Ce travail a été soutenu par l&#39;Institut national des allergies et des maladies infectieuses Grant R01AI079253 (BHS), et par l&#39;Institut national du cancer Cancer Center Support Grant CA016056 à Roswell Park Cancer Institute.

Toutes les procédures effectuées sur les animaux dans cette étude ont été approuvés par le soin et l&#39;utilisation des animaux Comité à Roswell Park Cancer Institute et respectées tout état, fédéral, et les Instituts nationaux de la réglementation de la santé. 1. In vivo des macrophages étiquetage Remarque: PHK26 est un colorant lipophile qui sera absorbé par les cellules phagocytaires à la fois dans la circulation et dans les tissus lorsqu&#39;ils sont administrés par voie intraveineuse (iv). PKH26 a été utilisé pour le marquage in vivo pour réduire au minimum la quantité de manipulation post-récolte du macrophage. PKH-26 présente l&#39;avantage d&#39;accumuler de manière stable dans les macrophages alvéolaires sur des périodes prolongées. Attendre 10 jours après l&#39;administration permet de liquidation de toutes les cellules marquées de la circulation, ne laissant que macrophages alvéolaires stable marqué par PKH26 8, 9. PKH26 est un fluorochrome rouge qui a excitation (551 nm) et d&#39;émission (567 nm) des caractéristiques compatiblesavec des systèmes de détection de la rhodamine ou la phycoérythrine. Toute procédure de marquage peut introduire artefact, y compris la perte de viabilité. Cependant, puisque nous utilisons la même approche pour l&#39;étiquetage des macrophages dans les génotypes de souris différentes (par exemple, WT vs la NADPH oxydase déficient), les effets de ces objets seraient uniformes. <ol><li> Diluer la solution mère de PKH26 (1 x 10 -3 M dans de l&#39;éthanol) 1:05 dans le diluant C fournie par le fabricant. </li><li> Charge: 100 ul de dilution PKH26 dans une seringue à insuline de 1/2 ml (29 G x 1/2 &quot;) pour chaque souris. </li><li> Administrer à des souris par injection intraveineuse (veine de la queue soit ou rétro orbital) au moins 10 jours avant la récolte. </li></ol> 2. Récolte macrophages alvéolaires par lavage broncho-alvéolaire (LBA) Le nombre de souris à utiliser pour une expérience peut varier. Un rendement typique d&#39;une souris non stimulées est de l&#39;ordre de 3-5 x 10 5 macrophages alvéolaires, mais ce nombre peut varier grandement Based sur des facteurs tels que la taille de la souris, l&#39;expérience de la personne effectuant le lavage, et le nombre d&#39;instillations de fluide de lavage et le volume retiré à partir de poumons. Dans ce protocole lavage pulmonaire est effectuée avec une cavité thoracique fermé qui, avec des lavages répétés 1 ml permet d&#39;augmenter le rendement de la cellule. <ol><li> Euthanize souris par administration d&#39;une dose létale d&#39;anesthésique Avertin (12,5 mg) par voie intrapéritonéale (ip) en utilisant des conditions aseptiques afin de maintenir la solution stérile. </li><li> Pulvériser la souris à fond avec de l&#39;éthanol 70%. </li><li> Enlever la peau à partir de l&#39;extrémité crânienne de l&#39;animal à exposer le thorax (figure 1A). <ol><li> Faire une petite incision dans la peau juste sous le diaphragme. </li><li> Insérez un doigt dans la coupe et tirez la peau à partir de l&#39;extrémité crânienne de l&#39;animal (figure 1A). </li><li> Appuyez légèrement sur ​​la tête, l&#39;extension de la face ventrale du cou (figure 1A). </li></ol></li><li> Découpez un petit trou à travers la cage thoraciquedans la partie droite du thorax pour dégonfler les poumons et également permettre la visualisation des poumons au cours des étapes suivantes. </li><li> Localiser la trachée, et soigneusement disséquer les tissus environnants. <ol><li> Retirez les glandes salivaires, les muscles sterno et du larynx, etc avec des pinces courbes. </li><li> Soulevez délicatement avec une pince courbes et couper avec des ciseaux le tissu mince recouvrant la trachée (adventice) révélant la structure du cartilage annelé sous-jacent. </li></ol></li><li> Insérer un cathéter dans la trachée. <ol><li> En utilisant des pinces incurvées, placer une suture derrière (dorsal à) la trachée et tirer une longueur de 10 cm à travers l&#39;ouverture. </li><li> Commençant au-dessus du cricoïde (l&#39;anneau épaissi de cartilage) guide attentivement un 22 G cathéter dans la trachée d&#39;arrêt où la trachée disparaît derrière le sternum. </li><li> Attacher solidement suture autour de la trachée et le cathéter pour un ajustement parfait. Retirer l&#39;aiguille du cathéter. </li></ol></li><li> Assembler 4 voies robinet. <ol><li> Remplirun 6 ml seringue avec du DPBS, 1% de FBS et attachent à 4 voies robinet comme indiqué sur la figure 1B. </li><li> Attacher un vide 6 ml seringue à la position indiquée sur la 4 voies robinet (figure 1B). </li><li> Fixez port ouvert sur ​​la 4 voies robinet à cathéter (figure 1B). Attention à ne pas déloger le cathéter de la trachée. </li></ol></li><li> Recueillir le liquide de lavage des poumons. Remarque: Les chercheurs peuvent choisir d&#39;utiliser la baisse des volumes de liquide de lavage pour minimiser la possibilité de dommages aux tissus. Il est important que la même approche soit appliquée de façon uniforme dans tous les groupes de souris. <ol><li> Tournez la poignée sur le robinet si la seringue vide est fermé et injecter lentement ~ 1 ml DPBS, 1% de FBS pour gonfler les poumons. Observer l&#39;inflation du poumon à travers le trou percé à l&#39;étape 2.4. </li><li> Veillez à ne PAS surgonfler les poumons. </li><li> Tournez la poignée sur le robinet de sorte que la seringue pleine est fermé, et retirer soigneusement la grippe<html> Identifiant à partir des poumons. </li><li> Respecter les poumons se dégonflent à travers le trou découpé dans l&#39;étape 1.4. Le cathéter peut être nécessaire de déplacer légèrement vers l&#39;arrière ou vers l&#39;avant pour obtenir un bon tirage. Prendre des précautions particulières pour maintenir le cathéter dans la trachée. </li><li> Répétez les étapes 2.8.1-2.8.4 5-6x jusqu&#39;à ce que tout le DPBS, 1% de FBS a été injecté et retiré les poumons. Remarque: la récupération