x 2 min à température ambiante. </li><li> Incuber les coupes de tissu avec AMP5 pendant 30 min et AMP6 pendant 15 min à RT. Après chaque étape d&#39;incubation, dans un tampon de rinçage pour lavage de 1x 2 x 2 min à température ambiante. </li></ol> Détection du signal Incuber les coupes de tissu avec DAB Mélange 01:01 en mélangeant un volume égal de Brown-A et-B Brown pendant 10 min à température ambiante, laver deux fois dans dH 2 O. La contre-coloration <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; coupes de tissus de coloration avec une solution de 50% d&#39;hématoxyline pendant 2 min à température ambiante, laver avec dH 2 O jusqu&#39;à ce que les lames sont claires tandis que le tissu reste violet. Tremper les lames en 0,01% d&#39;ammoniac dans dH 2 O pour 5x et suivie avec 5 immersions dans dH 2 O. Glisser montage Déshydrater les coupes de tissu dans 70%, 100% et 100% de EtOH pendant 2 min chacun, le xylene pendant 5 min, monter avec un milieu de montage à base de xylène.

<ol>
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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+papillomavirus+and+survival+of+patients+with+oropharyngeal+cancer.">Human papillomavirus and survival of patients with oropharyngeal cancer.</a> N. Engl. J. Med. 363 (1), 24-35 (2010).</li><li>Smeets, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+algorithm+for+reliable+detection+of+human+papillomavirus+in+paraffin+embedded+head+and+neck+cancer+specimen.">A novel algorithm for reliable detection of human papillomavirus in paraffin embedded head and neck cancer specimen.</a> Int. J. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+RNA+in+situ+Hybridization+for+Detection+of+Restricted+Clonal+Expression+of+Low+Abundance+Immunoglobulin+Light+Chain+mRNA+in+B-Cell+Lymphoproliferative+Disorders.">Ultrasensitive RNA in situ Hybridization for Detection of Restricted Clonal Expression of Low Abundance Immunoglobulin Light Chain mRNA in B-Cell Lymphoproliferative Disorders.</a> Am. J. Surg. Pathol. In press, (2013).</li><li>Ukpo, O. C., Flanagan, J. J., Ma, X. J., Luo, Y., Thorstad, W. L., Lewis, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-risk+human+papillomavirus+E6/E7+mRNA+detection+by+a+novel+in+situ+hybridization+assay+strongly+correlates+with+p16+expression+and+patient+outcomes+in+oropharyngeal+squamous+cell+carcinoma.">High-risk human papillomavirus E6/E7 mRNA detection by a novel in situ hybridization assay strongly correlates with p16 expression and patient outcomes in oropharyngeal squamous cell carcinoma.</a> Am. J. Surg. Pathol. 35 (9), 1343-1350 (2011).</li><li>Lewis, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptionally-active+high-risk+human+papillomavirus+is+rare+in+oral+cavity+and+laryngeal/hypopharyngeal+squamous+cell+carcinomas--a+tissue+microarray+study+utilizing+E6/E7+mRNA+in+situ+hybridization.">Transcriptionally-active high-risk human papillomavirus is rare in oral cavity and laryngeal/hypopharyngeal squamous cell carcinomas--a tissue microarray study utilizing E6/E7 mRNA in situ hybridization.</a> Histopathology. 60 (6), 982-991 (2012).</li><li>Lewis, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+p16+staining+in+oropharyngeal+squamous+cell+carcinoma:+extent+and+pattern+correlate+with+human+papillomavirus+RNA+status.">Partial p16 staining in oropharyngeal squamous cell carcinoma: extent and pattern correlate with human papillomavirus RNA status.</a> Mod. Pathol. 25 (9), 1212-1220 (2012).</li><li>Bishop, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+transcriptionally+active+high-risk+HPV+in+patients+with+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+as+visualized+by+a+novel+E6/E7+mRNA+in+situ+hybridization+method.">Detection of transcriptionally active high-risk HPV in patients with head and neck squamous cell carcinoma as visualized by a novel E6/E7 mRNA in situ hybridization method.</a> Am. J. Surg. 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Pathol. Lab. Med. 134 (7), 48-72 (2010).</li></ol>

Tous les auteurs sont employés par et propres actions dans Advanced Diagnostics cellule, Inc.

