Les auteurs tiennent à remercier le US Army Medical Research et du matériel de commande (Numéros de subvention W81XWH-09-1-0386 et W81XWH-10-1-0806) pour un soutien financier et le Dr Shawn Rigby de la Facilité Iowa State University cytométrie en flux pour son assistance technique spécialisée.

1. La récolte macrophages alvéolaires (AMɸ) à partir de la souris en utilisant lavage du poumon <ol><li> Porter un équipement de protection individuelle (EPI) comme un sarrau de laboratoire, des gants jetables et des lunettes de protection. </li><li> Préparer complète AMɸ (cAMɸ) moyenne avant le début de la récolte. Ajouter 2,5 mL de pénicilline / streptomycine (pénicilline / streptomycine) solution, 250 pi de β-mercaptoéthanol (2-mercaptoéthanol), et 25 ml de la chaleur sérum inactivé de veau fœtal (FBS) à 222,25 mL de milieu de Dulbelcco Eagle modifié (DMEM). Filtre-stériliser moyennes cAMɸ l&#39;aide d&#39;un filtre à pores de 0,2 um top taille de la bouteille sous vide. </li><li> Euthanasier une souris en bonne santé en CO 2 asphyxie dans une chambre euthanasie. Bien qu&#39;une souris C57BL / 6 (6-8 semaines) a été utilisé pour les fins de ce projet, cette technique de lavage du poumon peut être effectuée sur n&#39;importe quelle souche de souris. En utilisant une bouteille de gaz comprimé, laissez écoulement du gaz dans la chambre pendant 1 min avant de placer la souris dans la chambre pour assurer que la chambre est entièrement chargé en CO 2. Placez la souris dans la chambre pour au moins une minute pour euthanasier la souris. En outre, être exsangue chaque souris par ponction cardiaque comme une méthode physique pour confirmer la mort de la souris, comme décrit en 1.4. </li><li> Lay la souris sur le dos (côté dorsal), de pulvérisation avec de l&#39;éthanol 70%, localiser le sternum et, à un angle de 30 degrés de l&#39;abdomen, insérer une aiguille de calibre 23 (attachée à une seringue de 1 ml) d&#39;environ 50 mm dans la cavité thoracique . Avec un placement correct de l&#39;aiguille, il devrait être possible de recueillir entre 0,4 et 1 ml de sang en fonction de la taille de la souris. Examiner l&#39;animal à l&#39;arrêt des signes vitaux. </li><li> Placer la souris sur le banc de laboratoire de sorte qu&#39;il est couché sur le ventre (face ventrale). La souris de pulvérisation avec de l&#39;éthanol à 70% pour stériliser l&#39;environnement de travail. Pincez la peau vers le milieu de la colonne vertébrale de la souris. Avec des ciseaux de dissection qui ont été stérilisés avec de l&#39;éthanol 70%, faire une petite incision à travers la peau. &lt;/ Li&gt; <li> Saisir la peau des deux côtés de l&#39;incision et tirer la peau dans des directions opposées le long de l&#39;axe crânio-caudale de la souris. Une fois fait correctement, la peau sera retiré de la carcasse sous-jacente. </li><li> Le cou de la souris devrait maintenant afficher les muscles exposés et des glandes. Découpez soigneusement que le tissu et tirez-le vers la partie antérieure de la souris en utilisant une pince, exposant ainsi le larynx, la trachée et l&#39;œsophage de la souris. Évitez de couper la veine jugulaire ou la carotide. </li><li> La trachée est maintenant visible et peut être identifiée comme le tissu avec des anneaux cartilagineux qui l&#39;entourent. Délicatement maintenir la trachée à la pince et lentement soulever et séparer la trachée de l&#39;oesophage, qui est situé sur le côté dorsal. </li><li> Faire une petite incision antérieure à l&#39;endroit où l&#39;on tient la trachée, mais postérieure du larynx. L&#39;incision doit être faite à environ un angle de 45 °. En outre, ne pas complètement transect de la trachée, car cela va l&#39;empêcher de se rétracter enla cavité du corps. </li><li> Remplir une seringue 1 cc muni d&#39;un cathéter de chat Tom avec PBS stérile en vue d&#39;insérer le cathéter dans la lumière de la trachée. Maintenez la trachée aide de pinces et avec votre main maintenir le cathéter à proximité de la pointe pour augmenter le contrôle et doucement l&#39;insérer dans le site de l&#39;incision trachéale. Sans forcer, insérez un cathéter dans la trachée d&#39;environ 20 mm. Saisir la trachée qui est autour du tube de cathéter, ce qui libère l&#39;autre côté. </li><li> En utilisant une seringue de 1 ml équipé du cathéter, doucement infuser 0,75 ml de la température ambiante, du PBS stérile dans les poumons, puis aspirer délicatement le dos du PBS dans la seringue. Répétez ce processus à trois reprises tout en massant l&#39;extérieur de la poitrine. Déconnecter la seringue du cathéter et de distribuer le liquide de lavage dans un tube à centrifuger de 15 ml. Après remplissage de la seringue avec 0,75 ml de PBS frais et rebrancher la seringue au cathéter, répétez les étapes 1,9 et 1,10 fois pour chaque souris. De récupération des fluides peut être partielle, en obtenant moins que la volume infusé. Si la collecte de cellules provenant de plus d&#39;une souris, placez le tube de 15 ml avec les cellules récoltées sur la glace jusqu&#39;à ce que tous les lavages pulmonaires ont été réalisées. </li></ol> 2. Traitement des lavage pulmonaire AMɸ récolte <ol><li> Centrifuger liquide de lavage pulmonaire à 250 x g pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Utilisant une technique stérile, surnageant décanter dans un récipient approprié l&#39;intérieur d&#39;une enceinte de sécurité biologique. Remettre en suspension le culot cellulaire en faisant délicatement ratisser le tube de la centrifugeuse dans la partie supérieure d&#39;un tube à essai en rack. Ajouter 1 mL de milieu cAMɸ pour remettre en suspension les cellules. </li><li> Énumérer les cellules en utilisant une particule Coulter Counter Z1 par pipetage 20 pl de cellules dans 10 mL de diluant dans Isoton II Coulter flacon compteur. Ajouter 3 à 4 gouttes de Zap-oglobin II réactif lytique dans le flacon, retourner doucement 3 à 4 fois, puis charger le flacon d&#39;échantillon sur le comptoir pour obtenir une concentration cellulaire. Assurez-vous de programmer le compteur avec un facteur de dilution de 2 x 10 4 pour afficher lala concentration des cellules comme le nombre de cellules par ml. </li><li> Diluer cellules à 2,5 x 10 5 par ml utilisant un milieu cAMɸ. </li><li> Distribuer 2 ml de 2,5 x 10 5 cellules / ml dans chaque puits d&#39;un plat de 6 puits de culture de tissu. </li><li> Pour enrichir