de liquide pulmonaire ne sera pas 100% de fluide injecté. </li></ol></li><li> Seringue vide avec un lavage d&#39;un fluide dans un tube conique de 50 ml. Maintenir les cellules à température ambiante. </li><li> Pellet les cellules par centrifugation à 300 g pendant 5 min à température ambiante et verser le surnageant. Ceci peut être sauvegardé pour l&#39;analyse des cytokines, si désiré. </li><li> Remettre les cellules en 1-5 ml de RPMI 1640 avec 10% de FBS et compter sur un hématimètre. Chez la souris, non stimulé,&gt; 95% des cellules récoltées par BAL sont censés être des macrophages, qui peuvent être confirmés par cytologie. </li></ol> 3. Mise en culture et de récolte du champignon »&gt; L&#39;Aspergillus fumigatus utilisé dans ce protocole exprime la GFP à tous les stades de son cycle de vie:. Spores et des hyphes, germlings Cette souche fongique a été fourni par le Dr Margo Moore, de l&#39;Université Simon Fraser, Burnaby, BC, Canada. <ol><li> Plate conidies d&#39;une souche d&#39;Aspergillus fumigatus exprimant la GFP sur Sabouraud infusion cœur-cervelle (BHI) avec des pentes de gélose chloramphénicol (0,05 g / L) et de gentamicine (0,5 g / L). </li><li> Incuber dans l&#39;obscurité bouchée non hermétiquement pendant 7 à 10 jours à température ambiante. </li><li> Récolte des conidies par lavage oblique avec 10 ml de 0,01% de Tween 20 dans du DPBS. Légèrement gratter le champignon avec le Stripette à desserrer. Rincer la pente à plusieurs reprises pour augmenter le rendement. </li><li> Passez suspension de conidies par un tamis cellulaire 100 um dans 50 ml conique. </li><li> Pellet conidies par centrifugation à 400 xg pendant 10 min. </li><li> Remettre en suspension dans 50 ml conidies DPBS et compte en utilisant un hématimètre. </li><li> Laver deux fois avec du DPBS et diluer à concentration souhaitéstration. </li></ol> 4. Défi fongique et la microscopie confocale Pour étudier le rôle de la NADPH oxydase dans les macrophages défense de l&#39;hôte, la capacité de macrophages alvéolaires isolés à partir de souris de trois génotypes pour contrôler la croissance des spores d&#39;Aspergillus phagocytés a été évaluée. Les génotypes utilisés dans cette étude sont les suivantes; 1) des souris de type sauvage, 2) Ncf1 * / * Mn-souris avec une mutation Ncf1 d&#39;origine naturelle (Ncf1 code pour p47phox, un composant nécessaire du oxydase phagocytaire de NADPH) en leur laissant la NADPH oxydase déficiente, et 3) Ncf1 * / * Mn + souris transgéniques (MN dénote hébergeant le transgène de type sauvage Ncf1 sous le contrôle du promoteur de CD68 humain) où l&#39;activité de la NADPH oxydase a été reconstitué dans la population de monocytes / macrophages 10, 11. La microscopie confocale est plus adapté pour ce dosage en raison de la présenceet la croissance des conidies non phagocyté sur les glissières. Le microscope confocal permet la visualisation de plans individuels au sein de l&#39;axe Z, et de permettre une différenciation entre un champignon croissant autour plutôt qu&#39;à l&#39;intérieur des macrophages. Toutes les images confocales sont acquises à l&#39;aide d&#39;une lentille 63X à immersion d&#39;huile. Z-piles sont acquises avec un facteur de zoom électronique de 2,5. L&#39;épaisseur d&#39;une pile en Z est déterminée à l&#39;aide du DAPI et les images de champ lumineux pour localiser le haut et le bas du champ. Z-piles allaient du 14 au 24 pm avec des tranches individuelles ~ 1 um d&#39;épaisseur. Pour la quantification des macrophages, des analyses simples de 1X zoom électronique ont été réalisées sur 10 champs par génotype. Macrophages intactes ont été identifiés sur la base de la coloration DAPI PKH26 et de la membrane et le noyau, respectivement. Les conidies ont été identifiés sur la base de l&#39;image de champ lumineux expression FITC et. <ol><li> Préparer des lamelles et des plaques stériles <ol><li> En vertu d&#39;une enceinte de sécurité biologique, faire tremper 22 x 22 mm lamelles de verre dans 70% ethanol pendant 5-10 min. </li><li> Rincer lamelles dans du PBS stérile. </li><li> En utilisant des pinces stériles, placer délicatement une seule lamelle dans le fond de chaque puits d&#39;un seul emballé plaque de 6 puits stérile. </li></ol></li><li> Graine ~ 1 x 10 6 récolté PKH26 étiqueté macrophages alvéolaires en suspension dans 300 ul de RPMI 1640, FBS à 10% sur chaque lamelle couvre-objet. Le nombre exact peut varier en fonction du rendement de la récolte. </li><li> Laisser macrophages adhèrent à incuber à 37 ° C avec 5% de CO2 pendant une nuit. </li><li> Le lendemain matin, ajouter environ 1 x 10 7 exprimant la GFP A. fumigatus conidies en suspension dans 100 ul préchauffé (37 ° C) du milieu RPMI 1640 contenant 10% de FBS. </li><li> Plaque revenir à 37 ° C incubateur avec 5% de CO 2. </li><li> Les cellules doivent être fixées pour un minimum de 2 heures à la température ambiante ou une nuit à 4 ° C. A 3, 7, 14 h et les cellules de correctifs en ajoutant un volume égal de 2% de formaldéhyde dans chaque puits (concentration finale de 1% de formaldehyde). La place de plaques pour lapoints de temps au début à 4 ° C durant la nuit. Pour l&#39;instant final (14 h), fixer les cellules à température ambiante pendant 2 heures. </li><li> Après fixation, retirez délicatement les lamelles à l&#39;aide des pinces et rincer dans du DPBS. </li><li> Éliminer le liquide en excès en mettant le bord de la lamelle couvre-objet sur un Kimwipe pliée. </li><li> Appliquer 6 fluorescence ul de milieu de montage avec DAPI à une lame de microscope en verre. </li><li> Placer un bord de la lamelle sur la lame et déposer délicatement avec le côté de la cellule vers le bas dans le milieu de montage. Milieu de montage se propage et former une couche uniforme sous la lamelle. Il n&#39;est pas nécessaire d&#39;appuyer sur la lamelle. </li><li> Sceller les bords de la lamelle avec du vernis à ongles transparent et laisser sécher à l&#39;air. </li><li> Magasin préparé des diapositives dans une boîte de glissement (abri de la lumière) à la température ambiante jusqu&#39;au moment de l&#39;analyse par microscopie confocale. </li></ol>