Le test HPV RNAscope permis la visualisation directe de l&#39;ARNm E6/E7 in situ dans la tête associées au VPH et le cou carcinome épidermoïde. Le dosage RNAscope est entièrement compatible avec les tissus tumoraux couramment fixe et conserve la morphologie des tissus pour les corrélations histopathologiques (figure 2). Un avantage clé de l&#39;essai de RNAscope par rapport aux méthodes classiques de CISH est qu&#39;il amplifie spécifiquement les signaux d&#39;hybridation (figures 2B et 2E), sans amplifier le bruit de fond (figures 2C et 2F). Dans la pratique, la procédure de dosage RNAscope VPH peut être achevée dans un délai de 8 heures ou idéalement répartie sur deux jours. Le test HPV RNAscope a été utilisée pour déterminer le statut de HPV dans la tête et le cou carcinome spinocellulaire 12-16, démontrant 97% de sensibilité et 93% de spécificité en utilisant qRT-PCR comme méthode de référence 16. Chr classiqueISH omogenic pour HR HPV-ADN est très spécifique mais a une sensibilité de 80% ~ 12. Immunohistochimique (IHC) pour la coloration cellulaire de substitution marqueur p16 montre une excellente sensibilité mais peut générer des résultats faussement positifs, en particulier dans 15,18 cancers ORL nonoropharyngeal 15. La méthode actuelle de «l&#39;étalon or» de qRT-PCR pour le HPV ARNm E6/E7 détection nécessite tissu frais congelé pour des résultats optimaux et est techniquement complexe, ce qui limite son utilisation au laboratoire de recherche uniquement. En outre, il nécessite une extraction de l&#39;ARN qui fait qu&#39;il est impossible de corréler l&#39;expression HR-HPV avec de l&#39;ARNm E6/E7 histopathologie. Il ya plusieurs facteurs critiques pour le succès de l&#39;essai RNAscope. Tout d&#39;abord, pour de meilleurs résultats, les tissus doivent être fixés dans du formol 10% neutre tamponné frais à la température ambiante pendant 16-32 heures selon les directives ASCO / CAP 19. Deuxièmement, le four HybEZ est fortement recommandé car il permettres un contrôle optimal de la température et de l&#39;humidité pour la sonde d&#39;hybridation et de signaux étapes d&#39;amplification. En troisième lieu, il est important d&#39;éliminer tout excès de tampons résiduels avant chaque étape mais toujours garder la section de tissu de séchage au cours de l&#39;une de ces étapes. La procédure de RNAscope manuel décrit ici a été entièrement automatisé sur une lame système auto-coloration commerciale 10. Cela devrait grandement faciliter la normalisation des conditions d&#39;essai et d&#39;économie de travail manuel précieux dans les laboratoires de pathologie clinique. En outre, le logiciel d&#39;analyse d&#39;images dédié a été développé 10 pour identifier automatiquement les cellules et les signaux de coloration sur une lame numérisée, qui devrait contribuer à éliminer la subjectivité et améliorer la reproductibilité dans la notation. En résumé, le dosage RNAscope HPV détecte la présence de transcrits HR-HPV E6/E7 in situ d&#39;ARNm dans les tissus FFPE. Il dispose d&#39;un flux de travail qui est familier à la pathologie laboratoire cliniquetoires en permettant la visualisation directe de ceux-ci dans des coupes de tissus. Il dispose d&#39;une plate-forme idéale pour l&#39;examen (FFPE) des échantillons de tissus, et peut être facilement adopté par les laboratoires de pathologie de diagnostic.

