Les auteurs tiennent à remercier le personnel du département de la biotechnologie pharmaceutique et biologie moléculaire et en particulier Monique De Pelsmacker pour la préparation du virus radioactifs étiquetés. Nous sommes reconnaissants à Ellen Merckx et Hadewijch Halewyck pour leurs remarques et discussions intéressantes et de Gerrit De Bleeser pour son aide dans le laboratoire. Ce travail a été soutenu financièrement par une subvention de OZR la Vrije Universiteit Brussel (OZR1807), le Fonds voor Onderzoek Vlaanderen Wetenschappelijk (G.0168.10N) et l&#39;Organisation mondiale de la Santé (TSA 200 410 791). Lise Schotte est un garçon prédoctoral de la Fonds voor Onderzoek Vlaanderen Wetenschappelijk (FWO).

Le principe (A) et un aperçu de la méthode (B) sont représentés dans la figure 1. 1. Préparation de la mémoire tampon <ol><li> Préparer Reliure / tampon de lavage en dissolvant le dihydrogénophosphate de sodium (50 mM) et de chlorure de sodium (300 mM) dans de l&#39;eau et ajuster le pH à 8,0. En outre ajouter Tween 20 (0,01% (m / v) concentration finale), la méthionine (2% (m / v) concentration finale) et l&#39;albumine (0,1% (m / v) concentration finale) et ajuster le volume requis. </li></ol> 2. Préparation des billes magnétiques Préparer les billes magnétiques, selon le manuel d&#39;instruction. En bref: <ol><li> Remettre en suspension les perles magnétiques en utilisant un vortex. </li><li> Transfert, pour chaque échantillon, 10 pl des billes en suspension magnétique (40 mg / ml) dans un tube. </li><li> Recueillir les billes magnétiques en utilisant un aimant, jusqu&#39;à ce que le surnageant est clair (+ / - 30 secondes) et retirer le surnageant avec précaution. </li><li> Laver lebilles magnétiques à deux reprises: remettre en suspension les billes dans 150 pi de reliure / tampon de lavage. Migrer les billes magnétiques à un côté du tube à l&#39;aide d&#39;un aimant jusqu&#39;à ce que le surnageant est clair et retirez soigneusement le surnageant. </li><li> Utilisez 40 pl de reliure / tampon de lavage, pour chaque échantillon, pour remettre en suspension les perles (10 mg / ml). </li></ol> 3. Essai de capture par affinité Remarque: Pour mesurer la radioactivité naturelle (cosmique) (0% de la radioactivité), aucun virus radiomarqué est ajouté à un échantillon de contrôle 1. Au lieu de cela, le même volume reliure / tampon de lavage est ajouté. Note: radioactivité de 100% est définie par une 2 échantillon de contrôle à laquelle tous les composants sont ajoutés à l&#39;exception du Nanobody. Au lieu de cela, le même volume reliure / tampon de lavage est ajouté. <ol><li> Apportez 2000 cpm de 35 S étiquetés (β-rayonnement) du poliovirus Sabin souche de type 1 9, dilué avec de reliure / tampon de lavage à 80 ul dans une plaque de microtitrage à 96 puits. </li><li> Ajouter 10 &amp; mu; l de dilution Nanobodies dans les puits. </li><li> Mélanger pendant environ 10 secondes en utilisant un agitateur. </li><li> Laisser les échantillons à incuber pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Ajouter 40 ul de la suspension lavée billes magnétiques et incuber pendant 10 minutes à température ambiante, sous agitation continue. </li><li> Séparer les billes et le surnageant en utilisant un aimant et transférer le surnageant autorisés à pénétrer dans un tube. </li></ol> 4. Mesure de la radioactivité <ol><li> Transférer 50 ul du surnageant de l&#39;étape 3.6 dans une fiole de comptage. </li><li> Ajouter 3 ml de liquide de scintillation et mélanger. Mesurer la radioactivité dans un compteur à scintillation β-. </li></ol> 5. Le recyclage des Perles <ol><li> Collecter les perles utilisées magnétiques dans un tube et centrifuger à 500 xg pendant 2 minutes