pour AMɸ, des boîtes de culture incuber l&#39;intérieur d&#39;un 37 ° C incubateur humidifié avec une atmosphère de CO 2 5% pendant 6 h pour permettre aux cellules d&#39;adhérer au fond du puits. Aspirer doucement le surnageant de ne pas perturber les cellules adhérentes. </li><li> Rincer les puits à l&#39;aide du PBS stérile (calcium et de magnésium libre) pour enlever les cellules non adhérentes et les débris. Ajouter 2 mL de milieu cAMɸ à chaque puits. </li><li> Incuber les cellules avec nuitées dans un 37 ° C incubateur humidifié avec une atmosphère de CO 2 5% avant l&#39;addition de stimulants. Après cette étape d&#39;enrichissement, d&#39;environ 87% des cellules sont positives pour les marqueurs des macrophages du CD11b et F4/80 (figure 2c). </li></ol> 3. Ajout de PolyanhydridLes nanoparticules e et traitements de contrôle <ol><li> Fabriquer des nanoparticules via polyanhydride anti-solvant nanoencapsulation 15. Dans ce procédé, le polymère est dissous dans du chlorure de méthylène (4 ° C à une concentration de 25 mg / ml) et précipité dans le pentane (-20 ° C à une ratio de 1:200 chlorure de méthylène: pentane). </li><li> Peser des nanoparticules à l&#39;aide polyanhydride stérilisés peser le papier sur un équilibre qui peut mesurer avec précision les montants microgrammes. Ajouter particules à un microtube de 1,5 mL. </li><li> Remettre en suspension des nanoparticules dans la glace froide cAMɸ. Calculs sont effectués de telle sorte que pas plus de 0,3 ml de milieu est ajoutée à chaque puits pour obtenir la concentration désirée de nanoparticules. Maintenir les particules remises en suspension sur la glace jusqu&#39;à ce que les nanoparticules sont ajoutées à la culture ainsi. </li><li> Avant d&#39;ajouter des nanoparticules à des cultures AMɸ, sonication particules en utilisant un sonicateur paillasse avec une micropointe. Stériliser micropointe par pulvérisation avec de l&#39;éthanol 70% et wiping avec une Kimwipe stérile avant sonication. Soniquer à 10-20 joules de 30 à 45 s tout en gardant le tube sur la glace. Observez suspension de nanoparticules macroscopiquement. Si particules ne sont pas suffisamment dispersée, permettre la suspension de fixer la glace pendant 1 à 2 min pour que les nanoparticules sont en dessous de la température de transition vitreuse du polymère avant sonication supplémentaire pour 30 à 45 secondes. L&#39;objet de la présente étape de sonication est de manière adéquate disperser les nanoparticules, selon le CPTEG 50:50: nanoparticules ont tendance à s&#39;agréger CPH lorsqu&#39;il est exposé à un environnement aqueux. Toutefois, certains petits agrégats de nanoparticules peuvent demeurer dans la suspension. </li><li> Suspension de nanoparticules (de manière adéquate dispersée) devrait être conservé dans la glace et être utilisée immédiatement pour empêcher l&#39;érosion prématurée de surface ou l&#39;agrégation. </li><li> Retirer les boîtes de culture contenant le AMɸ de l&#39;incubateur et le lieu dans le cabinet de biosécurité. Plaque inclinable à environ un angle de 45 degrés et la pipette au large de la quantité de médecineum qui sera ajoutée à la suspension de nanoparticules (il ne devrait pas dépasser 0,3 ml). Ne dérangez pas les cellules adhérentes lors du retrait du milieu. </li><li> Vortex la suspension de nanoparticules polyanhydride brièvement avant de les ajouter dans les puits appropriés. Introduire à la pipette la quantité de suspension de nanoparticules (pas plus de 0,3 mL) dans le puits spécifique (s), mais ne pas pipeter de haut en bas pour mélanger. Cette action pourrait se détacher de l&#39;adhérent AMɸ du puits. Les particules se déposent au fond du puits et de contacter les cellules. Pour les études présentées dans ce rapport, la concentration finale de nanoparticules co-cultivées avec le AMɸ était de 125 pg / ml. Procéder à des puits et des groupes de traitement suivants souhaités. Inclure les groupes témoins positifs et négatifs, tels que seul moyen et de 200 ng / mL de lipopolysaccharide (LPS) pour les puits désignés. </li><li> Retour des boîtes de culture à la 37 ° C incubateur humidifié avec une atmosphère de CO 2 5% pendant 48 h. Des études cinétiques dans notre laboratory ont montré 48 heures pour être la période de culture optimal pour évaluer à la fois l&#39;expression du marqueur de surface cellulaire et la sécrétion de cytokine, car elle permet un temps suffisant pour la transcription et la synthèse des protéines de se produire. Bien que des niveaux plus élevés de cytokines s&#39;accumulent au cours d&#39;une période de culture prolongée (c.-à-72 h), l&#39;évaluation de l&#39;expression du marqueur de surface cellulaire, à ce point dans le temps peut être confondu par la contribution des niveaux élevés de cytokines. Les changements dans l&#39;expression des marqueurs de surface observées peuvent ne pas être directement attribuables à la stimulation avec les nanoparticules elles-mêmes. </li></ol> 4. Évaluation d&#39;activation AMɸ par cytométrie en flux <ol><li> Préparer le tri de cellules activées par fluorescence (FACS) tampon (0,1% d&#39;azoture de sodium et 0,1% de sérumalbumine bovine (BSA)) dans 0,1 M de phosphate saline tamponnée (pH 7,4) avant la récolte des macrophages plaqués qui ont été co-cultivées avec des nanoparticules ostimulants r. </li><li> Préparer les solutions de travail de la mémoire tampon de blocage et les anticorps monoclonaux. Pour préparer le tampon de blocage, diluer IgG de rat (Sigma) et anti-CD16/32 (eBioscience) à 1 mg / ml et 10 pg / mL, respectivement, dans un tampon FACS. Diluer panel d&#39;anticorps de surface de marqueur dans le tampon FACS soit la concentration recommandée par le fabricant ou la concentration utilisateur optimisée. Pour les résultats présentés dans ce travail, le panel de marqueurs de surface se compose d&#39;anticorps contre MHC II, CD86, CD40 et CIRE (CD209). Anti-souris des anticorps contre les marqueurs des macrophages F4/80 et CD11b sont également inclus dans le panneau pour identifier le phénotype des macrophages lors de l&#39;analyse des données. Des précautions doivent être prises lors de la sélection des anticorps contre des molécules du CMH II, comme souches de souris consanguines diffèrent souvent dans leurs haplotypes du CMH II. Les anticorps sélectionnés doivent réagir avec les alloantigènes spécifiques du CMH exprimées par