<ol>
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Observations on these two lines of defense in vivo and in vitro with human and mouse phagocytes.</a> J Clin Invest. 69, 617-631 (1982).</li><li>Philippe, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killing+of+Aspergillus+fumigatus+by+alveolar+macrophages+is+mediated+by+reactive+oxidant+intermediates.">Killing of Aspergillus fumigatus by alveolar macrophages is mediated by reactive oxidant intermediates.</a> Infect Immun. 71, 3034-3042 (2003).</li><li>Cornish, E. 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F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+polarization+of+alveolar+macrophages+and+bone+marrow-derived+monocytes+following+chemically+and+pathogen-induced+chronic+lung+inflammation.">Differential polarization of alveolar macrophages and bone marrow-derived monocytes following chemically and pathogen-induced chronic lung inflammation.</a> J Leukoc Biol. 88, 159-168 (2010).</li><li>Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. I., Davis, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killing+of+Aspergillus+spores+depends+on+the+anatomical+source+of+the+macrophage.">Killing of Aspergillus spores depends on the anatomical source of the macrophage.</a> Infect Immun. 42, 1109-1115 (1983).</li><li>Goodridge, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+use+of+CARD9+by+dectin-1+in+macrophages+and+dendritic+cells.">Differential use of CARD9 by dectin-1 in macrophages and dendritic cells.</a> J Immunol. 182, 1146-1154 (2009).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