Comptes papillomavirus humain à haut risque (HR-VPH) pour environ 5% de tous les cancers dans le monde 1. L&#39;incidence de cancer de l&#39;oropharynx associés au HPV a augmenté au cours des dernières décennies, surtout chez les hommes. oropharyngée carcinome épidermoïde de HPV-positif (OPSCC) constituera probablement une majorité de tous les cancers de la tête et du cou aux États-Unis au cours des 20 prochaines années 2. Carcinomes épidermoïdes de l&#39;oropharynx causées par le VPH sont associés à la survie favorable, et le statut de VPH de la tumeur est un facteur pronostique fort et indépendant pour la survie 3. Preuve de l&#39;activation transcriptionnelle des oncogènes viraux E6 et E7 est considéré comme l&#39;étalon-or pour la présence du VPH cliniquement pertinente 4. Cependant, la détection de l&#39;ARNm E6/E7 du tissu tumoral frais par la technique RT-PCR n&#39;est pas pratique, dans la pratique clinique de routine et est limitée à des laboratoires de recherche. Récemment, nous VHAe a développé une technologie ARN ISH roman intitulé RNAscope, qui permet une détection multiplex dans des cellules individuelles avec une seule molécule d&#39;ARN sensibilité des spécimens formol de paraffine fixe embarqués de tissus (FFPE) 5-10. Nous avons fourni trois sources de données pour la détection de molécule unique 5. Tout d&#39;abord, la conception et le signal système d&#39;amplification de la sonde RNAscope permis la détection de copie unique HER2 cibles d&#39;ADN génomique dans les cellules HeLa et SK-BR-3 lignées cellulaires. En second lieu, lorsqu&#39;on les compare avec des signaux d&#39;ADN génomique HER2, la distribution des intensités de fluorescence de HER2 ARNm points de signaux dans les cellules HeLa était compatible avec une molécule par point. Troisièmement, le nombre de points d&#39;ARNm de HER2 de signal par cellule adaptée étroitement le nombre de copies d&#39;ARNm de HER2 estimée par un essai de quantification à base de solution, supportant en outre une détection de molécule unique. En outre, une contre-coloration des noyaux avec DAPI en microscopie à fluorescence ou à l&#39;hématoxyline en microscopie à champ lumineux permet de visualiser les différents noyaux, which à son tour permet la détection et la quantification de cibles d&#39;ARN sur une base à cellule unique 10. La capacité d&#39;analyser l&#39;expression des gènes in situ dans des échantillons cliniques de routine RNAscope fait une plate-forme prometteuse pour la pathologie diagnostique, en particulier les analyses basées sur des sections de tissus FFPE 10,11. Nous avons mis au point un test de VPH à base RNAscope pour détecter l&#39;ARNm E6/E7 de sept génotypes VPH à risque élevé (HPV16, 18, 31, 33, 35, 52, et 58) à l&#39;aide d&#39;un pool de sondes spécifiques de génotype. Nos récentes études OPSCC ont montré que le test HPV est RNAscope très sensible et spécifique pour déterminer le statut de VPH sur les tissus FFPE 12-17, et informe également le pronostic dans OPSCC 12,16. Le principe de la technologie RNAscope a été décrit précédemment 5. Ici, nous décrivons le protocole complet d&#39;analyse de RNAscope et démontrer son utilisation dans la détection des HPV dans les sections de tissus tumoraux FFPE.

&#160;
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="580">
	<colgroup>
		<col span="4" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="39">
			<td height="60" rowspan="2" style="height:60px;width:145px;">SuperFrost Plus slides</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">12-550-15</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:145px;">HybEZ Oven, Tray, and Rack</td>
			<td style="width:145px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:145px;">310011, 310012, 310014</td>
			<td style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:145px;">RNAscope 2.0 FFPE Reagent Kit - Brown</td>
			<td style="width:145px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:145px;">310035</td>
			<td style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:145px;">RNAscope HPV-HR7 Probe for HPV 16,18,31,33,35,52 and 58, E6/E7 mRNA</td>
			<td style="width:145px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:145px;">312351</td>
			<td style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:145px;">ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen</td>
			<td style="width:145px;">Vector Laboratory</td>
			<td style="width:145px;">H-4000</td>
			<td style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="59">
			<td height="80" rowspan="2" style="height:80px;width:145px;">100% EtOH</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">American Master Tech Scientific</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">ALREAGAL</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:145px;">Xylene&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">X3P-1GAL</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="59">
			<td height="80" rowspan="2" style="height:80px;width:145px;">Gill&#8217;s Hematoxylin I</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">American Master Tech Scientific</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">HXGHE1LT</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="59">
			<td height="80" rowspan="2" style="height:80px;width:145px;">Ammonia hydroxide</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">320145-500mL</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="59">
			<td height="80" rowspan="2" style="height:80px;width:145px;">Cover Glass 24x50 mm</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">12-545-F</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:145px;">Hot Plate</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">11-300-49SHP</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="99">
			<td height="120" rowspan="2" style="height:120px;width:145px;">Drying Oven</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;"></td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;"></td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">Capable of holding temperature at 60 &#177; 1&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="99">
			<td height="120" rowspan="2" style="height:120px;width:145px;">Water Bath</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;"></td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;"></td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">Capable of holding temperature at 40 &#177; 1&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
	</tbody>
</table>