votre souche de souris d&#39;intérêt. </li><li> Après 48 h d&#39;incubation avec des nanoparticules et / oules stimulants, les plats lieu de culture de cellules sur la glace pendant 20 min. Pour supprimer les macrophages adhérents des plaques, grattez délicatement les puits avec un grattoir à cellules 24 cm. </li><li> En utilisant une pipette sérologique de 5 ml, aspirer délicatement les cellules et le milieu haut et en bas à cinq reprises pour générer une seule suspension cellulaire. Introduire à la pipette le contenu des puits individuels dans des tubes de polystyrène séparées 5 mL afin de ne pas mélanger les cellules de différents traitements expérimentaux. </li><li> Ajouter 2 ml de tampon FACS à chaque tube. </li><li> Centrifuger les tubes de cellules à 250 x g à 4 ° C pendant 10 min. </li><li> Décanter le surnageant cellulaire et doucement Resuspendre le culot dans le liquide résiduel en ratissant les tubes dans la partie supérieure d&#39;un tube à essai en rack. </li><li> Afin de prévenir la non-spécifiques de liaison des anticorps monoclonaux, ajouter 10 ul de tampon de blocage (préparé en 4.2) à chaque tube de cellules. Tubes vortex et incuber sur de la glace pendant 30 min. </li><li> Ajouter le volume approprié de dilution des anticorps monoclonaux à chaque tube et Incubmangé dans le noir sur la glace pendant 15 min. Tubes contenant des échantillons à analyser doivent recevoir la combinaison d&#39;anticorps du panneau polycromatic (optimisation de la précédente combinaison d&#39;anticorps doit être effectué par les laboratoires individuels). Groupes de contrôle supplémentaires doivent être inclus pour définir correctement les paramètres d&#39;acquisition sur le cytomètre en flux, y compris un tube de cellules qui n&#39;ont pas été marqués, et les tubes de rémunération qui correspondent à des cellules marquées à l&#39;aide de chaque couleur unique séparément. Pour définir correctement les portes pour l&#39;analyse par cytométrie en flux, la fluorescence Minus One (FMO) contrôles doivent être inclus lors de l&#39;acquisition. Contrôles FMO sont des cellules marquées avec tous les anticorps conjugués au fluorochrome qui sont utilisés sur le panneau, sauf celui qui est remplacé par son contrôle isotype respectif. Populations positifs et négatifs (c.-à-aliquotes séparées de cellules traitées avec un stimulant contrôle positif et le milieu seul) devrait également être inclus dans le FMO et des tubes de commande de compensation. </li><li&gt; Ajouter 2 mL de tampon FACS à chaque tube, vortex et centrifuger à 250 x g à 4 ° C pendant 10 min. </li><li> Décanter surnageant et remettre en suspension dans le liquide culot cellulaire résiduelle par râteleuse les tubes dans la partie supérieure d&#39;un portoir de tubes à essai. </li><li> Si le panneau d&#39;anticorps comprend un anticorps pas directement conjugué à un fluorochrome, mais est au contraire conjugué à la biotine, la streptavidine conjugué à un fluorochrome est nécessaire pour visualiser le marqueur de surface. Dans cette étape, ajoutez un volume approprié de l&#39;dilué conjugué à un fluorochrome streptavidine et incuber dans l&#39;obscurité pendant 15 min sur la glace. Comme au point 4.2, la streptavidine sera diluée à une concentration recommandée par le fabricant ou à l&#39;un optimisé par l&#39;utilisateur. Cette étape est nécessaire uniquement pour les panneaux contenant des anticorps primaires biotinylés. </li><li> Effectuez une étape de lavage tel que décrit en 4.10. </li><li> Diluer un volume adéquat de BD stabiliser 01:03 fixatif dans l&#39;eau déminéralisée. Ajouter 100 ul de fixateur dilué dans chaque tube tout en douceur vortexing pour empêcher l&#39;agglutination des cellules. Les cellules marquées et fixé peut être stocké de façon stable dans l&#39;obscurité à 4 ° C pendant environ une semaine avant l&#39;acquisition d&#39;un cytomètre en flux. </li></ol> 5. Les données représentatives Nanoparticules fabriquées à l&#39;étape 3.1 avaient un diamètre moyen de 163 ± 24 nm et une morphologie compatible avec celle obtenue dans des études antérieures 5,16. Les nanoparticules en solution avant et après sonication sont présentés dans la figure 1 pour démontrer la nécessité de sonication pour assurer la dispersion adéquate des particules. L&#39;analyse par cytométrie en flux de AMɸs récoltés obtenus par lavage pulmonaire est montré dans la figure 2. Marquage des cellules avec une combinaison d&#39;anticorps anti-souris CD11b et anti-souris F4/80 anticorps ainsi que les commandes correspondantes FMO permet d&#39;établir l&#39;étiquetage de fond, l&#39;identification et AMɸs déclenchement pour une analyse ultérieure. Traitement des macrophages alvéolaires avec polyanhydridenanoparticules augmente l&#39;activation comme indiqué par l&#39;intensité accrue de fluorescence moyenne des molécules du CMH II, CD40, CD86, et CIRE (Figure 3). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3883/3883fig1.jpg" /> . Figure 1 50:50 CPTEG: CPH nanoparticules avant (A) et après (B) de 30 s de sonication. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3883/3883fig2.jpg" /> Figure 2. Analyse par cytométrie en flux de la récolte des macrophages alvéolaires marqués avec (A) Alexa Fluor 700 anti-CD11b et le PE-Cy7 FMO contrôle, (B) Alexa Fluor 700 FMO contrôle et la anti-F4/80 PE-Cy7 et (C ) Alexa Fluor 700 anti-CD11b et PE-Cy7 anti-F4/80. Le nombre dans le coin en haut à droite représente le pourcentage de cellules positives double. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3883/3883fig3.jpg" /> Figure 3. Histogrammes montrant une augmentation de la fluorescence intentionsité pour l&#39;expression de surface des molécules du CMH II (A), CD40 (B), CD86 (C) et CIRE (D) après avoir co-culture de macrophages alvéolaires avec CPTEG 50:50: polyanhydride CPH nanoparticules pendant 48 h. Histogrammes dépeignent résultats pour AMɸ étiquetés en tant que contrôles FMO ( <img alt="Ligne graphique 1" src="/files/ftp_upload/3883/3883line1.jpg" /> ), Non traitée AMɸ marquées avec des anticorps contre tous les marqueurs de surface cellulaire ( <img alt="Ligne graphique 3" src="/files/ftp_upload/3883/3883line3.jpg" /> ) Et AMɸ cultivées avec des nanoparticules et étiquetés avec des anticorps contre tous les marqueurs de surface cellulaire ( <img alt="Ligne graphique 2" src="/files/ftp_upload/3883/3883line2.jpg" /> ).

