Cette étude a été financée par des subventions du NIH R01HL091020, R01HL093723, R01AI077343 et R01GM096187.

1. Isolément les globules rouges du sang total <ol><li> Préparer EAS-45 solutions. Pesez tous les ingrédients dans le tableau I et dissoudre dans 100-200ml d&#39;eau déminéralisée. Ajouter de l&#39;eau pour préparer une solution 1000ml et ajuster le pH à 8,0. Filtrez et aliquote de 50 ml. Congeler à -20 ° C pour le stockage. </li></ol> Remarque: l&#39;étape 1.2 doit être effectuée par un médecin formé professionnel comme une infirmière, avec un Institutional Review Board protocole approuvé. <ol start="2"><li> Dessinez 3-5ml de sang de la veine médiane cubitale dans un tube de 10ml contenant de l&#39;EDTA et mélanger délicatement le sang avec EDTA immédiatement et abondamment pour éviter la coagulation. </li><li> Échantillon de sang processus dès que possible. Toutes les étapes suivantes, sauf centrifugation devrait être fait sous le capot de garder la préparation stérile. Transfert du sang dans un tube de 50ml centrifugeuse, ajouter 10ml de Histopaque froide et stérile 1077 et centrifuger pendant 5 min @ 1000rpm, 4 ° C. Répéter deux fois. </li><li> Ajouter 10ml de PBS froid et stérile, centrifuger pendant 5 min @ 1000rpm, 4 ° C. Enlever le surnageant. Répétez 4 fois (5 fois au total). </li><li> Laver à l&#39;stériles EAS-45 (5min @ 1000rpm, 4 ° C) à deux reprises. Pendant les dernières globules rouges se laver dans un nouveau tube 15ml stérile. </li><li> Resuspendre globules rouges EAS-45 in10ml. </li></ol> 2. Biotinylation globules rouges <ol><li> Prenez le tube avec les globules rouges de l&#39;étape 1. Retirez tous surnageant après centrifugation pendant 5 min @ 1000rpm, 4 ° C. Mettez 10 pi de globules rouges granulés à chacun de plusieurs flacons et ajouter le montant correspondant de PBS dans chaque flacon (voir tableau II pour exemple de préparation de six concentrations différentes globules rouges biotinylation). </li><li> Faire frais Biotin-X-NHS/DMF 1:10, 1:100 dilutions selon le tableau II. </li><li> Ajouter 10 pi de tampon borate 0,1 M à chaque flacon. </li><li> Ajouter la quantité calculée de solution de biotine dans chaque flacon (voir tableau II comme, par exemple) et le vortex immédiatement. </li><li> Placer chaque flacon de RBCintérieur d&#39;un tube conique de 50 ml et incuber sur des rotateurs pendant 30min à température ambiante. </li><li> Laver chaque flacon 3 fois avec 800μl d&#39;EAS-45 pour 2min @ 2000rpm. </li><li> Ajouter 100 pi d&#39;EAS-45 à chaque flacon et stocker à 4 ° C. Dans chaque 1 microlitre de la solution finale doit être désormais ~ 1mln des globules rouges. </li></ol> 3. La fonctionnalisation de la biotine * lié ligands sur les globules rouges <ol><li> Préparer 2mg/ml streptavidine solution selon les instructions du fabricant. Solution Aliqouted peuvent être stockés à -20 ° C. </li><li> Mélangez une quantité égale de globules rouges de l&#39;étape 2.7 (10 ul) avec une solution de streptavidine, vortex immédiatement et incuber sur des rotateurs pendant 30min à 4 ° C. </li><li> Laver 3 fois avec 500μl d&#39;EAS-45 pour 2min @ 2000rpm. Ajouter 15μl EAS-45% de BSA / 1 pour le stockage. </li><li> Mélanger la même quantité de globules rouges de l&#39;étape 3.3 (10 ul) avec solution de ligand 20μg/ml, vortex immédiatement et incuber sur des rotateurs pendant 30min à température ambiante. </li><li> Laver deux fois avec 500μl d&#39;EAS-BSA 45 / 1% pour 2min @ 2000rpm. Ajouter 15μl de BSA EAS-45 / 1% pour le stockage. </li></ol> * Si votre protéine n&#39;a aucun lien de biotine, vous pouvez utiliser un des kits disponibles dans le commerce d&#39;une biotinylation de protéines (par exemple, Thermo Scientific # 21955 EZ-Link Micro-NHS-PEG4 Biotinylation Kit) ou d&#39;utiliser des anticorps biotinylés capture comme une étape intermédiaire comme le montre dans la vidéo. 4. Quantification des densités de récepteurs et des ligands <ol><li> Incuber ligand enduit de globules rouges de l&#39;étape 3 et, dans un autre flacon, porteurs de récepteurs des cellules avec des concentrations saturantes de mAb respectifs pendant 30min à température ambiante. Incuber les cellules avec des flacons séparés pertinent apparié par isotype des anticorps pour le contrôle. Si les anticorps primaires ne sont pas marqués par fluorescence, incuber avec fluorescence des anticorps secondaires conjugués conformément aux instructions du fabricant. </li><li> Analyser des échantillons préparés à l&#39;étape 4.1 par cytometery débit avec correspondants fluorescentes calperles ibration. Calculer la densité, comme indiqué dans la Fig. 1. </li></ol> 5. Préparation pour micropipette et la chambre cellulaire <ol><li> Tirez Micropipettes de tubes capillaires en utilisant PN-30 Narishige &#39;extracteur magnétique microélectrodes de verre horizontale ou Sutter Instruments Micropipette Puller. </li><li> Utilisez micromanipulateur avec microforge d&#39;ajuster la pointe de la micropipette tiré à une taille souhaitée (généralement les plages de diamètre requis de 1-5 pm en fonction de la taille des cellules pour être utilisé dans l&#39;étude). </li><li> Préparer la chambre de la cellule en coupant le verre Couvercle Microscope à la taille désirée. Sceau de la chambre de l&#39;huile minérale à l&#39;aide des deux côtés pour éviter l&#39;évaporation moyenne de changer l&#39;osmolarité pendant l&#39;expérience. </li><li> Ajouter les cellules réceptrices et ligand-portant à la chambre. </li></ol> 6. Dosage de la fréquence d&#39;adhérence Micropipette <ol><li> Aspirer les cellules interagissant par des pipettes respectifs et l&#39;utilisation des ordinateurs programmés piezoelectr<html> Traducteur IC à conduire le RBC dans et hors de contact avec l&#39;autre cellule avec la zone de contact contrôlé et le temps. Détecter des événements