rnascope for in situ detection of transcriptionally active human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma

Le «gold standard» pour la détection du VPH oncogène est la démonstration de la transcription actif VPH à risque élevé dans le tissu tumoral. Cependant, la détection de l&#39;ARNm E6/E7 par transcription inverse quantitative en chaîne par polymérase (qRT-PCR) nécessite l&#39;extraction d&#39;ARN qui détruit contexte tissulaire de la tumeur critique pour la corrélation morphologique et a été difficile à adopter dans la pratique clinique de routine. Notre ARN récemment développé une technologie d&#39;hybridation in situ, RNAscope dans, permet la visualisation directe de l&#39;ARN dans fixés au formol, inclus en paraffine (FFPE) tissu avec une sensibilité de la molécule unique et de la résolution d&#39;une seule cellule, ce qui permet très sensible et spécifique dans l&#39;analyse in situ d&#39;un biomarqueur de l&#39;ARN dans les échantillons cliniques de routine. Le test HPV RNAscope a été conçu pour détecter l&#39;ARNm E6/E7 de sept génotypes de HPV à haut risque (HPV 16, 18, 31, 33, 35, 52, et 58) en utilisant un ensemble de sondes spécifiques de génotype. Il a démontré une excellente sensibilitéet la spécificité contre la méthode actuelle de «gold standard» de détection de l&#39;ARNm E6/E7 par qRT-PCR. statut de HPV déterminé par RNAscope est fortement pronostique des résultats cliniques chez les patients atteints d&#39;un cancer de l&#39;oropharynx.

RNAscope HPV test flux de travail Le dosage RNAscope a un flux de travail très simplifié qui est similaire à l&#39;IHC (figure 1). Il se compose de quatre grandes étapes: prétraitement, hybridation, amplifications de signal et de détection. Elle emploie une stratégie de conception de la sonde unique qui assure une haute fidélité amplification du signal 5. Dans le dosage RNAscope HPV, les sept ensembles de sondes HR-HPV sont mis en commun, tous reconnus par le même système d&#39;amplification de signal lié à la peroxydase de raifort (HRP). Des signaux d&#39;hybridation spécifiques sont détectées sous forme de précipités bruns formés par réaction catalysée par la HRP chromogène DAB en utilisant comme substrat, qui peut être aisément visualisée par microscopie à fond clair standard. Coloration Représentant pour la détection du VPH La figure 2 montre des exemples d&#39;images de sections FFPE colorées de la tête et du cou carcinome épidermoïde. Dans le cas de HPV-positif (figureure 2A), les sondes HR-HPV détecté des signaux de fortes ponctuées spécifiquement dans les cellules tumorales. La sonde UBC détectée nombreux signaux cytoplasmiques ponctuées dans les deux cellules tumorales et des cellules stromales (Figure 2B). La sonde de dapB gène bactérien a démontré un fond propre (figure 2C). Dans le cas de HPV-négatif, à la fois la sonde HR-HPV et la sonde dapB détecté aucun signal (figures 2D et 2F), tandis que les signaux forts ont été détectés par la sonde UBC (figure 2E). Dans ce dosage, UBC sert de contrôle positif pour évaluer la qualité de l&#39;ARN des tissus et dapB comme contrôle négatif pour les signaux de fond. La notation pour la détermination du statut de HPV consiste à examiner tous les trois diapositives pour chaque cas. Le niveau de coloration sur le coulisseau de commande négative (dapB) de glissement est utilisé comme seuil: HPV positivité est défini par la présence d&#39;cytoplasmique ponctuées et / ou une coloration nucléaire qui était au-dessus du signal sur le coulisseau dabpB. <pclass = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51426/51426fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51426/51426fig1.jpg" /> Figure 1. Organigramme de test RNAscope. Illustration de RNAscope essai workflow. Le dosage RNAscope contient 4 étapes principales, prétraitements, sonde cible hybridation, l&#39;amplification du signal et la détection du signal. La totalité de l&#39;expérience peut être complétée en 8 h. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51426/51426fig1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image.</a> <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51426/51426fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51426/51426fig2.jpg" /> Figure 2. images Exemple de diapositives RNAscope colorées sections FFPE colorées avec des sondes pour HR-HPV, UBC (contrôle positif) et dapB (contrôle négatif).à partir de deux cas de HNSCC. AC. cas de HPV-positif. A, HR-HPV expression de l&#39;ARNm E6/E7 dans les cellules tumorales. Encart, un grossissement de 40X à montrer des signaux de ponctuées. B et C) des coupes de tissus adjacents montrant une coloration positive de UBC (B) et négatif pour dapB (C), respectivement. DF) HPV-négatif cas. D) aucune coloration pour le VPH ARNm E6/E7 , similaire au contrôle négatif dapB (F). E) UBC coloration positive. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51426/51426fig2highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image.</a>