ou jusqu&#39;à ce que d&#39;un surnageant limpide est obtenue. </li><li> Eliminer le surnageant et remettre en suspension les perles dans 6 ml de NaOH 0,5 M. </li><li> Transférer la suspension dans Multipltubes électroniques et les incuber dans un bain à ultrasons pendant 5 minutes. </li><li> Utilisez des aimants pour recueillir les billes magnétiques et retirer le surnageant. </li><li> Ajouter 1 ml de 2% SDS-solution à chaque tube et remettre à l&#39;aide d&#39;un vortex. Faire bouillir pendant 5 minutes. </li><li> Collecter les perles et retirer le surnageant. Remettre en suspension les billes dans 1 ml d&#39;EDTA 0,2 M (pH = 7). </li><li> Incuber les tubes dans un bain à ultrasons pendant 5 minutes et une fois de plus, éliminer le surnageant. </li><li> Ajouter 1 ml d&#39;eau à chaque tube et remettre les billes. Collecter les perles et retirer le surnageant. Répétez cette étape de lavage à deux reprises. </li><li> Eliminer le surnageant et remettre en suspension les billes dans 1 ml 10 mM CoCl 2 solution. Mettre sur un agitateur pendant 10 minutes. </li><li> Eliminer le surnageant à l&#39;aide d&#39;un aimant pour recueillir les perles et remettre en suspension dans 1 ml de reliure / tampon de lavage. </li><li> Retirer le surnageant et laver les billes deux fois en utilisant 1 ml de 20% (v / v) d&#39;éthanol </li><li> Remettre en suspension les perles dans leur volume initial de 20% (v / v) etHanol à obtenir des billes régénérées en une concentration de 40 mg / ml. </li></ol> 6. Interprétation des résultats <ol><li> L&#39;échantillon de contrôle 1, dans lequel aucun virus radiomarqué a été ajouté, sera utilisé pour corriger la radioactivité de fond et de définir la valeur de radioactivité 0%. L&#39;échantillon de contrôle 2, qui ne contient pas de Nanobodies et où par conséquent tous les virus radiomarqué reste dans le surnageant, est défini comme la valeur la radioactivité de 100%. </li><li> Le pourcentage de la radioactivité dans le surnageant (= une%) est une mesure de la précipitation globale (= 100 - une%) du virus radiomarqué par le Nanobody. </li></ol> 7. Les résultats représentatifs Les résultats représentatifs pour ce test de capture par affinité sont présentés dans les figures 2, 3 et 4. Dans la figure 2, l&#39;affinité de PVSS38C, une spécifique pour le poliovirus Nanobodies, est montré. L&#39;affinité de PVSS38C a été testé pendant trois antigènes différents de poliovirus: Native-antigène (N-antigène), Chauffée-antigène (H-antigène) et sous-unités 14S. N-antigène est le virus intact qui est infectieux. Lorsque le virus est chauffé (20 minutes à 56 ° C) ou fixé à une surface solide (résultats non publiés), la conformation des changements de capside, résultant en une perte (partielle) de l&#39;ARN viral et la protéine de capside VP4, et vide capsides sont formées, qui sont alors appelés H-antigènes. Sous-unités 14S sont des intermédiaires d&#39;assemblage. Ces antigènes sont reconnus par différents ensembles d&#39;anticorps après la vaccination 10 et possèdent donc des épitopes différents et des sites antigéniques. Dans la figure le pourcentage de la radioactivité dans le surnageant est représentée comme une fonction de la concentration de Nanobody. Il peut être vu que la radioactivité dans le surnageant des échantillons contenant des sous-unités 14S radiomarqués diminue avec des concentrations croissantes de la PVSS38C Nanobodies. Cela peut se traduire par une augmentation de la quantité de poliovirus 14S con sous-unitésconnecté à la PVSS38C Nanobodies et indirectement à des billes magnétiques. Le titre de capture (= la concentration de Nanobodies nécessaire pour capturer 50% du virus radiomarqué) peuvent être représentés graphiquement