En utilisant cette approche ex vivo pour l&#39;analyse de l&#39;activité antifongique des macrophages avec challenge in vivo fongique, nous avons précédemment montré que la NADPH oxydase dans les macrophages jouent un rôle important dans la défense contre A. fumigatus 4. L&#39;utilisation de macrophages alvéolaires isolés nous permet de mettre l&#39;accent sur ​​leur activité antifongique en l&#39;absence d&#39;autres cellules du système immunitaire (par exemple,</...

Les macrophages alvéolaires sont des cellules phagocytaires de première ligne qui rencontrent des microbes inhalés. Macrophages reconnaissent motifs Aspergillus par pathogènes récepteurs de reconnaissance, ingèrent et limitent la croissance des spores inhalées (conidies), et d&#39;initier des réactions inflammatoires. La NADPH oxydase phagocytaire convertit l&#39;oxygène moléculaire en anion superoxyde et des intermédiaires réactifs de l&#39;oxygène en aval (ROI). Granulomatose chronique (CGD) est un trouble héréditaire de la NADPH oxydase caractérisée par des infections bactériennes et fongiques graves et par des réactions inflammatoires excessives. Bien que la NADPH oxydase est essentiel pour la défense de l&#39;hôte médiée par les neutrophiles 1 - 3, l&#39;importance de la NADPH oxydase dans les macrophages n&#39;est pas bien définie. Des études antérieures ont montré que les macrophages alvéolaires ingèrent et tuent les spores d&#39;Aspergillus, alors que les neutrophiles principalement cibler le stade des hyphes 5. Cependant, il ya eu des résul contradictoirests sur le rôle de la NADPH oxydase dans les macrophages dans le contrôle de la croissance de A. fumigatus spores 6, 7. Le but de cette méthode était de délimiter le rôle spécifique de la NADPH oxydase dans les macrophages dans la médiation de défense de l&#39;hôte contre A. spores fumigatus. Nous avons constaté que la NADPH oxydase dans les macrophages alvéolaires contrôle la croissance de A. phagocyté fumigatus spores 4. Pour modéliser le plus à la réponse de l&#39;hôte aux champignons inhalés, nous avons utilisé les macrophages alvéolaires récoltés par lavage broncho-alvéolaire des souris non stimulées immédiatement après le sacrifice. L&#39;utilisation de macrophages alvéolaires isolés nous a permis de mettre l&#39;accent sur ​​leur activité antifongique en l&#39;absence d&#39;autres cellules du système immunitaire (par exemple, des neutrophiles recrutés) qui défendent contre Aspergillus in vivo. Dans ce procédé, les macrophages alvéolaires ont été colorées in vivo avant la récolte de manière à minimiser la quantité de manipulation post-récolte. &lt;/ P&gt; Un autre avantage de ce protocole est l&#39;utilisation d&#39;un A. exprimant la GFP souche fumigatus. Ce champignon exprime la GFP de la scène conidies par le stade des hyphes et n&#39;a pas besoin de plus d&#39;une coloration. Pour obtenir des images avec plus de détails, nous avons choisi la microscopie confocale, qui permet la reconstruction de structures en trois dimensions à partir des images obtenues. Reconstruction tridimensionnelle donne la possibilité de différencier les hyphes croissante autour plutôt que dans ou à travers un macrophage. Conidies peut aussi être précisément distingués comme intracellulaire contre extracellulaire.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">PKH26GL-1KT</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2,2,2 Tribromoethanol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T48402</td>
			<td>Used to make AvertinAnesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2-methyl-2-butanol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A-1685</td>
			<td>Used to make AvertinAnesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (without calcium and magnesium)</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">NH4CL</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A0171</td>
			<td>Used to make ACK red cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">KHCO3</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P91444</td>
			<td>Used to make ACK red cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDTA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E6758</td>
			<td>Used to make ACK red cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">22 gauge X 1.00 inch i.v. catheter</td>
			<td style="width:71px;">BD&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">381523</td>
			<td>Insyte Autoguard Winged</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">insulin syringes</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">6 ml syringes</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">4-way stopcock</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">50-700-077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">suture thread</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50 ml conical centrifuge tubes</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">gauze sponges (4 inch square)</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RPMI 1640 with L-glutamine</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:71px;">Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">SH30396.03</td>
			<td>heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hema 3 Stain Set</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22-122-911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cytoseal 60</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">8310-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Sabouraud Brain Heart Infusion Agar with Chloramphenicol and Gentamicin Slants</td>
			<td style="width:71px;">BD&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">297252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Aspergillus fumigatous strain expressing green fluorescent protein</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>provided by Dr Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Canada</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">100 micron Cell Strainers</td>
			<td style="width:71px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">64753-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">scissors</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">forceps</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Biological Safety Cabinet Class II</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sorval ST40 Centrifuge with swing bucket rotor</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Leica DM1000 light microscope</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cytospin 2 centrifuge</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">Cell Culture Incubator</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>37 &#176;C, 5%&#160; CO2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">22X22 mm micro cover glass</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">48366-227</td>
			<td>glass coverslips</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">6 well Cell Culture Plates</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td align="right" style="width:119px;">3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BDH0502-1LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Vectashield Mounting medium with DAPI</td>
			<td style="width:71px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Leica TCS SP2 system with a laser point scanner</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Mounted on DMIRE2 fluorescence microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing anti-fungal activity of isolated alveolar macrophages by confocal microscopy

