Cette méthode peut aider à comprendre les questions clés dans le domaine de l’interaction cellule à cellule, telles que les récepteurs qui médiationent l’adhérence ou la reconnaissance dans les contacts cellule à cellule et si des ligands spécifiques déclenchent leurs interactions. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’étudier ces interactions directement dans les cellules vivantes sans avoir besoin de fixation ou de perturbation cellulaire. Bien que cette méthode soit utilisée pour étudier les interactions entre les cellules de culture, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes vésicules monobrasques ou même à de petits organismes modèles.
En général, les personnes nouvelles à cette méthode devraient vérifier que leur échantillon est suffisamment stable pour permettre l’acquisition sur quelques minutes en inspectant soigneusement le mouvement cellulaire et les variations lentes du signal. Tout d’abord, ensemencer le nombre approprié de cellules dans au moins quatre puits d’une plaque de six puits par jour avant la transfection. Culture des cellules à 37 degrés Celsius 5% dioxyde de carbone dans le milieu DMEM complété par 10%FBS et 1%L-glutamine.
Effectuer une expérience de base plasmides transfect pour la protéine d’intérêt fusionnée à une protéine fluorescente verte ou jaune et une protéine fluorescente rouge dans des puits séparés. Après quatre heures enlever le milieu de croissance et laver chaque puits doucement avec un millilitre de PBS complété avec du magnésium et du calcium tombant PBS sur le bord du puits pour empêcher le détachement des cellules pendant le lavage. Retirez ensuite le PBS.
Ajouter environ 50 microlitres de solution EDTA goutte sage à chaque puits pour faciliter le détachement des cellules. Après avoir couver à 37 degrés Celsius pendant deux minutes, secouez lentement la plaque de six puits latéralement pour détacher les cellules. Ensuite, ajoutez 950 microlitres de milieu de croissance à chaque puits et résuspendez les cellules en pipetant à quelques reprises de haut en bas, détachant ainsi toutes les cellules du fond du puits.
Assurez-vous que les cellules sont résuspendus correctement et détachées les unes des autres en vérifiant visuellement l’absence de gros agrégats cellulaires après la résuspension. Transférer la solution cellulaire d’un puits au puits correspondant. Mélanger délicatement en pipetant à quelques reprises de haut en bas.
Puis ensemencer les cellules mélangées sur un plat de fond en verre de 35 millimètres et la culture des cellules ensemencées à 37 degrés Celsius en dioxyde de carbone de 5% pendant une journée. Dans le logiciel de microscope confocal à balayage laser mis en place le chemin optique. Pour éviter la tige transversale spectrale, sélectionnez deux pistes distinctes pour exciter et détecter mEGFP ou mEYFP et mCherry ou mCardinal séquentiellement et sélectionnez switch pistes chaque ligne.
Pour la détection utiliser des filtres appropriés pour les deux canaux. Placer le plat contenant les cellules mélangées sur le porte-échantillon. Après avoir attendu 10 minutes pour assurer l’équilibre de la température et réduire la dérive de mise au point, concentrez-vous sur les cellules en utilisant la lumière de transmission dans le menu Localiser.
Recherchez une paire de globules rouges et verts en contact les uns avec les autres. Ensuite, sélectionnez un chemin d’analyse perpendiculaire au contact cellule à cellule à l’aide du bouton Crop. Zoomez pour atteindre une taille de pixel de 50 à 200 nanomètres et sélectionnez Ligne en mode Scan.
Réglez la taille du cadre à 128 par un pixels. Réglez la vitesse d’analyse à la valeur maximale autorisée. Réglez ensuite les cycles à 100 000 à 500 000.
Par la suite, choisissez les pouvoirs laser appropriés. Réglez les détecteurs en mode Comptage photon. Appuyez sur Démarrer l’expérience pour commencer l’acquisition.