calculé comme 0,099 nM. Pas d&#39;affinité de PVSS38C pour la N-antigénique et H-antigénique du poliovirus de forme est observée. A partir de ces données, il est interprété que PVSS38C est en interaction avec un épitope qui est exclusivement présent sur la sous-unité 14S et non pas sur les deux autres formes antigéniques de poliovirus. Pour démontrer que la perte de la radioactivité dans le surnageant est uniquement due à l&#39;affinité spécifique de la Nanobodies l&#39;égard de ses antigènes, le même dosage a été réalisé avec Nb1, un Nanobodies généré contre le régulateur transcriptionnel de lrpB sulfataricus Sulfolobus et connu pour avoir aucune interaction avec n&#39;importe quel antigène du poliovirus. Le résultat de ce test est représenté sur la figure 3. Tous les virus radiomarqué reste dans les surnageants montrant qu&#39;il n&#39;ya pas de réactivité desNb1 contre les trois formes antigéniques de poliovirus. La reproductibilité des résultats a été testée en répétant l&#39;expérience pour un total de huit fois pour une donnée Nanobodies (c.-à-PVSP29F) à des jours différents et par des personnes différentes. Les résultats sont présentés dans la figure 4. La valeur moyenne de la radioactivité dans le surnageant de pourcentage a été calculé pour chaque concentration Nanobodies et est représenté en correspondance avec son écart-type. <img alt="Figure 1." src="/files/ftp_upload/3937/3937fig1.jpg" /> Figure 1. Un aperçu du principe (A) et le procédé (B) du dosage. A. étiquette His nanocorps qui reconnaissent spécifiquement un antigène du poliovirus certaine sera en mesure d&#39;interagir avec les billes de cobalt-magnétiques revêtues et précipiter le virus de marqué radioactivement. Nanocorps B. Son-étiquette sont ajoutés à un poliovirus marqué radioactivement et incubé. Cobalt billes magnétiques revêtues sontajouté et la séparation magnétique de l&#39;antigène lié / non lié est effectué. La radioactivité du surnageant est mesurée et la quantité d&#39;antigène capturé peut être dérivée. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3937/3937fig2.jpg" /> Figure 2. Magnétique de capture par affinité perles d&#39;antigènes différents de poliovirus par Nanobodies PVSS38C. Le pourcentage de la radioactivité dans le surnageant est représentée comme une fonction de la concentration de PVSS38C. Pour 14S une relation dose-réponse peut être trouvée, montrant l&#39;interaction de PVSS38C avec un épitope exclusivement présent sur 14S. Aucune interaction significative avec la N-, ni H-antigène peut être détecté, même si un risque négligeable non spécifique de capture à des concentrations très élevées est remarqué. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3937/3937fig3.jpg" /> Figure 3. Magnétiques de capture par affinité billes d&#39;antigènes différents poliovirus par Nanobody Nb1 </strong&gt;. Le pourcentage de la radioactivité dans le surnageant est représentée comme une fonction de la concentration de Nb1. Nb1 est connu pour avoir aucune interaction avec tout poliovirus-antigène ou sous-unité. Puisque 100% de la radioactivité se trouve dans le surnageant, aucun virus n&#39;a été non spécifiquement liée à Nb1. La perte de la radioactivité dans la figure 2 est donc seulement en raison de l&#39;affinité spécifique de la Nanobodies l&#39;égard de ses antigènes. <img alt="Figure 4." src="/files/ftp_upload/3937/3937fig4.jpg" /> Figure 4. Reproductibilité du dosage. La valeur moyenne de la radioactivité pourcentage dans le surnageant est représentée comme une fonction de la concentration de Nanobody. L&#39;expérience a été répétée huit fois à des jours différents et par des personnes différentes. L&#39;écart-type est représenté par des barres verticales.