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RNAscope for In situ Detection of Transcriptionally Active Human Papillomavirus in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

La présence de VPH à risque élevé dans le tissu tumoral tête et du cou est associé à des résultats favorables. L&#39;ARN a récemment mis au point une technique d&#39;hybridation in situ appelé RNAscope permet la visualisation directe de l&#39;ARNm E6/E7 de HPV dans des coupes de tissu FFPE.

RNAscope pour<em&gt; In situ</em&gt; Détection des actifs de transcription virus du papillome humain dans la tête et du cou carcinome spinocellulaire

The &#39;gold standard&#39; for oncogenic HPV detection is the demonstration of transcriptionally active high-risk HPV in tumor tissue. However, detection ...

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Medicine

RNAscope for In situ Detection of Transcriptionally Active Human Papillomavirus in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

27.0K vues.  Advanced Cell Diagnostics, Inc..  La présence de VPH à risque élevé dans le tissu tumoral tête et du cou est associé à des résultats favorables. L'ARN a récemment mis au point une technique d'hybridation in situ appelé RNAscope permet la visualisation directe de l'ARNm E6/E7 de HPV dans des coupes de tissu FFPE. 

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Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-photon imagerie de l&#39;invasion des cellules tumorales dans un modèle de souris orthotopique du carcinome épidermoïde oral

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Recherche

Médecine

Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in either sporadic or familial (neurofibromatosis type 2, NF2) forms, both associated with inactivating defects in the NF2 tumor suppressor gene. Treatment for VSs is generally surgical resection or radiosurgery, however the morbidity of such procedures has driven investigations into less invasive treatments. Historically, lack of access to fresh tissue specimens and the fact that schwannoma cells are not immortalized have significantly hampered the use of primary cultures for investigation of schwannoma tumorigenesis. To overcome the limited supply of primary cultures, the immortalized HEI193 VS cell line was generated by transduction with HPV E6 and E7 oncogenes. This oncogenic transduction introduced significant molecular and phenotypic alterations to the cells, which limit their use as a model for human schwannoma tumors. We therefore illustrate a simplified, reproducible protocol for culture of primary human VS cells. This easily mastered technique allows for molecular and cellular investigations that more accurately recapitulate the complexity of VS disease.

Vestibular Schwannomas (VSs) are non-malignant tumors of Schwann cell (SC) origin, associated with mutations in the NF2 tumor suppressor gene. We report a reproducible, efficient protocol for primary human VS cell culture that allows for molecular and cellular experimental manipulation and analysis and recapitulates the heterogeneous nature of human disease.