d&#39;adhérence en observant un allongement de RBC sur la séparation des cellules. </li><li> Répétez le cycle de contact-rétraction 50-100 fois pour un temps de contact donné. Enregistrez les événements d&#39;adhésion observés en ajoutant &quot;1&quot; pour l&#39;adhésion ou &quot;0&quot; pour aucune adhérence dans une colonne de tableur Excel. Vous pouvez utiliser un appareil d&#39;enregistrement, par exemple, les médias numériques ou vidéo, pour les images microscopiques. </li><li> Enregistrement de la fréquence d&#39;adhérence en fonction courbe de temps de contact en utilisant au moins trois paires de cellules différentes pour chaque temps de contact pour obtenir une moyenne et SEM. </li><li> Enregistrer la courbe de fixation non spécifiques pour le contrôle en utilisant les globules rouges enduits de ligands non pertinentes (par exemple, BSA) et / ou le blocage des ligands ou des récepteurs utilisant leur Acm spécifiques blocus fonctionnelle. Fréquence d&#39;adhésion spécifiques à chaque point de temps de contact peut être calculée par l&#39;élimination de la fréquence d&#39;adhérence non spécifique 1. </li></ol>ove_title &quot;&gt; 7. Analyse des données <ol><li> Monter la fréquence d&#39;adhésion spécifiques données par rapport à P un temps de contact t par un modèle probabiliste (équation 1) qui décrit un second ordre de l&#39;avant et de premier ordre inverse, en une seule étape d&#39;interaction entre une espèce unique de récepteurs et une seule espèce de ligands 1 : <img alt="L&#39;équation 1" src="/files/ftp_upload/3519/3519eq1.jpg" /> où K a est la 2D affinités efficaces contraignant, k est hors du hors-taux, R et M m L sont les récepteurs respectifs et des densités de ligand mesurée à l&#39;étape 4, et A c est la zone de contact. La courbe d&#39;ajustement a deux paramètres, A c K a et k off, comme un C et K a sont regroupés et ont appelé collectivement comme une affinité 2D efficace. Son produit avec le hors-taux est le effective 2D sur des taux: un </em&gt; c = k sur A c K un k x off. L&#39;adhérence spécifique de fréquence P a est calculée par soustraction de la fraction d&#39;adhérence non spécifique (P non spécifique) de l&#39;adhésion totale mesurée (P mesurée) 1,21: <img alt="Équation 2" src="/files/ftp_upload/3519/3519eq2.jpg" /></li></ol> 8. Les résultats représentatifs: <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3519/3519fig1.jpg" /> Figure 1: Détermination de l&#39;intégrine α L β 2 densité du site sur les neutrophiles. Les neutrophiles ont d&#39;abord été incubées avec des 1μg/ml E-sélectine-Ig pour 10min pour correspondre à la condition expérimentale utilisée dans les figures 3,4 ou sans E-sélectine-Ig, et ensuite avec des concentrations saturantes (10μg/ml) de PE-conjugué anti- -humain CD11a mAb (Clone HI111, voir le tableau des particuliersréactifs et du matériel) ou IgG1 de souris non pertinentes pour le contrôle, lavées, et analysées immédiatement. Les échantillons ont été lus sur cytomètre de flux BD LSR avec des perles QuantiBRITE étalon PE. Le panneau A montre les histogrammes de fluorescence des billes de calibration (rose) avec celles de la E-sélectine-Ig cellules traitées (couleur bleu) ou non traitées (couleur verte). Spécifiques CD11a mAb coloration est montré dans les courbes solides et pertinents coloration apparié par isotype d&#39;anticorps de contrôle est représenté dans les courbes en pointillés. Les cellules traitées avec la E-sélectine-Ig (présence dans tous les étapes de lavage et dans un tampon de FACS) n&#39;a pas d&#39;incidence sur la densité CD11a vu de la comparaison avec les cellules non traitées. Groupe B montre le processus de quantification de densité. Log10 a été calculé pour l&#39;intensité moyenne fluorescentes (FI) de chaque valeur de crête de quatre histogrammes billes de calibration à partir du Panneau A (cercles roses) et pour les molécules PE spécifique du lot par bille (du fabricant). Une régression linéaire de molécules PE Log10 par bille contre la Log10 fluorescrence a été tracée. Pour la E-sélectine des cellules traitées Log10 FI (y) des valeurs égales 3,99 (cercle bleu solide) et 2,23 (bleu cercle ouvert) pour des anticorps monoclonaux spécifiques et des anticorps de contrôle, respectivly. Nous avons résolu l&#39;équation linéaire pour x (les valeurs sont tracées comme des cercles vert et bleu sur le panneau B) x = log10 PE / cellule et, comme PE:. Ratio de mAb était de 1:1, le nombre total d&#39;α L β 2 sur les neutrophiles était calculé comme 9587. La densité de surface a été calculée à 43 molécules / um 2, en utilisant 8.4μm que le diamètre des neutrophiles 22. Densité de ICAM-1 était également mesurée par écoulement à l&#39;aide cytometery PE-anti-humains CD54 monoclonal, ce qui équivalait à 65 mol / um 2. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3519/3519fig2.jpg" /> Figure 2 schémas des systèmes Micropipette. Notre système micropipette a été assemblé dans la maison et se compose de trois sous-systèmes: un sous-système d&#39;imagerie permettant d&#39;observer, record et d&#39;analyser les mouvements de la cellule micropipette-atmosphérique; un sous-système de micromanipulation pour permettre de sélectionner les cellules de la chambre de la cellule, et un sous-système de pression pour permettre d&#39;aspirer les cellules dans des micropipettes. La pièce centrale du sous-système d&#39;imagerie est microscope inversé (Olympus IMT-2 IMT2) avec un objectif à immersion 100x 1,25 NA. L&#39;image est envoyée à un enregistreur de cassette vidéo à travers un dispositif à couplage de charge (CCD). Une minuterie vidéo est couplé au système de garder trace du temps. Chaque micropipette peut être manipulé par un entraînement mécanique montée sur le microscope et finement positionné avec un micromanipulateur trois axes hydrauliques. Manipulateurs