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	<li>Thys, B., Schotte, L., Muyldermans, S., Wernery, U., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+antiviral+activity+of+single+domain+antibody+fragments+against+poliovirus.">In vitro antiviral activity of single domain antibody fragments against poliovirus.</a> Antiviral Res. 87, 257-264 (2010).</li><li>Meloen, R. H., Briaire, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+the+cross-reacting+antigens+on+the+intact+foot-and-mouth+disease+virus+and+its+12S+subunits+with+antisera+against+the+structural+proteins.">A study of the cross-reacting antigens on the intact foot-and-mouth disease virus and its 12S subunits with antisera against the structural proteins.</a> J. Gen. Virol. 51, 107-116 (1980).</li><li>Vrijsen, R., Rombaut, B., Boeye, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+quantitative+protein+A+micro-immunoprecipitation+method:+assay+of+antibodies+to+the+N+and+H+antigens+of+poliovirus.">A simple quantitative protein A micro-immunoprecipitation method: assay of antibodies to the N and H antigens of poliovirus.</a> J. Immunol. Methods. 59, 217-220 (1983).</li><li>Rombaut, B., Jore, J., Boeye, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+competition+immunoprecipitation+assay+of+unlabeled+poliovirus+antigens.">A competition immunoprecipitation assay of unlabeled poliovirus antigens.</a> J. Virol. Methods. 48, 73-80 (1994).</li><li>Kessler, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+antigens+from+cells+with+a+staphylococcal+protein+A-antibody+adsorbent:+parameters+of+the+interaction+of+antibody-antigen+complexes+with+protein+A.">Rapid isolation of antigens from cells with a staphylococcal protein A-antibody adsorbent: parameters of the interaction of antibody-antigen complexes with protein A.</a> J. Immunol. 115, 1617-1624 (1975).</li><li>Hamers-Casterman, C., Atarhouch, T., Muyldermans, S., Robinson, G., Hamers, C., Songa, B. a. j. y. a. n. a., Bendahman, E., N, ., Hamers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+occurring+antibodies+devoid+of+light+chains.">Naturally occurring antibodies devoid of light chains.</a> Nature. 363, 446-448 (1993).</li><li>Arbabi Ghahroudi, M., Desmyter, A., Wyns, L., Hamers, R., Muyldermans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+and+identification+of+single+domain+antibody+fragments+from+camel+heavy-chain+antibodies.">Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies.</a> FEBS Lett. 414, 521-526 (1997).</li><li>Muyldermans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+domain+camel+antibodies:+current+status.">Single domain camel antibodies: current status.</a> Rev. Mol. Biotechnol. 74, 277-302 (2001).</li><li>Rombaut, B., Vrijsen, R., Boeye, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitope+evolution+in+poliovirus+maturation.">Epitope evolution in poliovirus maturation.</a> Arch. Virol. 76, 289-298 (1983).</li><li>Brioen, P., Sijens, R. J., Vrijsen, R., Rombaut, B., Thomas, A. A., Jackers, A., Boeye, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybridoma+antibodies+to+poliovirus+N+and+H+antigen.">Hybridoma antibodies to poliovirus N and H antigen.</a> Arch. Virol. 74, 325-330 (1982).</li><li>Thys, B., Saerens, D., Schotte, L., De Bleeser, G., Muyldermans, S., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+quantitative+affinity+capturing+assay+of+poliovirus+antigens+and+subviral+particles+by+single-domain+antibodies+using+magnetic+beads.">A simple quantitative affinity capturing assay of poliovirus antigens and subviral particles by single-domain antibodies using magnetic beads.</a> J. Virol. Methods. 173, 300-305 (2011).</li><li>Wild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Immunoassay Handbook. , (2005).</li><li>Kremser, L., Konecsni, T., Blaas, D., Kenndler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+labeling+of+human+rhinovirus+capsid+and+analysis+by+capillary+electrophoresis.">Fluorescence labeling of human rhinovirus capsid and analysis by capillary electrophoresis.</a> Anal. Chem. 76, 4175-4181 (2004).</li><li>Pelkmans, L., Kartenbeck, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caveolar+endocytosis+of+simian+virus+40+reveals+a+new+two-step+vesicular-transport+pathway+to+the+ER.">Caveolar endocytosis of simian virus 40 reveals a new two-step vesicular-transport pathway to the ER.</a> Nat. Cell Biol. 3, 473-483 (2001).</li></ol>