Le poumon est une interface où les cellules hôtes sont fréquemment exposés à des microbes et des produits microbiens. Les macrophages alvéolaires sont des cellules phagocytaires de première ligne qui rencontrent des champignons et d&#39;autres microbes inhalés. Macrophages et d&#39;autres cellules immunitaires reconnaissent motifs Aspergillus par pathogènes récepteurs de reconnaissance et d&#39;initier des réactions inflammatoires en aval. L&#39;oxydase phagocyte NADPH génère des intermédiaires réactifs de l&#39;oxygène (ROI) et est essentiel pour la défense de l&#39;hôte. Bien que la NADPH oxydase est essentiel pour la défense de l&#39;hôte médiée par les neutrophiles 1 - 3, l&#39;importance de la NADPH oxydase dans les macrophages n&#39;est pas bien définie. Le but de cette étude était de définir le rôle spécifique de la NADPH oxydase dans les macrophages dans la médiation de défense de l&#39;hôte contre A. fumigatus. Nous avons constaté que la NADPH oxydase dans les macrophages alvéolaires contrôle la croissance de A. phagocyté fumigatus spores 4. Ici, nous décrivons une méthode pour évaluer la capacité des souris unmacrophages lveolar (AMS) pour contrôler la croissance des spores d&#39;Aspergillus phagocytés (conidies). Les macrophages alvéolaires sont colorées in vivo et dix jours plus tard isolées à partir de souris par lavage broncho-alvéolaire (BAL). Les macrophages sont étalées sur des lamelles de verre, puis ensemencées avec la protéine fluorescente verte (GFP) exprimant A. spores fumigatus. À des moments précis, les cellules sont fixées et le nombre de macrophages avec des spores intactes phagocytées est évaluée par microscopie confocale.

<html> Collecte des macrophages alvéolaires par BAL de souris non stimulés se traduira par une population pure à&gt; 95% sur la base de la cytologie. Le 3 et 7 h (Figure 2) points de temps précèdent le stade des hyphes de la croissance fongique et permettent une comparaison de l&#39;efficacité de phagocytose des conidies chez les génotypes. Le point de temps de 14 h est l&#39;endroit où les génotypes peuvent être comparées en ce qui concerne l&#39;aptitude à inhiber la transition de conidies ...

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Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

Une méthode pour évaluer la capacité des macrophages alvéolaires isolés de la souris pour contrôler la croissance des spores d&#39;Aspergillus phagocytées par microscopie confocale.