Culture primaire de l&#39;homme vestibulaire schwannomes

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in ...

The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma

The chick chorioallantoic membrane (CAM) begins to develop by day 7 after fertilization and matures by day 12. The CAM is naturally immunodeficient and highly vascularized, making it an ideal system for tumor implantation. Furthermore, the CAM contains extracellular matrix proteins such as fibronectin, laminin, collagen, integrin alpha(v)beta3, and MMP-2, making it an attractive model to study tumor invasion and metastasis. Scientists have long taken advantage of the physiology of the CAM by using it as a model of angiogenesis. More recently, the CAM assay has been modified to work as an in vivo xenograft model system for various cancers that bridges the gap between basic in vitro work and more complex animal cancer models. The CAM assay allows for the study of tumor growth, anti-tumor therapies, and pro-tumor molecular pathways in a biologically relevant system that is both cost- and time-effective. Here, we describe the development of CAM xenograft model of hepatocellular carcinoma (HCC) with embryonic survival rates of up to 93% and reliable tumor take leading to growth of three-dimensional, vascularized tumors.

The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane CAM Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma

The chick chorioallantoic membrane (CAM) is immunodeficient and highly vascularized, making it a natural in vivo model of tumor growth and angiogenesis. In this protocol, we describe a reliable method of growing three-dimensional, vascularized hepatocellular carcinoma (HCC) tumors using the CAM assay.

La<em&gt; En Ovo</em&gt; Chick chorioallantoïque membrane (CAM) Assay comme un modèle de xénogreffe efficace de carcinome hépatocellulaire

The chick chorioallantoic membrane (CAM) begins to develop by day 7 after fertilization and matures by day 12. The CAM is naturally immunodeficient and ...

Isolation and Characterization of a Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Subpopulation Having Stem Cell Characteristics

Despite advances in the understanding of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC) progression, the five-year survival rate remains low due to local recurrence and distant metastasis. One hypothesis to explain this recurrence is the presence of cancer stem-like cells (CSCs) that present inherent chemo- and radio-resistance. In order to develop new therapeutic strategies, it is necessary to have experimental models that validate the effectiveness of targeted treatments and therefore to have reliable methods for the identification and isolation of CSCs. To this end, we present a protocol for the isolation of CSCs from human HNSCC cell lines that relies on the combination of two successive cell sortings performed by fluorescence activated cell sorting (FACS). The first one is based on the property of CSCs to overexpress ATP-Binding Cassette (ABC) transporter proteins and thus exclude, among others, vital DNA dyes such as Hoechst 33342. The cells sorted with this method are identified as a &#34;side population&#34; (SP). As the SP cells represent a low percentage (&#60;5%) of parental cells, a growing phase is necessary in order to increase their number before the second cell sorting. The next step allows for the selection of cells that possess two other HNSCC stem cell characteristics i.e. high expression level of the cell surface marker CD44 (CD44high) and the over-expression of aldehyde dehydrogenase (ALDHhigh). Since the use of a single marker has numerous limitations and pitfalls for the isolation of CSCs, the combination of SP, CD44 and ALDH markers will provide a useful tool to isolate CSCs for further analytical and functional assays requiring viable cells. The stem-like characteristics of CSCs was finally validated in vitro by the formation of tumorispheres and the expression of &#946;-catenin.

Understanding the role of cancer stem-like cells in tumor recurrence and resistance to therapies has become a topic of great interest in the last decade. This article describes the isolation and characterization of the sub-population of cancer stem-like cells from head and neck squamous carcinoma cell lines (HNSCC).

Isolement et caractérisation d&#39;une tête et du cou squameux Carcinome Sous-population Ayant les cellules souches Caractéristiques

Despite advances in the understanding of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC) progression, the five-year survival rate remains low due to local ...

Posterior Semicircular Canal Approach for Inner Ear Gene Delivery in Neonatal Mouse

Inner ear gene therapy offers great promise as a potential treatment for hearing loss and dizziness. One of the critical determinants of the success of inner ear gene therapy is to find a delivery method which results in consistent transduction efficiency of targeted cell types while minimizing hearing loss. In this study, we describe the posterior semicircular canal approach as a viable method for inner ear gene delivery in neonatal mice. We show that gene delivery through the posterior semicircular canal is able to perfuse the entire inner ear. The easy anatomic identification of the posterior semicircular canal, as well as minimal manipulation of the temporal bone required, make this surgical approach an attractive option for inner ear gene delivery.