Nous n&#39;avons rien à communiquer.

Dans le protocole, la radioactivité de l&#39;antigène interagissant avec le Nanobodies est définie comme la perte du virus radiomarqué à partir du surnageant. Par conséquent, la quantité de radioactivité précipitée (= 100 - en%) (lié à des billes magnétiques) peut être estimée de façon indirecte par la radioactivité dans le surnageant (= a%). D&#39;autre part, il est également possible de mesurer la radioactivité de la fraction précipitée de l&#39;antigène lié de manière directe par l&#39;élutio...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Nom du réactif</strong</td&gt;<td<strong&gt; Société</strong</td&gt;<td<strongNuméro de catalogue&gt;</strong</td&gt;<td<strong&gt; Commentaires</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Dynabeads His-Tag Isolement et Pulldown</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 101.03D</td&gt;<td&gt; Les billes magnétiques</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; &#39;HiSafe&#39; Optiphase 2</td&gt;<td&gt; Perkin Elmer</td&gt;<td&gt; 1200 - 436</td&gt;<tdFluide de scintillation&gt;</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

a liquid phase affinity capture assay using magnetic beads to study protein-protein interaction: the poliovirus-nanobody example

Dans cet article, un simple, quantitative, de dosage liquide phase de capture par affinité est présenté. Pourvu que d&#39;une protéine peut être marqué et une autre protéine marquée, cette méthode peut être mis en œuvre pour l&#39;enquête sur les interactions entre protéines. Il est basé sur une main sur la reconnaissance de la protéine marquée par des billes magnétiques revêtues de cobalt et d&#39;autre part sur l&#39;interaction entre la protéine marqué et une seconde protéine spécifique qui est marquée. Tout d&#39;abord, les protéines marquées et étiquetées sont mélangés et incubés à température ambiante. Les billes magnétiques, qui reconnaissent la balise, sont ajoutées et la fraction liée de la protéine marquée est séparée de la fraction non liée en utilisant des aimants. La quantité de protéine marqué qui est capturée peut être déterminée de manière indirecte par mesure du signal de la protéine marquée est resté dans la fraction non liée. Le dosage de liquide décrit la phase d&#39;affinité est extrêmement utile lorsque les protéines de conversion de conformation sont sensibles culAyed. Le développement et l&#39;application de l&#39;essai est démontrée pour l&#39;interaction entre les poliovirus et du poliovirus en reconnaissant nanocorps 1. Depuis poliovirus est sensible à la conversion conformationnelle 2 lorsqu&#39;il est attaché à une surface solide (résultats non publiés), l&#39;utilisation de la méthode ELISA est limitée et d&#39;un système en phase liquide à base doit donc être préféré. Un exemple d&#39;un système en phase liquide à base souvent utilisé dans les polioresearch 3,4 est la protéine micro-immunoprécipitation Un test de 5. Même si ce test a prouvé son applicabilité, il faut un Fc-structure, qui est absente dans les nanocorps 6,7. Toutefois, comme une autre occasion, ces intéressants et stables anticorps à domaine unique 8 peut être facilement conçu avec des étiquettes différentes. Le couramment utilisé (His) 6-étiquette indique l&#39;affinité pour les ions bivalents tels que le nickel ou le cobalt, qui à leur tour peuvent être facilement appliqué sur des billes magnétiques. Nous avons donc développé cette quantitative simpledosage de capture par affinité sur la base de cobalt revêtues billes magnétiques. Poliovirus a été marqué au 35 S pour permettre une interaction sans entrave avec les nanocorps et de faire une détection quantitative possible. La méthode est facile à réaliser et ne peut être établie avec un faible coût, qui est encore étayée par la possibilité de régénérer efficacement les billes magnétiques.