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Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Plates-formes de nanoparticules polyanhydride vaccins ont montré une efficacité lorsqu&#39;il est administré par voie intranasale à des posologies à dose unique 5. Mesure de l&#39;activation des cellules phagocytaires populations résidentes dans les poumons induites par cette plate-forme d&#39;administration des vaccins permettant l&#39;évaluation de sa capacité potentielle à terme, de promouvoir des réponses immunitaires adaptatives. Plus précisément, la récolte des ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Le numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> CAM médias </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro </td><td> 15-013-CV </td><td></td></tr><tr><td> 50 mM de 2-mercaptoéthanol </td><td> Sigma </td><td> M3148-25ML </td><td></td></tr><tr><td> Pénicilline / streptomycine 10000 ug / ml Solution </td><td> Cellgro </td><td> 30-002-CI </td><td></td></tr><tr><td> Sérum fœtal bovin </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11150 </td><td></td></tr><tr><td> FACS tampon </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Le chlorure de sodium </td><td> Fisher Scientific </td><td> S671-500 </td><td></td></tr><tr><td> Phosphate de sodium </td><td> Fisher Scientific </td><td> MK7868500 </td><td></td></tr><tr><td> Le chlorure de potassium </td><td> Fisher Scientific </td><td> P217500 </td><td></td></tr><tr><td> Le phosphate de potassium </td><td> Fisher Scientific </td><td> P288-200 </td><td></td></tr><tr><td> BSA (Bovine Serum Albumin) </td><td> Sigma </td><td> A7888 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;azoture de sodium </td><td> Sigma </td><td> S2002 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorps </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rat IgG </td><td> Sigma </td><td> I4341 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Mme CD16/32 </td><td> eBioscience </td><td> 16-0161 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Mme CMH II haplotype IA / IE, clone M5/114.15.2, conjugué à l&#39;isothiocyanate de fluorescéine (FITC) </td><td> EBIOScience </td><td> 11-5321 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-souris CD86, clone GL-1, conjugué à l&#39;allophycocyanine (APC)-Cy7 </td><td> Biolegend </td><td> 105030 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-souris CD40, clone 1C10, conjugué à l&#39;APC </td><td> eBioscience </td><td> 17-0401 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-souris CD209, clone 5h10, conjugués à la biotine </td><td> eBioscience </td><td> 13-2091 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-souris CD11b, clone M1/70, conjugué à Alexa Fluor 700 </td><td> eBioscience </td><td> 56-0112 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-souris F4/80, clone BM8, conjugué à la phycoérythrine (PE)-Cy7 </td><td> eBioscience </td><td> 25-4801 </td><td></td></tr><tr><td> PE-rouge Texas streptavidine conjuguée </td><td> BD Biosciences </td><td> 551487 </td><td></td></tr><tr><td> Autres fournitures et réactifs </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> L&#39;éthanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> A405-20 </td><td> Utilisé comme 70% (v / v) </td></tr><tr><td> Comprimé CO 2 </td><td> Linweld </td><td> 16000060 </td><td></td></tr><tr><td> Seringue de 1 ml </td><td> BD Biosciences </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> Souverain 3 ½ &quot;Père Tom Catcatheter </td><td> Kendall </td><td> 703021 </td><td></td></tr><tr><td> Prévention des risques biotechnologiques du Cabinet </td><td> NuAire </td><td> Série 22 </td><td></td></tr><tr><td> Ciseaux de dissection </td><td> Pêcheur </td><td> 138082 </td><td></td></tr><tr><td> Forceps </td><td> Roboz </td><td> RS-8254 </td><td></td></tr><tr><td> PBS 1X, sans calcium et de magnésium </td><td> Cellgro </td><td> 21-040-CM </td><td></td></tr><tr><td> 15 Tubes à centrifuger mL avec bouchon à vis </td><td> VWR International </td><td> 21008-216 </td><td></td></tr><tr><td> Tissue Culture Six-bien traités Plaques </td><td> Costar </td><td> 3516 </td><td></td></tr><tr><td> Portoirs pour tubes en plastique </td><td> Nalgene </td><td> 5970 </td><td></td></tr><tr><td> Grattoir à cellules 24 cm </td><td> PPT </td><td> 99002 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ml en polystyrène à fond rond Tube </td><td> Faucon </td><td> 352008 </td><td></td></tr><tr><td> Pipet-Aid XL </td><td> Drummond </td><td> 4-000-105 </td><td></td></tr><tr><td> 10, 5, et 2 mL Pipettes </td><td> Pêcheur </td><td> 13-675 </td><td></td></tr><tr><td> 200 et 10 ul micropipettes </td><td> Gilson Pipetman </td><td> F123601 </td><td></td></tr><tr><td> 200 et 10 embouts de pipette ul </td><td> Pêcheur </td><td> 02-707 </td><td></td></tr><tr><td> BD stabilisationFixateur </td><td> BD Biosciences </td><td> 338036 </td><td></td></tr><tr><td> Isoton II Diluant </td><td> Beckman-Coulter </td><td> 8546719 </td><td></td></tr><tr><td> Zap-oglobin II lytique réactif </td><td> Beckman-Coulter </td><td> 7546138 </td><td></td></tr><tr><td> Flacons Coulter polystyrène compteur </td><td> Beckman-Coulter </td><td> 14310-684 </td><td></td></tr><tr><td> Tubes à essai </td><td> BD Biosciences </td><td> 352008 </td><td></td></tr><tr><td> Équipement </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Centrifugeuse réfrigérée </td><td> Labnet </td><td> 50075040 </td><td></td></tr><tr><td> Incubateur humidifié CO 2 </td><td> Nuaire </td><td> Autoflow Modèle 8500 </td><td></td></tr><tr><td> Cytomètre en flux FACSCanto </td><td> BD Biosciences </td><td> 338960 </td><td></td></tr><tr><td> Compteur de particules Coulter Z1 </td><td> Beckman-Coulter </td><td> WS-Z1DUALPC </td><td></td></tr><tr><td> Équipement de traitement Sonicator liquide avec Microtip </td><td> Misonix </td><td> Modèle n ° S-4000 </td><td></td></tr></tbody></table>