In this study, we describe the posterior semicircular canal approach as a reliable method for inner ear gene delivery in neonatal mice. We show that gene delivery through the posterior semicircular canal is able to perfuse the entire inner ear.

Approche postérieure Canal semicirculaire pour la livraison de gène oreille interne chez les souris néonatales

Inner ear gene therapy offers great promise as a potential treatment for hearing loss and dizziness. One of the critical determinants of the success of ...

In Vivo Morphometric Analysis of Human Cranial Nerves Using Magnetic Resonance Imaging in Meni&#232;re's Disease Ears and Normal Hearing Ears

Analysis of neural structures in Meni&#232;re's Disease (MD) is of importance, since a loss of such structures has previously been proposed for this patient group but has yet to be confirmed. This protocol describes a method of in vivo evaluation of neural changes especially well suitable for cranial nerve analysis using magnetic resonance imaging (MRI). MD-patients and normal hearing persons were examined in a 3-T MR-scanner using a scan protocol including strongly T2-weighted 3D gradient-echo-sequence (3D-CISS). In the patient group, MD was additionally confirmed using MRI-based assessment of endolymphatic hydrops. Morphometric analysis was performed using a freeware DICOM viewer. Evaluation of cranial nerves included measurements of cross-sectional areas (CSAs) of the nerves at different levels as well as orthogonal diametric measurements.

&lt;em&gt;In Vivo&lt;/em&gt; Morphometric Analysis of Human Cranial Nerves Using Magnetic Resonance Imaging in Meni&amp;#232;re&#039;s Disease Ears and Normal Hearing Ears

To evaluate morphological changes of cranial nerves such as loss of neural structures or swelling of cranial nerves in Meni&#232;re&#39;s Disease (MD) or in healthy persons in vivo, a protocol of evaluation has been developed using magnetic resonance imaging (MRI). Additional MRI-based confirmation of MD was performed.

In Vivo Analyse morphométrique des humains nerfs crâniens à l’aide de l’imagerie par résonance magnétique oreilles maladie de Menière et des oreilles de l’audition normale

Analysis of neural structures in Meni&#232;re's Disease (MD) is of importance, since a loss of such structures has previously been proposed for this ...

Porcine As a Training Module for Head and Neck Microvascular Reconstruction

Live models that resemble surgical conditions of humans are needed for training free-flap harvesting and anastomosis. Animal models for training purposes have been available for years in many surgical fields. We used the female (because they are easy to handle for the procedure) Yorkshire pigs for the head and neck reconstruction by harvesting the deep inferior epigastric artery perforator or the superior epigastric artery perforator flap. The anastomosis site (neck skin defect or tracheal wall defect) was prepared via the dissection of the common carotid artery and the internal jugular vein, in which 3.5&#215; loupe magnification was used for anastomosis as we use on human cases in real life. This procedure demonstrates a new training method using a reliable learning model and provides a detailed anatomy in a live scenario. We focused on the ischemia time, harvesting, vessel anastomosis, and designing the flap to fit the defect site. This model improves tissue handling and with the use of proper instruments can be repeated many times so that the surgeon is fully confident before starting the surgery on humans.

Here we present a protocol for the use of the pig superior epigastric artery perforator flap as a learning module for head and neck microvascular reconstruction.

Porcine comme un Module de formation pour la tête et du cou Reconstruction microvasculaire

Live models that resemble surgical conditions of humans are needed for training free-flap harvesting and anastomosis. Animal models for training purposes ...