mécaniques de Newport pourrait être utilisé aussi bien. L&#39;un des détenteurs micropipette est monté sur un translateur piézoélectrique, le conducteur est contrôlé par un code informatique LabView (disponible sur demande) et les traduit signal à travers une carte DAQ via un amplificateur de tension (fait maison) à l&#39;actionneur piézo-électrique. Ceci est unllows de se déplacer la pipette précise et reproductible dans un cycle de test d&#39;adhérence. Le sous-système de régulation de pression est utilisé pour contrôler d&#39;aspiration pendant l&#39;expérience. Une ligne hydraulique relie le titulaire micropipette à un réservoir de fluide. Un positionneur mécanique fine permet à la hauteur du réservoir pour être manipulé avec précision. Micropipettes sont générés en utilisant la fusion Kimax tubes capillaires en verre borosilicate points (avec un diamètre extérieur de 1,0 ± 0,07 mm et un diamètre intérieur de 0,7 ± 0,07 mm. Abord, les micropipettes de tubes capillaires sont tirés à l&#39;aide PN-30 Narishige &#39;extracteur magnétique microélectrodes de verre horizontale (Sutter Instruments Micropipette Extracteur est une autre option extracteur). Deuxièmement, le système microforge (construit dans la maison) est utilisé pour couper les micropipettes à l&#39;ouverture de la taille désirée. modèles commerciaux de systèmes microforge sont disponibles aussi bien. Pour éviter les vibrations de l&#39;micropipettes pendant l&#39;expérience, le microscOPE, avec les micromanipulateurs, est placé sur une table de suspension à air. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3519/3519fig3.jpg" /> Figure 3 Exécution fréquence F i pour une adhérence spécifique (A) et non spécifiques (B) se liant à 1s (rouge) et 10s temps de contact (en bleu) mesurée à partir des cycles répétés test d&#39;adhérence entre les globules rouges revêtus d&#39;ICAM-1 (A) ou hIgG (B ) avec des neutrophiles humains exprimant l&#39;intégrine α L β 2. F i = (X 1 + X 2 + ... + X i) / i (1 ≤ i ≤ n), où i est l&#39;indice du cycle d&#39;essai, X i est égal à &quot;1&quot; (adhérence) ou &quot;0&quot; (pas d&#39;adhérence). F n (n = 50) a été utilisé comme la meilleure estimation de la probabilité d&#39;adhérence. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3519/3519fig4.jpg" /> Figure 4 Cinétique deICAM-1 se liant à des neutrophiles intégrine β α L 2 ( <img alt="Place" src="/files/ftp_upload/3519/3519sq1.jpg" /> ). La probabilité d&#39;adhésion mesurée, comme illustré dans la Figure 3 pour les trois paires de cellules à chaque temps de contact est en moyenne et la portée en fonction du temps de contact. Le milieu de chambre a été HBSS avec 1 mM chacun de Ca 2 + et Mg 2 + en plus du dimère 1μg/ml E-sélectine-Ig à réguler positivement β α 2 L contraignant. Pour capturer l&#39;ICAM-1-Ig sur les globules rouges, une étape intermédiaire a été ajouté à incuber avec des anticorps de capture globules rouges 10μg/ml (biotinylé de chèvre anti-anticorps humain Fc, eBioscience) après l&#39;étape d&#39;incubation streptavidine. Pour contrôler la liaison non spécifique deux conditions différentes ont été utilisées: 1) les globules rouges enduits de l&#39;anticorps de capture anti-humain-Fc et incubées avec des IgG humaines au lieu d&#39;ICAM-1-Ig (O) et 2) se liant à des neutrophiles globules rouges n&#39;est pas revêtu de la captage d&#39;anticorps (Δ). 10μg/ml IgG humaines a été ajouté au milieu afin de minimiser la liaison de E-Sélectine-Ig dans la solution d&#39;anticorps de capture sur la surface du globule. La liaison non spécifique enregistrée IgG humaines contrôle de la courbe a été utilisée pour obtenir une courbe d&#39;adhérence spécifiques probabilité ( <img alt="Place" src="/files/ftp_upload/3519/3519sq2.jpg" /> ) En utilisant l&#39;équation. 2. Ajustement de courbe spécifiques de probabilité d&#39;adhésion avec Eq. 1 (ligne continue) retourné efficaces affinité de liaison A, K = 1,4 c une μm4 • 10 -4 et k off = 0,3 s -1. <table border="1"><tbody><tr><th> Réactif </th><th> MW (g / mol) </th><th> Concentration (mM) </th><th> Montant (g) </th></tr><tr><td> Adénine </td><td> 135,13 </td><td> 2 </td><td> 0,27 </td></tr><tr><td> D-glucose (dextrose) </td><td> 180,16 </td><td> 110 </td><td> 19,82 </td></tr><tr><td> D-mannitol </td><td> 182,17 </td><td> 55 </td><td> 10,02 </td></tr><tr><td> Chlorure de sodium (NaCl) </td><td> 58,44 </td><td>50 </td><td> 2,92 </td></tr><tr><td> Phosphate de sodium dibasique (Na HPO ) </td><td> 141,95 </td><td> 20 </td><td> 2,84 </td></tr><tr><td> L-glutamine </td><td> 146,15 </td><td> 10 </td><td> 1,46 </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Préparation EAS-45 tampon (1L). <table border="1"><tbody><tr><td> 25 mg de biotine dans 550 ul XHS de DMF </td><td> 0,1 M biotine solution </td></tr><tr><td> Dilution 1:10 de 0,1 biotine w / DMF </td><td> 0,01 biotine solution </td></tr><tr><td> 1:100 dilution de 0,1 biotine w / DMF </td><td> 0,001 M la biotine solution </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Préparation de la solution de biotine. <table border="1"><tbody><tr><th> biotine concentration finale (M) </th><th> 4 </th><th> 10 </th><th> 20 </th><th> 50 </th><th> 100 </th><th> 160 </th></tr><tr><td> Globules rouges granulés de stock (ul) </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 1x PBS (ul) </td><td> 179,2 </td><td> 178 </td><td> 176 </td><td> 179 </td><td> 178 </td><td> 176,8 </td></tr><tr><td> 0,1 M de tampon borate (ul) </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 0,01 biotine solution (ul) </td><td></td><td></td><td></td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3.2 </td></tr><tr><td> 0,001 M la biotine solution (ul) </td><td> 0.8 </td><td> 2 </td><td> 4 </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tableau 3. Biotinylation de globules rouges.