harvesting murine alveolar macrophages and evaluating cellular activation induced by polyanhydride nanoparticles

Nanoparticules biodégradables ont émergé comme une plate-forme polyvalente pour la conception et la mise en œuvre de nouveaux vaccins par voie intranasale contre les maladies respiratoires infectieuses. En particulier, polyanhydride nanoparticules composé de l&#39;acide sébacique aliphatique (SA), l&#39;aromatique 1,6-bis (p-carboxyphénoxy) hexane (CPH), ou l&#39;amphiphile 1,8-bis (p-carboxyphénoxy) -3,6-dioxaoctane (CPTEG) afficher en vrac unique et cinétique d&#39;érosion de surface 1,2 et peut être exploitée afin de libérer lentement biomolécules fonctionnelles (par exemple, les antigènes protéiques, des immunoglobulines, etc) in vivo 3,4,5. Ces nanoparticules possèdent également une activité adjuvante intrinsèque, ce qui les rend un excellent choix pour une plate-forme d&#39;administration des vaccins 6,7,8. Afin d&#39;élucider les mécanismes qui régissent l&#39;activation de l&#39;immunité innée après la vaccination muqueuse nasale, il faut évaluer les réponses moléculaires et cellulaires de la p antigènecellules sentant (APC) responsables pour initier des réponses immunitaires. Les cellules dendritiques sont des APC principaux trouvés dans des voies aériennes, tandis que les macrophages alvéolaires (AMɸ) prédominent dans le parenchyme pulmonaire 9,10,11. AMɸ sont très efficaces dans l&#39;élimination des poumons de pathogènes microbiens et 12,13 débris cellulaires. En outre, ce type de cellule joue un rôle important dans le transport d&#39;antigènes microbiens vers les ganglions lymphatiques drainant, ce qui est une première étape importante dans l&#39;initiation d&#39;une réponse immunitaire adaptative 9. AMɸ également exprimer des niveaux élevés de reconnaissance de formes innée et récepteurs éboueurs, sécrètent des médiateurs pro-inflammatoires, et les lymphocytes T 12,14. Une population relativement pure de AMɸ (par exemple, supérieure à 80%) peut être facilement obtenu par un lavage du poumon à l&#39;étude dans le laboratoire. Resident AMɸ récoltées à partir de immunitaires des animaux compétentes de fournir un phénotype représentant des macrophages qui encounter le vaccin à base de particules in vivo. Ici, nous décrivons les protocoles utilisés pour la récolte et la culture AMɸ de souris et d&#39;examiner le phénotype d&#39;activation des macrophages après le traitement avec des nanoparticules polyanhydride in vitro.