Évaluation de l&#39;activité anti-fongique isolé macrophages alvéolaires par microscopie confocale

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.4K vues.  Roswell Park Cancer Institute.  Une méthode pour évaluer la capacité des macrophages alvéolaires isolés de la souris pour contrôler la croissance des spores d'Aspergillus phagocytées par microscopie confocale. 

Vidéo: Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. Thus, in vivo imaging of malaria parasites during pre-erythrocytic stages have revealed the active entrance of parasites into skin lymph nodes 3, the complete development of the parasite in the skin 4, and the formation of a hepatocyte-derived merosome to assure migration and release of merozoites into the blood stream 5. Moreover, the development of individual parasites in erythrocytes has been recently documented using 4D imaging and challenged our current view on protein export in malaria 6. Thus, intravital imaging has radically changed our view on key events in Plasmodium development. Unfortunately, studies of the dynamic passage of malaria parasites through the spleen, a major lymphoid organ exquisitely adapted to clear infected red blood cells are lacking due to technical constraints.
Using the murine model of malaria Plasmodium yoelii in Balb/c mice, we have implemented intravital imaging of the spleen and reported a differential remodeling of it and adherence of parasitized red blood cells (pRBCs) to barrier cells of fibroblastic origin in the red pulp during infection with the non-lethal parasite line P.yoelii 17X as opposed to infections with the P.yoelii 17XL lethal parasite line 7. To reach these conclusions, a specific methodology using ImageJ free software was developed to enable characterization of the fast three-dimensional movement of single-pRBCs. Results obtained with this protocol allow determining velocity, directionality and residence time of parasites in the spleen, all parameters addressing adherence in vivo. In addition, we report the methodology for blood flow quantification using intravital microscopy and the use of different colouring agents to gain insight into the complex microcirculatory structure of the spleen. 
Ethics statement
All the animal studies were performed at the animal facilities of University of Barcelona in accordance with guidelines and protocols approved by the Ethics Committee for Animal Experimentation of the University of Barcelona CEEA-UB (Protocol No DMAH: 5429). Female Balb/c mice of 6-8 weeks of age were obtained from Charles River Laboratories.

We show the method for performing intravital microscopy of the spleen using GFP transgenic malaria parasites and the quantification of parasite mobility and blood flow within this organ.

Microscopie intravitale de la rate: Analyse quantitative de la mobilité des parasites et la circulation sanguine

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Recherche

Immunologie et infection

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques enable the observation of live cellular behavior inside the organ but can be challenging in some types of cancer due to organ and tumor accessibility such as intestine. Direct observation of intestinal tumors has not been previously reported. A surgical procedure described here allows direct observation of myeloid cell dynamics within the intestinal tumors in live mice by using transgenic fluorescent reporter mice and injectable tracers or antibodies. For this purpose, a four-color, multi-region, micro-lensed spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid image acquisition has been used. ApcMin/+ mice that develop multiple adenomas in the small intestine are crossed with c-fms-EGFP mice to visualize myeloid cells and with ACTB-ECFP mice to visualize intestinal epithelial cells of the crypts. Procedures for labeling different tumor components, such as blood vessels and neutrophils, and the procedure for positioning the tumor for imaging through the serosal surface are also described. Time-lapse movies compiled from several hours of imaging allow the analysis of myeloid cell behavior in situ in the intestinal microenvironment.

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

Imagerie en temps réel des cellules myéloïdes Dynamique<em&gt; Apc<sup&gt; Min / +</sup</em&gt; Intestinale tumeurs par Spinning Disk microscopie confocale

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. Transfection with siRNA and plasmid DNA is an efficient tool for studying their function, but transfection of macrophages is not a trivial matter. Although many different approaches for transfection of eukaryotic cells are available, only few allow reliable and efficient transfection of macrophages, but reduced cell vitality and severely altered cell behavior like diminished capability for differentiation or polarization are frequently observed. Therefore a transfection protocol is required that is capable of transferring siRNA and plasmid DNA into macrophages without causing serious side-effects thus allowing the investigation of the effect of the siRNA or plasmid in the context of normal cell behavior. The protocol presented here provides a method for reliably and efficiently transfecting human THP-1 macrophages and monocytes with high cell vitality, high transfection efficiency, and minimal effects on cell behavior. This approach is based on Nucleofection and the protocol has been optimized to maintain maximum capability for cell activation after transfection. The protocol is adequate for adherent cells after detachment as well as cells in suspension, and can be used for small to medium sample numbers. Thus, the method presented is useful for investigating gene regulatory effects during macrophage differentiation and polarization. Apart from presenting results characterizing macrophages transfected according to this protocol in comparison to an alternative chemical method, the impact of cell culture medium selection after transfection on cell behavior is also discussed. The presented data indicate the importance of validating the selection for different experimental settings.