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Immunol. 181, 6843-6849 (2008).</li><li>Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinetics+of+two-dimensional+TCR+and+pMHC+interactions+determine+T-cell+responsiveness.">The kinetics of two-dimensional TCR and pMHC interactions determine T-cell responsiveness.</a> Nature. 464, 932-936 .</li><li>Sabatino, J. J., Huang, J., Zhu, C., Evavold, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+prevalence+of+low+affinity+peptide-MHC+II+tetramer-negative+effectors+during+polyclonal+CD4++T+cell+responses.">High prevalence of low affinity peptide-MHC II tetramer-negative effectors during polyclonal CD4+ T cell responses.</a> J. Exp. Med. 208, 81-90 (2011).</li><li>Jiang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-stage+cooperative+T+cell+receptor-peptide+major+histocompatibility+complex-CD8+trimolecular+interactions+amplify+antigen+discrimination.">Two-stage cooperative T cell receptor-peptide major histocompatibility complex-CD8 trimolecular interactions amplify antigen discrimination.</a> Immunity. 34, 13-23 (2011).</li><li>Spillmann, C. M., Lomakina, E., Waugh, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+adhesive+contact+dependence+on+impingement+force.">Neutrophil adhesive contact dependence on impingement force.</a> Biophys. J. 87, 4237-4245 (2004).</li><li>Zhu, C., Williams, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+concurrent+binding+of+multiple+molecular+species+in+cell+adhesion.">Modeling concurrent binding of multiple molecular species in cell adhesion.</a> Biophys. J. 79, 1850-1857 (2000).</li><li>Downey, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retention+of+leukocytes+in+capillaries:+role+of+cell+size+and+deformability.">Retention of leukocytes in capillaries: role of cell size and deformability.</a> J. Appl. Physiol. 69, 1767-1778 (1990).</li><li>Li, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+and+kinetic+analysis+of+Fcgamma+receptor+IIIa+(CD16a)+binding+to+IgG+ligands.">Affinity and kinetic analysis of Fcgamma receptor IIIa (CD16a) binding to IgG ligands.</a> J. Biol. Chem. 282, 6210-6221 (2007).</li><li>Chen, W., Zarnitsyna, V. I., Sarangapani, K. K., Huang, J., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Receptor-Ligand+Binding+Kinetics+on+Cell+Surfaces:+From+Adhesion+Frequency+to+Thermal+Fluctuation+Methods.">Measuring Receptor-Ligand Binding Kinetics on Cell Surfaces: From Adhesion Frequency to Thermal Fluctuation Methods.</a> Cell. Mol. Bioeng. 1, 276-288 (2008).</li><li>Thoumine, O., Kocian, P., Kottelat, A., Meister, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+binding+of+fibroblasts+to+fibronectin:+optical+tweezers+experiments+and+probabilistic+analysis.">Short-term binding of fibroblasts to fibronectin: optical tweezers experiments and probabilistic analysis.</a> Eur. Biophys. J. 29, 398-408 (2000).</li><li>Ounkomol, C., Xie, H., Dayton, P. A., Heinrich, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+horizontal+force+probe+for+mechanical+tests+on+pipette-held+cells,+particles,+and+membrane+capsules.">Versatile horizontal force probe for mechanical tests on pipette-held cells, particles, and membrane capsules.</a> Biophys. J. 96, 1218-1231 (2009).</li><li>Piper, J. W., Swerlick, R. A., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+force+dependence+of+two-dimensional+receptor-ligand+binding+affinity+by+centrifugation.">Determining force dependence of two-dimensional receptor-ligand binding affinity by centrifugation.</a> Biophys. J. 74, 492-513 (1998).</li><li>Li, P., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+competition+binding+between+soluble+and+membrane-bound+ligands+for+cell+surface+receptors.">Analysis of competition binding between soluble and membrane-bound ligands for cell surface receptors.</a> Biophys. J. 77, 3394-3406 (1999).</li><li>Long, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probabilistic+modeling+of+rosette+formation.">Probabilistic modeling of rosette formation.</a> Biophys. J. 91, 352-363 (2006).</li><li>Lou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-enhanced+adhesion+regulated+by+a+selectin+interdomain+hinge.">Flow-enhanced adhesion regulated by a selectin interdomain hinge.</a> J. Cell. Biol. 174, 1107-1117 (2006).</li><li>Yago, T., Zarnitsyna, V. I., Klopocki, A. G., McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+governs+flow-enhanced+cell+tethering+through+L-selectin+at+threshold+shear.">Transport governs flow-enhanced cell tethering through L-selectin at threshold shear.</a> Biophys. J. 92, 330-342 (2007).</li><li>Evans, E., Berk, D., Leung, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detachment+of+agglutinin-bonded+red+blood+cells.+I.+Forces+to+rupture+molecular-point+attachments.">Detachment of agglutinin-bonded red blood cells. I. Forces to rupture molecular-point attachments.</a> Biophys. J. 59, 838-848 (1991).</li><li>Zarnitsyna, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+in+receptor-ligand-mediated+cell+adhesion.">Memory in receptor-ligand-mediated cell adhesion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 18037-18042 (2007).</li></ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Pour utiliser avec succès le test de fréquence d&#39;adhérence micropipette on doit considérer plusieurs étapes critiques. Premièrement, assurez-vous d&#39;enregistrer les interactions spécifiques pour le système récepteur-ligand d&#39;intérêt. Mesures de contrôle non spécifiques (cf. Fig. 3, 4) assurer la spécificité. Idéalement, les probabilités d&#39;adhérence non spécifique doit être inférieur à 0,05 pour toutes les durées de contact et d&#39;avoir une différence significative entre les proba...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Catalogue # </th><th> Commentaires </th></tr><tr><td> 10x PBS </td><td> BioWhittaker </td><td> 17-517Q </td><td> Diluer à 1x à l&#39;eau déminéralisée avant de l&#39;utiliser </td></tr><tr><td> Vacutainer EDTA </td><td> BD </td><td> 366643 </td><td> Isolément les globules rouges </td></tr><tr><td> 10ML PK100 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Histopaque 1077 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 10771 </td><td> Isolément les globules rouges </td></tr><tr><td> Adénine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A2786 </td><td> EAS-45 la préparation </td></tr><tr><td> D-glucose (dextrose) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G7528 </td><td> EAS-45 la préparation </td></tr><tr><td> D-mannitol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 6360 </td><td> EAS-45 la préparation </td></tr><tr><td> Chlorure de sodium (NaCl) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S7653 </td><td> EAS-45 la préparation </td></tr><tr><td> Phosphate de sodium dibasique (Na &amp; # x2082; HPO ₄) </td><td> Fisher Scientific </td><td> S374 </td><td> EAS-45 la préparation </td></tr><tr><td> L-glutamine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G5763 </td><td> EAS-45 la préparation </td></tr><tr><td> Biotine-X-NHS </td><td> Calbiochem </td><td> 203188 </td><td> Biotinylation globules rouges </td></tr><tr><td> Diméthylformamide (DMF) </td><td> Thermo Scientific </td><td> 20673 </td><td> Biotinylation globules rouges </td></tr><tr><td> Tampon borate (0,1 M) </td><td> Sciences Electron Microscopy </td><td> 11455-90 </td><td> Biotinylation globules rouges </td></tr><tr><td> Streptavidine </td><td> Thermo Scientific </td><td> 21125 </td><td> Ligand fonctionnalisation </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A0336 </td><td> Ligand fonctionnalisation </td></tr><tr><td> Quantibrite Perles PE </td><td> BD Biosciences </td><td> 340495 </td><td> La quantification de densité </td></tr><tr><td> Cytomètre en flux </td><td> BD Systèmes Immunocytometry </td><td> BD LSR II </td><td> Densité Quantification </td></tr><tr><td> Tube capillaire 0.7-1.0mm x 30 &quot; </td><td> Kimble Glass Inc </td><td> 46485-1 </td><td> Micropipette tirant </td></tr><tr><td> Huile minérale </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP2629-1 </td><td> Chambre de l&#39;Assemblée </td></tr><tr><td> Verre Couverture Microscope </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12 à 544-G </td><td> Chambre de l&#39;Assemblée </td></tr><tr><td> PE α-humain CD11a Clone HI 111 </td><td> eBioscience </td><td> 12-0119-71 </td><td> Réactif pour Fig.1 </td></tr><tr><td> PE anti-humain CD54 </td><td> eBioscience </td><td> 12-0549 </td><td> Réactif pour Fig.1 </td></tr><tr><td> Souris IgG1 isotype contrôle PE </td><td> eBioscience </td><td> 12-4714 </td><td> Réactif pour Fig.1 </td></tr><tr><td> micromanipulateur hydraulique </td><td> Narishige </td><td> MO-303 </td><td> Micropipette système </td></tr><tr><td> Manipulateur mécanique </td><td> Newport </td><td> 461-XYZ-M, LM-13, DM-13 </td><td> Micropipette système </td></tr><tr><td> translateur piézoélectrique </td><td> Physik Instrumente </td><td> P-840 </td><td> Micropipette système </td></tr><tr><td> LabVIEW </td><td> National Instruments </td><td> Version 8.6 </td><td> Micropipette système </td></tr><tr><td> DAQ conseil d&#39;administration </td><td> National Instruments </td><td> USB-6008 </td><td> Micropipette système </td></tr><tr><td> Table optique </td><td> Kinetics Systems </td><td> Série 5200 </td><td> Micropipette système </td></tr></tbody></table>