Exportez les fichiers de données brutes vers une image RGB TIF en format données brutes. Ce fichier contiendra un kymograph avec les données de canal vert et rouge dans le canal appelé G et R de l’image, respectivement. Ensuite, importez le fichier TIF avec le logiciel d’analyse approprié et procédez à l’analyse.
Alignez les lignes en effectuant une moyenne de temps du segment avec des blocs de 500 à 1000 lignes. Déterminer la position de la membrane dans chaque bloc. Déplacez ensuite tous les blocs vers la même position latérale.
Résumez toutes les lignes alignées le long de l’axe du temps et adaptez le profil d’intensité moyenne à l’aide d’une fonction gaussienne. Définissez les pixels correspondant à la membrane comme tous les pixels dans plus ou moins 2,5 sigma de la position de la membrane, et résumez l’intensité de ces pixels dans chaque ligne en obtenant une valeur de signal fluorescent unique pour chaque point de temps. Si le blanchiment photo est observé, appliquez une correction de blanchiment en adaptant la série de temps de fluorescence de membrane avec une fonction exponentielle double et en appliquant la formule appropriée de correction.
Calculez les fonctions d’auto et de corrélation croisée en fonction des équations appropriées. Pour améliorer la fiabilité de l’analyse et éviter les artefacts effectuer les calculs pour 10 à 20 segments égaux de la mesure totale. Inspectez les séries de temps de fluorescence et les fonctions de corrélation dans chaque segment et supprimez les segments clairement déformés.
Enfin, la moyenne de tous les segments non faussés. Lors de l’analyse de vos données, inspectez soigneusement les séries temporelles d’intensité et les fonctions de corrélation de chaque segment afin d’éviter les distorsions, par exemple en raison de vésicules intracellulaires dans la périphérie membranaire. Une image d’intensité des cellules HEK 293T exprimant myristolyated-palmitoylated-mEYFP ou mCardinal est montrée ici.
Une corrélation croisée relative proche de zéro a été observée tandis que les fonctions d’autocorrelation montrent des temps de décomposition caractéristiques de 10 à 20 millisecondes pour la diffusion du myristolyated-palmitoylated-mEYFP et du mCardinal dans la membrane plasmatique. Les fonctions de corrélation croisée des mesures sFCCS des cellules HEK 293T exprimant l’heterodimer myterodimé myristolyated-palmitoylated-mCardinal-mEYFP ont eu des amplitudes positives et ont montré des temps de décomposition semblables à la fonction d’autocorréfération. Les mesures de sFCCS sur des contacts de cellule à cellule entre APLP1-mEYFP et aplp1-mCardinal-exprimant des cellules ont eu comme conséquence une corrélation croisée relative positive de 0.45.
Les fonctions de corrélation sFCCS obtenues à partir de mesures à travers les clusters APLP1 à des contacts cellule-cellule ont montré une dynamique fortement réduite comme en témoigne les temps de décomposition importants dans les oscillations à de grands moments de décalage. Lors de l’ajout d’ion de zinc, la corrélation croisée relative a augmenté à une valeur moyenne de 0,8. En outre, la luminosité moléculaire a considérablement augmenté de petits oligomers à de plus grands multimères composés de 10 à 50 monomères sur chaque cellule.
Les instabilités transitoires peuvent entraîner une fonction de corrélation croisée ayant des valeurs négatives ou une forte corrélation croisée faussement positive. Les fonctions de corrélation correspondantes s’écartent généralement fortement de celles de la majorité des segments. Comme une approche complémentaire au nombre et à la luminosité de la corrélation croisée sFCCS peut être utilisée pour détecter les interactions protéines-protéines.
Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler que le mélange des cellules transfected est une étape critique. Mélangez doucement les cellules et optimisez l’efficacité de la transfection pour augmenter les chances de trouver des cellules rouges et vertes en contact. Après son développement, cette technique a été utilisée par des chercheurs dans le domaine de l’immunologie pour explorer les interactions des molécules de signalisation dans les synapses immunologiques.