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Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Ici, nous décrivons les protocoles pour la récolte des macrophages alvéolaires murins, qui sont des résidents cellules immunitaires innées dans le poumon, et en examinant leur activation en réponse à la co-culture avec des nanoparticules polyanhydride.

La récolte macrophages alvéolaires murins et l&#39;évaluation d&#39;activation cellulaire induite par des nanoparticules polyanhydride

Biodegradable nanoparticles have emerged as a  versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines  against respiratory ...

harvesting-murine-alveolar-macrophages-evaluating-cellular-activation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

19.7K vues.  Iowa State University. Ici, nous décrivons les protocoles pour la récolte des macrophages alvéolaires murins, qui sont des résidents cellules immunitaires innées dans le poumon, et en examinant leur activation en réponse à la co-culture avec des nanoparticules polyanhydride.

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Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to antigen presenting cells1-5. Internalization of nanoparticles (NP) by antigen presenting cells is a critical step in generating an effective immune response to the encapsulated antigen. To determine how changes in nanoparticle formulation impact function, we sought to develop a high throughput, quantitative experimental protocol that was compatible with detecting internalized nanoparticles as well as bacteria. To date, two independent techniques, microscopy and flow cytometry, have been the methods used to study the phagocytosis of nanoparticles. The high throughput nature of flow cytometry generates robust statistical data. However, due to low resolution, it fails to accurately quantify internalized versus cell bound nanoparticles. Microscopy generates images with high spatial resolution; however, it is time consuming and involves small sample sizes6-8. Multi-spectral imaging flow cytometry (MIFC) is a new technology that incorporates aspects of both microscopy and flow cytometry that performs multi-color spectral fluorescence and bright field imaging simultaneously through a laminar core. This capability provides an accurate analysis of fluorescent signal intensities and spatial relationships between different structures and cellular features at high speed.
	Herein, we describe a method utilizing MIFC to characterize the cell populations that have internalized polyanhydride nanoparticles or Salmonella enterica serovar Typhimurium. We also describe the preparation of nanoparticle suspensions, cell labeling, acquisition on an ImageStreamX system and analysis of the data using the IDEAS application. We also demonstrate the application of a technique that can be used to differentiate the internalization pathways for nanoparticles and bacteria by using cytochalasin-D as an inhibitor of actin-mediated phagocytosis.

In this article, we describe a method utilizing multi-spectral imaging flow cytometry to quantify the internalization of polyanhydride nanoparticles or bacteria by RAW 264.7 cells.

Analyser l&#39;internalisation cellulaire de nanoparticules et de bactéries multi-spectrale par cytométrie de flux d&#39;imagerie

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Recherche

Bio-ingénierie

High-throughput Synthesis of Carbohydrates and Functionalization of Polyanhydride Nanoparticles

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design efficacious vaccines carriers. Nanoparticle-based platforms can prolong the persistence of vaccine antigens, which could improve vaccine immunogenicity1. Several biodegradable polymers have been studied as vaccine delivery vehicles1; in particular, polyanhydride particles have demonstrated the ability to provide sustained release of stable protein antigens and to activate antigen presenting cells and modulate immune responses2-12.
The molecular design of these vaccine carriers needs to integrate the rational selection of polymer properties as well as the incorporation of appropriate targeting agents. High throughput automated fabrication of targeting ligands and functionalized particles is a powerful tool that will enhance the ability to study a wide range of properties and will lead to the design of reproducible vaccine delivery devices.
The addition of targeting ligands capable of being recognized by specific receptors on immune cells has been shown to modulate and tailor immune responses10,11,13 C-type lectin receptors (CLRs) are pattern recognition receptors (PRRs) that recognize carbohydrates present on the surface of pathogens. The stimulation of immune cells via CLRs allows for enhanced internalization of antigen and subsequent presentation for further T cell activation14,15. Therefore, carbohydrate molecules play an important role in the study of immune responses; however, the use of these biomolecules often suffers from the lack of availability of structurally well-defined and pure carbohydrates. An automation platform based on iterative solution-phase reactions can enable rapid and controlled synthesis of these synthetically challenging molecules using significantly lower building block quantities than traditional solid-phase methods16,17.
Herein we report a protocol for the automated solution-phase synthesis of oligosaccharides such as mannose-based targeting ligands with fluorous solid-phase extraction for intermediate purification. After development of automated methods to make the carbohydrate-based targeting agent, we describe methods for their attachment on the surface of polyanhydride nanoparticles employing an automated robotic set up operated by LabVIEW as previously described10. Surface functionalization with carbohydrates has shown efficacy in targeting CLRs10,11 and increasing the throughput of the fabrication method to unearth the complexities associated with a multi-parametric system will be of great value (Figure 1a).