adhesion frequency assay for in situ kinetics analysis of cross-junctional molecular interactions at the cell-cell interface

Le test d&#39;adhérence micropipette a été développé en 1998 pour mesurer deux dimensions (2D) récepteur-ligand cinétique de liaison 1. L&#39;essai utilise un globule rouge humain (RBC) en tant que capteur d&#39;adhérence et de cellules présentant l&#39;une des molécules en interaction. Elle emploie micromanipulation pour amener le RBC en contact avec une autre cellule qui exprime la molécule interagissant avec d&#39;autres zone contrôlée avec précision et le temps pour permettre la formation de liaison. L&#39;événement d&#39;adhérence est détecté comme un allongement de RBC sur la tirant les deux cellules à part. En contrôlant la densité des ligands immobilisés sur la surface du globule, la probabilité de l&#39;adhésion est maintenu à la mi-chemin entre 0 et 1. La probabilité d&#39;adhérence est estimée à partir de la fréquence des événements d&#39;adhésion dans une séquence de cycles de contacts répétés entre les deux cellules pour un temps de contact donné. Varier le temps de contact génère une courbe de liaison. Le montage d&#39;un modèle probabiliste pour récepteur-ligand de réaction cinétique de 1 à la liaisoncourbe de revient de l&#39;affinité 2D et hors-taux. Le test a été validé en utilisant des interactions avec des récepteurs Fcy IgG Fc 1-6, avec des ligands des sélectines glycoconjugués 6-9, les intégrines avec des ligands 10-13, homotypical cadhérine contraignante 14, récepteur des cellules T et des complexes d&#39;histocompatibilité corécepteur peptide-major 15 - 19. La méthode a été utilisée pour quantifier les règlements de la cinétique 2D par des facteurs biophysiques, comme la membrane microtopology 5, la membrane d&#39;ancrage 2, l&#39;orientation moléculaire et de la longueur 6, 9 raideurs transporteur, la courbure 20 et 20 vigueur impact, ainsi que les facteurs biochimiques, tels que des modulateurs du microenvironnement du cytosquelette et la membrane où les molécules interagissant résident et l&#39;organisation de surface de ces molécules 15,17,19. La méthode a également été utilisé to Etude de la liaison simultanée de deux espèces récepteur-ligand 3,4, et les interactions trimoléculaire 19 en utilisant un modèle modifié 21. L&#39;avantage majeur de cette méthode est qu&#39;elle permet l&#39;étude des récepteurs membranaires dans leur environnement natif. Les résultats pourraient être très différents de ceux obtenus en utilisant des récepteurs purifiés 17. Il permet également d&#39;étudier les interactions récepteur-ligand dans un délai inférieur à la seconde avec une résolution temporelle bien au-delà des méthodes typiques biochimiques. Pour illustrer la méthode de fréquence micropipette adhésion, nous montrons mesure cinétique de la molécule d&#39;adhésion intercellulaire 1 (ICAM-1) fonctionnalisés sur les globules rouges se liant à l&#39;intégrine α L β 2 sur les neutrophiles avec des dimères de la E-sélectine dans la solution pour activer α L β 2.