The Chick Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Assess Perineural Invasion in Head and Neck Cancer

Perineural invasion is a phenotype in which cancer surrounds or invades the nerves. It is associated with poor clinical outcome for head and neck squamous cell carcinoma and other cancers. Mechanistic studies have shown that the molecular crosstalk between nerves and tumor cells occurs prior to physical interaction. There are only a few in vivo models to study perineural invasion, especially to investigate early progression, before physical nerve-tumor interactions occur. The chick chorioallantoic membrane model has been used to study cancer invasion, because the basement membrane of the chorionic epithelium mimics that of human epithelial tissue. Here we repurposed the chick chorioallantoic membrane model to investigate perineural invasion, grafting rat dorsal root ganglia and human head and neck squamous cell carcinoma cells onto the chorionic epithelium. We have demonstrated how this model can be useful to evaluate the ability of cancer cells to invade neural tissue in vivo.&#160;

The Chick Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Assess Perineural Invasion in Head and Neck Cancer

Perineural invasion is an aggressive phenotype for head and neck squamous cell carcinomas and other tumors. The chick chorioallantoic membrane model has been used for studying angiogenesis, cancer invasion, and metastasis. Here we demonstrate how this model can be utilized to assess perineural invasion in vivo.

Le modèle Chick Chorioallantoic Membrane In Vivo pour évaluer l'invasion périnéale dans le cancer de la tête et du cou

Perineural invasion is a phenotype in which cancer surrounds or invades the nerves. It is associated with poor clinical outcome for head and neck squamous ...

Learning Modern Laryngeal Surgery in a Dissection Laboratory

Surgery for laryngeal malignancies requires millimetric accuracy from the different endoscopic and open techniques available. Practice of this surgery is almost completely reserved to a few referral centers that deal with a large proportion of this pathology. Practice on human specimens is not always possible for ethical, economic, or availability reasons. The aim of this study is to provide a reproducible method for the organization of a laryngeal laboratory on ex vivo animal models where it is possible to approach, learn, and refine laryngeal techniques. Porcine and ovine larynges are ideal, affordable, models to simulate laryngeal surgery given their similarity to the human larynx in their anatomical layout and tissue composition. Herein, the surgical steps of transoral laser surgery, open partial horizontal laryngectomy, and total laryngectomy are reported. The merging of endoscopic and exoscopic views guarantees an inside-out perspective, which is vital for the comprehension of the complex laryngeal anatomy. The method was successfully adopted during three sessions of a dissection course &#34;Lary-Gym&#34;. Further perspectives on robotic surgical training are described.

The purpose of this paper is to illustrate how to organize a reproducible laboratory for laryngeal surgery on affordable and closely similar animal laryngeal models in order to improve anatomical and surgical knowledge and skills.

Apprendre la chirurgie laryngeale moderne dans un laboratoire de dissection

Surgery for laryngeal malignancies requires millimetric accuracy from the different endoscopic and open techniques available. Practice of this surgery is ...

Preparation of Decellularized Kidney Scaffolds in Rats

Tissue engineering is a cutting-edge discipline in biomedicine. Cell culture techniques can be applied for regeneration of functional tissues and organs to replace diseased or damaged organs. Scaffolds are needed to facilitate the generation of three-dimensional organs or tissues using differentiated stem cells in vivo. In this report, we describe a novel method for developing vascularized scaffolds using decellularized rat kidneys. Eight-week-old Sprague-Dawley rats were used in this study, and heparin was injected into the heart to facilitate flow into the renal vessels, allowing heparin to perfuse into the renal vessels. The abdominal cavity was opened, and the left kidney was collected. The collected kidneys were perfused for 9 h using detergents, such as Triton X-100 and sodium dodecyl sulfate, to decellularize the tissue. Decellularized kidney scaffolds were then gently washed with 1% penicillin/streptomycin and heparin to remove cellular debris and chemical residues. Transplantation of stem cells with the decellularized vascular scaffolds is expected to facilitate the generation of new organs. Thus, the vascularized scaffolds may provide a foundation for tissue engineering of organ grafts in the future.

This protocol introduces a method to develop a scaffold using decellularized rat kidneys. The protocol includes decellularization and recellularization processes to confirm bioavailability. Decellularization is performed using Triton X-100 and sodium dodecyl sulfate.

Préparation d’échafaudages rénaux décellulaires chez le rat

Tissue engineering is a cutting-edge discipline in biomedicine. Cell culture techniques can be applied for regeneration of functional tissues and organs ...