In this article, a high throughput method is presented for the synthesis of oligosaccharides and their attachment to the surface of polyanhydride nanoparticles for further use in targeting specific receptors on antigen presenting cells.

À haut débit la synthèse des glucides et fonctionnalisation de nanoparticules polyanhydride

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

Évaluation de livraison Gene polymère nanoparticules d&#39;analyse de suivi par des nanoparticules et de cytométrie en flux à haut débit

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

PLGA Nanoparticles Formed by Single- or Double-emulsion with Vitamin E-TPGS

Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) is a biocompatible member of the aliphatic polyester family of biodegradable polymers. PLGA has long been a popular choice for drug delivery applications, particularly since it is already FDA-approved for use in humans in the form of resorbable sutures. Hydrophobic and hydrophilic drugs are encapsulated in PLGA particles via single- or double-emulsion. Briefly, the drug is dissolved with polymer or emulsified with polymer in an organic phase that is then emulsified with the aqueous phase. After the solvent has evaporated, particles are washed and collected via centrifugation for lyophilization and long term storage. PLGA degrades slowly via hydrolysis in aqueous environments, and encapsulated agents are released over a period of weeks to months. Although PLGA is a material that possesses many advantages for drug delivery, reproducible formation of nanoparticles can be challenging; considerable variability is introduced by the use of different equipment, reagents batch, and precise method of emulsification. Here, we describe in great detail the formation and characterization of microparticles and nanoparticles formed by single- or double-emulsion using the emulsifying agent vitamin E-TPGS. Particle morphology and size are determined with scanning electron microscopy (SEM). We provide representative SEM images for nanoparticles produced with varying emulsifier concentration, as well as examples of imaging artifacts and failed emulsifications. This protocol can be readily adapted to use alternative emulsifiers (e.g. poly(vinyl alcohol), PVA) or solvents (e.g.&#160;dichloromethane, DCM).

We describe the production and characterization of nanoparticles and microparticles composed of poly(lactic-co-glycolic acid) using vitamin E-TPGS as an emulsifier. By varying formulation parameters such as the concentration of emulsifier, it is possible to produce nanoparticles with mean diameters ranging from 220 nm to&#160;1.98 &#181;m.

Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) is a biocompatible member of the aliphatic polyester family of biodegradable polymers. PLGA has long been a popular ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

Utilisant une impédance Cell-substrat et imagerie de cellules vivantes pour mesurer les changements en temps réel dans adhésion cellulaire et De-adhérence induites par Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Microbiologically Induced Calcite Precipitation Mediated by Sporosarcina pasteurii

The particular bacterium under investigation here (S. pasteurii) is unique in its ability, under the right conditions, to induce the hydrolysis of urea (ureolysis) in naturally occurring environments through secretion of an enzyme urease. This process of ureolysis, through a chain of chemical reactions, leads to the formation of calcium carbonate precipitates. This is known as Microbiologically Induced Calcite Precipitation (MICP). The proper culture protocols for MICP are detailed here. Finally, visualization experiments under different modes of microscopy were performed to understand various aspects of the precipitation process. Techniques like optical microscopy, Scanning Electron Microscopy (SEM) and X-Ray Photo-electron Spectroscopy (XPS)&#160;were employed to chemically characterize the end-product. Further, the ability of these precipitates to clog pores inside a natural porous medium was demonstrated through a qualitative experiment where sponge bars were used to mimic a pore-network with a range of length scales. A sponge bar dipped in the culture medium containing the bacterial cells hardens due to the clogging of its pores resulting from the continuous process of chemical precipitation. This hardened sponge bar exhibits superior strength when compared to a control sponge bar which becomes compressed and squeezed under the action of an applied external load, while the hardened bar is able to support the same weight with little deformation.

Microbiologically Induced Calcite Precipitation Mediated by Sporosarcina pasteurii

Protocols for microbiologically induced calcite precipitation (MICP) using the bacterium Sporosarcina pasteurii are presented here. The precipitated calcium carbonate was characterized through optical microscopy and scanning electron microscopy (SEM). It is also shown that exposure to MICP increases the compressive strength of sponge.

Microbiologiquement Induced Précipitation de calcite Mediated par<em&gt; Sporosarcina pasteurii</em

The particular bacterium under investigation here (S. pasteurii) is unique in its ability, under the right conditions, to induce the hydrolysis of urea ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of medicine. In addition to efforts to identify novel small-molecule antimicrobial drugs, there has been great interest in the use of metal nanoparticles as coatings for medical devices, wound dressings, and consumer packaging, due to their antimicrobial properties. The wide variety of methods available for nanoparticle synthesis results in a broad spectrum of chemical and physical properties which can affect antibacterial efficacy. This manuscript describes the pulsed laser-ablation in liquids (PLAL) method to create nanoparticles. This approach allows for the fine tuning of nanoparticle size, composition, and stability using post-irradiation methods as well as the addition of surfactants or volume excluders. By controlling particle size and composition, a large range of physical and chemical properties of metal nanoparticles can be explored which may contribute to their antimicrobial efficacy thereby opening new avenues for antibacterial development.