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Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

Un test de fréquence pour mesurer la cinétique de l&#39;adhérence d&#39;interaction récepteur-ligand, lorsque les deux molécules sont ancrées sur les surfaces des cellules en interaction est décrite. Ce test mécanique à base est illustrée à l&#39;aide d&#39;une micropipette pressurisés cellules rouges du sang humain en tant que capteur d&#39;adhérence et de l&#39;intégrine αLβ2 et de la molécule d&#39;adhésion intercellulaire-1 que l&#39;interaction des récepteurs et des ligands.

Essai Fréquence d&#39;adhérence pour In Situ Analyse cinétique de la Croix-jonctionnelle interactions moléculaires à l&#39;interface cellule-cellule

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood ...

adhesion-frequency-assay-for-situ-kinetics-analysis-cross-junctional

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

14.9K vues.  Georgia Institute of Technology. Un test de fréquence pour mesurer la cinétique de l'adhérence d'interaction récepteur-ligand, lorsque les deux molécules sont ancrées sur les surfaces des cellules en interaction est décrite. Ce test mécanique à base est illustrée à l'aide d'une micropipette pressurisés cellules rouges du sang humain en tant que capteur d'adhérence et de l'intégrine αLβ2 et de la molécule d'adhésion intercellulaire-1 que l'interaction des ...

Vidéo: Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution. Traditionally, multiple experiments are run in parallel, with individual samples removed from the study at sequential time points for evaluation by light microscopy. Several intravital techniques have been developed, with confocal, multiphoton, and second harmonic microscopy all demonstrating their ability to be used for imaging in situ 1. With these systems, however, the required infrastructure is complex and expensive, involving scanning laser systems and complex light sources. Here we present a protocol for the design and assembly of a high-resolution microendoscope which can be built in a day using off-the-shelf components for under US$5,000. The platform offers flexibility in terms of image resolution, field-of-view, and operating wavelength, and we describe how these parameters can be easily modified to meet the specific needs of the end user.
We and others have explored the use of the high-resolution microendoscope (HRME) in in vitro cell culture 2-5, in excised 6 and living animal tissues 2,5, and in human tissues in vivo 2,7. Users have reported the use of several different fluorescent contrast agents, including proflavine 2-4, benzoporphyrin-derivative monoacid ring A (BPD-MA) 5, and fluoroscein 6,7, all of which have received full, or investigational approval from the FDA for use in human subjects. High-resolution microendoscopy, in the form described here, may appeal to a wide range of researchers working in the basic and clinical sciences. The technique offers an effective and economical approach which complements traditional benchtop microscopy, by enabling the user to perform high-resolution, longitudinal imaging in situ.

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

In many biological and clinical situations it is advantageous to study cellular processes as they evolve in their native microenvironment. Here we describe the assembly and use of a low-cost fiber-optic microscope which can provide real time imaging in cell culture, animal studies, and clinical patient studies.

Haute résolution à fibre optique pour les Microendoscopy In situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

Recherche

Bio-ingénierie

Bridging the Bio-Electronic Interface with Biofabrication

Advancements in lab-on-a-chip technology promise to revolutionize both research and medicine through lower costs, better sensitivity, portability, and higher throughput. The incorporation of biological components onto biological microelectromechanical systems (bioMEMS) has shown great potential for achieving these goals. Microfabricated electronic chips allow for micrometer-scale features as well as an electrical connection for sensing and actuation. Functional biological components give the system the capacity for specific detection of analytes, enzymatic functions, and whole-cell capabilities. Standard microfabrication processes and bio-analytical techniques have been successfully utilized for decades in the computer and biological industries, respectively. Their combination and interfacing in a lab-on-a-chip environment, however, brings forth new challenges. There is a call for techniques that can build an interface between the electrode and biological component that is mild and is easy to fabricate and pattern.
Biofabrication, described here, is one such approach that has shown great promise for its easy-to-assemble incorporation of biological components with versatility in the on-chip functions that are enabled. Biofabrication uses biological materials and biological mechanisms (self-assembly, enzymatic assembly) for bottom-up hierarchical assembly. While our labs have demonstrated these concepts in many formats 1,2,3, here we demonstrate the assembly process based on electrodeposition followed by multiple applications of signal-based interactions. The assembly process consists of the electrodeposition of biocompatible stimuli-responsive polymer films on electrodes and their subsequent functionalization with biological components such as DNA, enzymes, or live cells 4,5. Electrodeposition takes advantage of the pH gradient created at the surface of a biased electrode from the electrolysis of water 6,7,. Chitosan and alginate are stimuli-responsive biological polymers that can be triggered to self-assemble into hydrogel films in response to imposed electrical signals 8. The thickness of these hydrogels is determined by the extent to which the pH gradient extends from the electrode. This can be modified using varying current densities and deposition times 6,7. This protocol will describe how chitosan films are deposited and functionalized by covalently attaching biological components to the abundant primary amine groups present on the film through either enzymatic or electrochemical methods 9,10. Alginate films and their entrapment of live cells will also be addressed 11. Finally, the utility of biofabrication is demonstrated through examples of signal-based interaction, including chemical-to-electrical, cell-to-cell, and also enzyme-to-cell signal transmission. 
Both the electrodeposition and functionalization can be performed under near-physiological conditions without the need for reagents and thus spare labile biological components from harsh conditions. Additionally, both chitosan and alginate have long been used for biologically-relevant purposes 12,13. Overall, biofabrication, a rapid technique that can be simply performed on a benchtop, can be used for creating micron scale patterns of functional biological components on electrodes and can be used for a variety of lab-on-a-chip applications.