This protocol presents an efficient and reliable method to transfect human THP-1 macrophages with siRNA or plasmid DNA by electroporation with high transfection efficiency while maintaining high cell vitality and full macrophage capacity for differentiation and polarization.

La transfection très efficace des droits de THP-1 par les macrophages nucléofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The key role of macrophages has been shown in various pathological disorders such as inflammatory, immunological, and infectious diseases. In this protocol, we use primary cultures of human monocyte-derived macrophages that can be differentiated into the M1 (pro-inflammatory) or the M2 (anti-inflammatory) phenotype. This in vitro model is reliable for studying the biological activities of M1 and M2 macrophages and also for a proteomic approach. Proteomic techniques are useful for comparing the phenotype and behaviour of M1 and M2 macrophages during host pathogenicity. 2D gel electrophoresis is a powerful proteomic technique for mapping large numbers of proteins or polypeptides simultaneously. We describe the protocol of 2D electrophoresis using fluorescent dyes, named 2D Differential Gel Electrophoresis (DIGE). The M1 and M2 macrophages proteins are labelled with cyanine dyes before separation by isoelectric focusing, according to their isoelectric point in the first dimension, and their molecular mass, in the second dimension. Separated protein or polypeptidic spots are then used to detect differences in protein or polypeptide expression levels. The proteomic approaches described here allows the investigation of the macrophage protein changes associated with various disorders like host pathogenicity or microbial toxins.

Macrophages are the key cells involved in host pathogenicity. Macrophages display phenotypic and functional diversity that can be analysed and detected by proteomic analysis. This article describes how to perform 2D electrophoresis of primary cultures of human macrophages differentiated into M1 or M2 phenotype.

Protéomique profilage des macrophages par électrophorèse 2D

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. However, they are difficult to isolate in sufficient numbers to study them in detail, therefore, in vitro models have been developed. In vitro cultures of bone marrow-derived macrophages and dendritic cells are well-established and valuable methods for immunological studies. Here, a method for culturing and identifying both DCs and macrophages from a single culture of primary mouse bone marrow cells using the cytokine granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) is described. This protocol is based on the established procedure first developed by Lutz et al. in 1999 for bone marrow-derived DCs. The culture is heterogeneous, and MHCII and fluoresceinated hyaluronan (FL-HA) are used to distinguish macrophages from immature and mature DCs. These GM-CSF derived macrophages provide a convenient source of in vitro derived macrophages that closely resemble alveolar macrophages in both phenotype and function.

Bone marrow cells cultured with granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) generate a heterogeneous culture containing macrophages and dendritic cells (DCs). This method highlights using MHCII and hyaluronan (HA) binding to differentiate macrophages from the DCs in the GM-CSF culture. Macrophages in this culture have many similarities to alveolar macrophages.

Génération et identification de GM-CSF dérivé alvéolaires comme Macrophages et cellules dendritiques à partir de moelle osseuse de souris

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal disease. Macrophages are heterogeneous cells that have been implicated in kidney injury. Macrophages may be classified into two different phenotypes: classically activated macrophages (M1 macrophages), that release pro-inflammatory cytokines and promote fibrosis; and alternatively activated macrophages (M2 macrophages) that are associated with immunoregulatory and tissue-remodeling functions. These macrophage phenotypes need to be discriminated and analyzed to determine their contribution to renal injury. However, there are scarce studies reporting consistent phenotypic and functional information about macrophage subtypes in inflammatory renal disease models, especially in rats. This fact may be related to the limited macrophage markers used in rats, contrary to mice. Therefore, novel strategies are necessary to quantify and characterize the renal content of these infiltrating cells in a reliable way. This manuscript details a protocol for kidney digestion and further phenotypic and quantitative analysis of macrophages from rat kidneys by flow cytometry. Briefly, kidneys were incubated with collagenase and total macrophages were identified according to the dual presence of CD45 (leukocytes common antigen) and CD68 (PAN macrophage marker) in live cells.This was followed by surface staining of CD86 (M1 marker) and CD163 (M2 marker). Rat peritoneal macrophages were used as positive control for macrophage marker detection by flow cytometry. Our protocol resulted in low cellular mortality and allowed characterization of different intracellular and surface protein markers, thus limiting the loss of cellular integrity observed in other protocols. Moreover, this procedure allows the use of macrophages for further techniques, including cell sorting and mRNA or protein expression studies, among others.