The antimicrobial properties of metals such as copper and silver have been recognized for centuries. This protocol describes pulsed laser-ablation in liquids, a method of synthesizing metal nanoparticles that provides the ability to fine tune the properties of these nanoparticles to optimize their antimicrobial effects.

Production de nanoparticules métalliques par laser-ablation pulsée dans les liquides: un outil pour étudier les propriétés antibactériennes des nanoparticules

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of various diseases. This application relies on genetic modification, self-assembly, and cysteine conjugation to fulfill the tumor-targeting application of recombinant VLPs. Compared with genetic modification alone, chemical conjugation of foreign peptides to VLPs offers a significant advantage because it allows a variety of entities, such as synthetic peptides or oligosaccharides, to be conjugated to the surface of VLPs in a modulated and flexible manner without alteration of the VLP assembly.
Here, we demonstrate how to use the hepatitis E virus nanoparticle (HEVNP), a modularized theranostic capsule, as a multifunctional delivery carrier. Functions of HEVNPs include tissue-targeting, imaging, and therapeutic delivery. Based on the well-established structural research of HEVNP, the structurally independent and surface-exposed residues were selected for cysteine replacement as conjugation sites for maleimide-linked chemical groups via thiol-selective linkages. One particular cysteine-modified HEVNP (a Cys replacement of the asparagine at 573 aa (HEVNP-573C)) was conjugated to a breast cancer cell-specific ligand, LXY30 and labeled with near-infrared (NIR) fluorescence dye (Cy5.5), rendering the tumor-targeted HEVNPs as effective diagnostic capsules (LXY30-HEVNP-Cy5.5). Similar engineering strategies can be employed with other macromolecular complexes with well-known atomic structures to explore potential applications in theranostic delivery.

We have engineered the capsid protein of hepatitis E virus as a theranostic nanoparticle (HEVNP). HEVNP self-assembles into a stable icosahedral cage in mucosal delivery. Here, we describe the modification of HEVNPs for tumor targeting by mutating surface-exposed residues to cysteines, which conjugate synthetic ligands that specifically bind tumor cells.

Fonctionnalisation de surface des nanoparticules de Virus de l’hépatite E à l’aide de méthodes chimiques de conjugaison

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene expression regulation are commonly disrupted in many diseases, a locus-specific, endogenous, and reversible method to study and control these mechanisms of action has been lacking. To address this issue, we have developed and characterized novel gene-regulating bifunctional molecules. One component of the bifunctional molecule binds to a DNA-protein anchor so that it will be recruited to an allele-specific locus. The other component engages endogenous cellular chromatin-modifying machinery, recruiting these proteins to a gene of interest. These small molecules, called chemical epigenetic modifiers (CEMs), are capable of controlling gene expression and the chromatin environment in a dose-dependent and reversible manner. Here, we detail a CEM approach and its application to decrease gene expression and histone tail acetylation at a Green Fluorescent Protein (GFP) reporter located at the Oct4 locus in mouse embryonic stem cells (mESCs). We characterize the lead CEM (CEM23) using fluorescent microscopy, flow cytometry, and chromatin immunoprecipitation (ChIP), followed by a quantitative polymerase chain reaction (qPCR). While the power of this system is demonstrated at the Oct4 locus, conceptually, the CEM technology is modular and can be applied in other cell types and at other genomic loci.

Regulation of the chromatin environment is an essential process required for proper gene expression. Here, we describe a method for controlling gene expression through the recruitment of chromatin-modifying machinery in a gene-specific and reversible manner.

Réprimer la Transcription du gène en redirigeant la machinerie cellulaire avec des modificateurs chimiques épigénétiques

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Catalytic Scavenging of Plant Reactive Oxygen Species In Vivo by Anionic Cerium Oxide Nanoparticles

Reactive oxygen species (ROS) accumulation is a hallmark of plant abiotic stress response. ROS play&#160;a dual role in plants by acting as signaling molecules at low levels and damaging molecules at high levels. Accumulation of ROS in stressed plants can damage metabolites, enzymes, lipids, and DNA, causing a reduction of plant growth and yield. The ability of cerium oxide nanoparticles (nanoceria) to catalytically scavenge ROS in vivo provides a unique tool to understand and bioengineer plant abiotic stress tolerance. Here, we present a protocol to synthesize and characterize poly (acrylic) acid coated nanoceria (PNC), interface the nanoparticles with plants via leaf lamina infiltration, and monitor their distribution and ROS scavenging in vivo using confocal microscopy. Current molecular tools for manipulating ROS accumulation in plants are limited to model species and require laborious transformation methods. This protocol for in vivo ROS scavenging has the potential to be applied to wild type plants with broad leaves and leaf structure like Arabidopsis thaliana.

Catalytic Scavenging of Plant Reactive Oxygen Species In Vivo by Anionic Cerium Oxide Nanoparticles

Here, we present a protocol for the synthesis and characterization of cerium oxide nanoparticles (nanoceria) for ROS (reactive oxygen species) scavenging in vivo, nanoceria imaging in plant tissues by confocal microscopy, and in vivo monitoring of nanoceria ROS scavenging by confocal microscopy.

Nettoyage catalytique de plante oxygénées espèces In Vivo par des nanoparticules d’oxyde de cérium anioniques

Reactive oxygen species (ROS) accumulation is a hallmark of plant abiotic stress response. ROS play&#160;a dual role in plants by acting as signaling ...