This article describes a biofabrication approach: deposition of stimuli-responsive polysaccharides in the presence of biased electrodes to create biocompatible films which can be functionalized with cells or proteins. We demonstrate a bench-top strategy for the generation of the films as well as their basic uses for creating interactive biofunctionalized surfaces for lab-on-a-chip applications.

Combler l&#39;interface bio-électronique avec Biofabrication

Advancements in lab-on-a-chip technology promise to revolutionize both research and medicine through lower costs, better sensitivity, portability, and ...

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced birth defects and many later studies afterwards proved the opposite. Today several harmful xenobiotics like nicotine, heroin, methadone or drugs as well as environmental pollutants were described to overcome this barrier. With the growing use of nanotechnology, the placenta is likely to come into contact with novel nanoparticles either accidentally through exposure or intentionally in the case of potential nanomedical applications. Data from animal experiments cannot be extrapolated to humans because the placenta is the most species-specific mammalian organ 1. Therefore, the ex vivo dual recirculating human placental perfusion, developed by Panigel et al. in 1967 2 and continuously modified by Schneider et al. in 1972 3, can serve as an excellent model to study the transfer of xenobiotics or particles.
Here, we focus on the ex vivo dual recirculating human placental perfusion protocol and its further development to acquire reproducible results.
The placentae were obtained after informed consent of the mothers from uncomplicated term pregnancies undergoing caesarean delivery. The fetal and maternal vessels of an intact cotyledon were cannulated and perfused at least for five hours. As a model particle fluorescently labelled polystyrene particles with sizes of 80 and 500 nm in diameter were added to the maternal circuit. The 80 nm particles were able to cross the placental barrier and provide a perfect example for a substance which is transferred across the placenta to the fetus while the 500 nm particles were retained in the placental tissue or maternal circuit. The ex vivo human placental perfusion model is one of few models providing reliable information about the transport behavior of xenobiotics at an important tissue barrier which delivers predictive and clinical relevant data.

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

The ex vivo dual recirculating human placental perfusion model can be used to investigate the transfer of xenobiotics and nanoparticles across the human placenta. In this video protocol we describe the equipment and techniques required for a successful execution of a placenta perfusion.

Détermination de la vitesse de transport des xénobiotiques et des nanomatériaux à travers le placenta en utilisant l&#39;<em&gt; Ex vivo</em&gt; Human perfusion placentaire modèle

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Development of Amelogenin-chitosan Hydrogel for In Vitro Enamel Regrowth with a Dense Interface

Biomimetic enamel reconstruction is a significant topic in material science and dentistry as a novel approach for the treatment of dental caries or erosion. Amelogenin has been proven to be a critical protein for controlling the organized growth of apatite crystals. In this paper, we present a detailed protocol for superficial enamel reconstruction by using a novel amelogenin-chitosan hydrogel. Compared to other conventional treatments, such as topical fluoride and mouthwash, this method not only has the potential to prevent the development of dental caries but also promotes significant and durable enamel restoration. The organized enamel-like microstructure regulated by amelogenin assemblies can significantly improve the mechanical properties of etched enamel, while the dense enamel-restoration interface formed by an in situ regrowth of apatite crystals can improve the effectiveness and durability of restorations. Furthermore, chitosan hydrogel is easy to use and can suppress bacterial infection, which is the major risk factor for the occurrence of dental caries. Therefore, this biocompatible and biodegradable amelogenin-chitosan hydrogel shows promise as a biomaterial for the prevention, restoration, and treatment of defective enamel.

Development of Amelogenin-chitosan Hydrogel for In Vitro Enamel Regrowth with a Dense Interface

In this article, we describe a protocol for fabricating an amelogenin-chitosan hydrogel for superficial enamel reconstruction. Organized in situ growth of apatite crystals in the hydrogel formed a dense enamel-restoration interface, which will improve the effectiveness and durability of restorations.

Le développement de l&#39;Amelogenin-chitosane Hydrogel pour<em&gt; In Vitro</em&gt; Émail repousse avec une interface dense

Biomimetic enamel reconstruction is a significant topic in material science and dentistry as a novel approach for the treatment of dental caries or ...

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen Presenting Cells (APCs). This is despite T-cell antigen receptors (TCRs) exerting usually a moderate affinity (&#181;M range) to antigen when binding is measured in vitro1. In view of the molecular and cellular parameters contributing to T-cell antigen sensitivity, a microscopy-based methodology has been developed as a means to monitor TCR-pMHC binding in situ, as it occurs within the synapse of a live T-cell and an artificial and functionalized glass-supported planar lipid bilayer (SLB), which mimics the cell membrane of an Antigen presenting Cell (APC) 2. Measurements are based on F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between a blue- and red-shifted fluorescent dye attached to the TCR and the pMHC. Because the efficiency of FRET is inversely proportional to the sixth power of the inter-dye distance, one can employ FRET signals to visualize synaptic TCR-pMHC binding. The sensitive of the microscopy approach supports detection of single molecule FRET events. This allows to determine the affinity and off-rate of synaptic TCR-pMHC interactions and in turn to interpolate the on-rate of binding. Analogous assays could be applied to measure other receptor-ligand interactions in their native environment.

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

This manuscript describes how to conduct (single molecule) F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)- based assays to measure the binding dynamics between T-cell antigen receptor (TCR) and antigenic peptide-loaded MHC molecules as they occur within the immunological synapse of a T-cell in contact with a functionalized planar supported lipid bilayer.