This manuscript describes a detailed protocol for phenotypic and quantitative analysis of resident macrophages from rat kidneys by flow cytometry. The resulting stained cells can be also used for other applications, including cell sorting, gene expression analysis or functional studies, thus increasing the information obtained in the experimental model.

Caractérisation phénotypique des macrophages du Rat Kidney par cytométrie de flux

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. Diet-induced obesity (DIO) is a valuable model in studying the role of macrophage heterogeneity; however, adequate macrophage isolations are difficult to acquire from inflamed tissues. In this protocol, we outline the isolation steps and necessary troubleshooting guidelines derived from our studies for obtaining a suitable population of tissue-resident macrophages from mice following 18 weeks of high-fat (HFD) or high-fat/high-cholesterol (HFHCD) diet intervention. This protocol focuses on three hallmark tissues studied in obesity and atherosclerosis including the liver, white adipose tissues (WAT), and the aorta. We highlight how dualistic usage of flow cytometry can achieve a new dimension of isolation and characterization of tissue-resident macrophages. A fundamental section of this protocol addresses the intricacies underlying tissue-specific enzymatic digestions and macrophage isolation, and subsequent cell-surface antibody staining for flow cytometric analysis. This protocol addresses existing complexities underlying fluorescent-activated cell sorting (FACS) and presents clarifications to these complexities so as to obtain broad range characterization from adequately sorted cell populations. Alternate enrichment methods are included for sorting cells, such as the dense liver, allowing for flexibility and time management when working with FACS. In brief, this protocol aids the researcher to evaluate macrophage heterogeneity from a multitude of inflamed tissues in a given study and provides insightful troubleshooting tips that have been successful for favorable cellular isolation and characterization of immune cells in DIO-mediated inflammation.

This protocol allows a researcher to isolate and characterize tissue-resident macrophages in various hallmark inflamed tissues extracted from diet-induced models of metabolic disorders.

Isolement, caractérisation et Purification des Macrophages dans les tissus touchés par l’Inflammation associées à l’obésité

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal microscopy methods to visualize macrophage extracellular traps (METs). These extracellular traps are defined by the presence of extracellular chromatin with co-expression of other components such as granule proteases, citrullinated histones, and peptidyl arginase deiminase (PAD). The expression of METs is generally measured after exposure to a stimulus and compared to un-stimulated samples. Samples are also included for background and isotype control. Cells are analyzed using well-defined image analysis software. Confocal microscopy may be used to define the presence of METs both in vitro and in vivo in lung tissue.

Macrophage extracellular traps are a newly described entity. This article will concentrate on confocal microscopy methods and how they are visualized in vitro and in vivo from lung samples.

Visualisation des pièges extracellulaires de Macrophage à l’aide de la microscopie confocale

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Isolement et la Culture In Vitro de Macrophages alvéolaires murines et humaines

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of the actin cytoskeleton to capture, envelop and engulf large particles. Although phagocytic receptors, downstream signaling pathways, and effectors, such as Rho GTPases, have been identified, the dynamic cytoskeletal remodeling of specific receptor-mediated phagocytic events remain unclear. Four decades ago, two distinct mechanisms of phagocytosis, exemplified by Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)- and complement receptor (CR)-mediated phagocytosis, were identified using scanning electron microscopy. Binding of immunoglobulin G (IgG)-opsonized particles to Fc&#947;Rs triggers the protrusion of thin membrane extensions, which initially form a so-called phagocytic cup around the particle before it becomes completely enclosed and retracted into the cell. In contrast, complement opsonized particles appear to sink into the phagocyte following binding to complement receptors. These two modes of phagocytosis, phagocytic cup formation and sinking in, have become well established in the literature. However, the distinctions between the two modes have become blurred by reports that complement receptor-mediated phagocytosis may induce various membrane protrusions. With the availability of high resolution imaging techniques, phagocytosis assays are required that allow real-time 3D (three dimensional) visualization of how specific phagocytic receptors mediate the uptake of individual particles. More commonly used approaches for the study of phagocytosis, such as end-point assays, miss the opportunity to understand what is happening at the interface of particles and phagocytes. Here we describe phagocytic assays, using time-lapse spinning disk confocal microscopy, that allow 3D imaging of single phagocytic events. In addition, we describe assays to unambiguously image Fc&#947; receptor- or complement receptor-mediated phagocytosis.

Here we describe methods using spinning disk confocal microscopy to image single phagocytic events by mouse resident peritoneal macrophages. The protocols can be extended to other phagocytic cells.

Time-lapse imagerie 3D de phagocytose par les Macrophages de souris

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...