Mesure de TCR-pMHC Reliure<em&gt; In Situ</em&gt; L&#39;aide d&#39;un essai basé sur la microscopie FRET-

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

A Tripeptide-Stabilized Nanoemulsion of Oleic Acid

We describe a method to produce a nanoemulsion composed of an oleic acids-Pt(II) core and a lysine-tyrosine-phenylalanine (KYF) coating (KYF-Pt-NE). The KYF-Pt-NE encapsulates Pt(II) at 10 wt. %, has a diameter of 107 &#177; 27 nm and a negative surface charge. The KYF-Pt-NE is stable in water and in serum, and is biologically active. The conjugation of a fluorophore to KYF allows the synthesis of a fluorescent nanoemulsion that is suitable for biological imaging. The synthesis of the nanoemulsion is performed in an aqueous environment, and the KYF-Pt-NE forms via self-assembly of a short KYF peptide and an oleic acids-platinum(II) conjugate. The self-assembly process depends on the temperature of the solution, the molar ratio of the substrates, and the flow rate of the substrate addition. Crucial steps include maintaining the optimal stirring rate during the synthesis, permitting sufficient time for self-assembly, and pre-concentrating the nanoemulsion gradually in a centrifugal concentrator.

This protocol describes an efficient method to synthesize a nanoemulsion of an oleic acids-platinum(II) conjugate stabilized with a lysine-tyrosine-phenylalanine (KYF) tripeptide. The nanoemulsion forms under mild synthetic conditions via self-assembly of the KYF and the conjugate.

Une Nanoémulsion Tripeptide-stabilisé de l’acide oléique

We describe a method to produce a nanoemulsion composed of an oleic acids-Pt(II) core and a lysine-tyrosine-phenylalanine (KYF) coating (KYF-Pt-NE). The ...

Environmental Dynamic Mechanical Analysis to Predict the Softening Behavior of Neural Implants

When using dynamically softening substrates for neural implants, it is important to have a reliable in vitro method to characterize the softening behavior of these materials. In the past, it has not been possible to satisfactorily measure the softening of thin films under conditions mimicking body environment without substantial effort. This publication presents a new and simple method that allows dynamic mechanical analysis (DMA) of polymers in solutions, such as phosphate buffered saline (PBS), at relevant temperatures. The use of environmental DMA allows measurement of the softening effects of polymers due to plasticization in various media and temperatures, which therefore allows a prediction of the materials behavior under in vivo conditions.

To allow reliable predictions of the softening of polymeric substrates for neural implants in an in vivo environment, it is important to have a reliable in vitro method. Here, the use of dynamic mechanical analysis in phosphate buffered saline at body temperature is presented.

Analyse mécanique dynamique environnementale pour prédire le comportement de ramollissement des Implants neurones

When using dynamically softening substrates for neural implants, it is important to have a reliable in vitro method to characterize the softening behavior ...

Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically been studied in vivo in animal models showing characteristic patterns of cell migration. However, in vivo models have several limitations, including intercellular mediators that are difficult to access and analyze, as well as the inability to directly analyze human neutrophils. Because of these limitations, there is a need for an in vitro platform that studies swarming with human neutrophils and provides easy access to the molecular signals generated during swarming. Here, a multistep microstamping process is used to generate a bioparticle microarray that stimulates swarming by mimicking an in vivo infection. The bioparticle microarray induces neutrophils to swarm in a controlled and stable manner. On the microarray, neutrophils increase in speed and form stable swarms around bioparticle clusters. Additionally, supernatant generated by the neutrophils was analyzed and 16 proteins were discovered to have been differentially expressed over the course of swarming. This in vitro swarming platform facilitates direct analysis of neutrophil migration and protein release in a reproducible, spatially controlled manner.

This protocol generates bioparticle microarrays that provide spatially controlled neutrophil swarming. It provides easy access to the mediators that neutrophils release during migration and allows for quantitative imaging analysis.

Microarrays de bioparticules pour l’analyse chimiotaxique et moléculaire de l’ésaimage humaine de neutrophile in vitro

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...

Lipidico Injection Protocol for Serial Crystallography Measurements at the Australian Synchrotron

A facility for performing serial crystallography measurements has been developed at the Australian synchrotron. This facility incorporates a purpose built high viscous injector, Lipidico, as part of the macromolecular crystallography (MX2) beamline to measure large numbers of small crystals at room temperature. The goal of this technique is to enable crystals to be grown/transferred to&#160;glass syringes to be used directly in the injector for serial crystallography data collection. The advantages of this injector include the ability to respond rapidly&#160;to changes in the flow rate without interruption of the stream. Several limitations for this high viscosity injector (HVI) exist which include a restriction on the allowed sample viscosities to &#62;10 Pa.s. Stream stability can also potentially be an issue depending on the specific properties of the sample. A detailed protocol for how to set up samples and operate the injector for serial crystallography measurements at the Australian synchrotron is presented here. The method demonstrates preparation of the sample, including the transfer of lysozyme crystals into a high viscous media (silicone grease), and the operation of the injector for data collection at MX2.

The goal of this protocol is to demonstrate how to prepare serial crystallography samples for data collection on a high viscous injector, Lipidico, recently commissioned at the Australian synchrotron.

Protocole d’injection lipidique pour les mesures de cristallographie en série au synchrotron australien

A facility for performing serial crystallography measurements has been developed at the Australian synchrotron. This facility incorporates a purpose built ...

Molecular Spring Constant Analysis by Biomembrane Force Probe Spectroscopy

A biomembrane force probe (BFP) has recently emerged as a native-cell-surface or in situ dynamic force spectroscopy (DFS) nanotool that can measure single-molecular binding kinetics, assess mechanical properties of ligand-receptor interactions, visualize protein dynamic conformational changes and more excitingly elucidate receptor mediated cell mechanosensing mechanisms. More recently, BFP has been used to measure the spring constant of molecular bonds. This protocol describes the step-by-step procedure to perform molecular spring constant DFS analysis. Specifically, two BFP operation modes are discussed, namely the Bead-Cell and Bead-Bead modes. This protocol focuses on deriving spring constants of the molecular bond and cell from DFS raw data.

A biomembrane force probe (BFP) is an in situ dynamic force spectroscopy (DFS) technique. BFP can be used to measure the spring constant of molecular interactions on living cells. This protocol presents spring constant analysis for molecular bonds detected by BFP.

Analyse de la constante de ressort moléculaire par spectroscopie de sonde de force de biomembrane

A biomembrane force probe (BFP) has recently emerged as a native-cell-surface or in situ dynamic force spectroscopy (DFS) nanotool that can measure ...