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A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

Dans cet article, un simple, quantitative, de dosage liquide phase de capture par affinité est présenté. C&#39;est une technique fiable, basé sur l&#39;interaction entre les billes magnétiques et les protéines marquées (par exemple nanocorps) d&#39;une part et l&#39;affinité entre la protéine marqué et une seconde, protéine marquée (poliovirus, par exemple) sur l&#39;autre.

Un essai en phase liquide d&#39;affinité de capture utilisant des billes magnétiques pour étudier interaction protéine-protéine: Le poliovirus Exemple-Nanobodies

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

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11.8K vues.  Vrije Universiteit Brussel. Dans cet article, un simple, quantitative, de dosage liquide phase de capture par affinité est présenté. C'est une technique fiable, basé sur l'interaction entre les billes magnétiques et les protéines marquées (par exemple nanocorps) d'une part et l'affinité entre la protéine marqué et une seconde, protéine marquée (poliovirus, par exemple) sur l'autre.

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Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Utiliser le système de fractionnement GELFREE 8100 pour les Poids Moléculaire à base de fractionnement avec récupération de la phase liquide

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Recherche

Biologie

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

Bimoléculaire complémentation de fluorescence (BiFC) Dosage pour les interactions protéine-protéine dans les cellules d&#39;oignon Utilisation du pistolet à gènes Helios

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification procedures. As an alternative, lipids can be coated on flat surfaces as used for lipid ELISA and Plasmon resonance spectroscopy. However, surface coating lipids do not form microdomain structures, which may be important for the lipid binding properties. Further, these methods do not allow for the purification of larger amounts of proteins binding to their target lipids.
 To overcome these limitations of testing lipid protein interaction and to purify lipid binding proteins we developed a novel method termed lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic-activated cell sorting (LIMACS). In this method, lipid vesicles are prepared with the target lipid and phosphatidylserine as the anchor lipid for Annexin V MACS. Phosphatidylserine is a ubiquitous cell membrane phospholipid that shows high affinity to the protein Annexin V. Using magnetic beads conjugated to Annexin V the phosphatidylserine-containing lipid vesicles will bind to the magnetic beads. When the lipid vesicles are incubated with a cell lysate the protein binding to the target lipid will also be bound to the beads and can be co-purified using MACS. This method can also be used to test if recombinant proteins reconstitute a protein complex binding to the target lipid. 
 We have used this method to show the interaction of atypical PKC (aPKC) with the sphingolipid ceramide and to co-purify prostate apoptosis response 4 (PAR-4), a protein binding to ceramide-associated aPKC. We have also used this method for the reconstitution of a ceramide-associated complex of recombinant aPKC with the cell polarity-related proteins Par6 and Cdc42. Since lipid vesicles can be prepared with a variety of sphingo- or phospholipids, LIMACS offers a versatile test for lipid-protein interaction in a lipid environment that resembles closely that of the cell membrane. Additional lipid protein complexes can be identified using proteomics analysis of lipid binding protein co-purified with the lipid vesicles.

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

To test the interaction of a protein with its target lipid we used MACS and Annexin V-conjugated magnetic beads and lipid vesicles synthesized from the target lipid and Annexin V-binding phosphatidylserine. Proteins bound to the target lipid are co-purified and analyzed after elution from the beads.

Chromatographie d&#39;affinité lipidique des vésicules médiée utilisant magnétique tri cellulaire activé (LIMACS): une nouvelle méthode pour analyser les interactions protéines-lipides

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life science research and clinical diagnostics. However, ELISA has limitations. It is typically performed in a 96-well microplate, and the wells are coated with capture antibody, requiring a relatively large amount of sample to capture an antigen of interest . The large surface area of the wells and the hydrophobic binding of capture antibody can also lead to non-specific binding and increased background. Additionally, most ELISAs rely upon enzyme-mediated amplification of signal in order to achieve reasonable sensitivity. Such amplification is not always linear and can thus skew results.
In the past 15 years, a new technology has emerged that offers the benefits of the ELISA, but also enables higher throughput, increased flexibility, reduced sample volume, and lower cost, with a similar workflow 1, 2. Luminex xMAP Technology is a microsphere (bead) array platform enabling both monoplex and multiplex assays that can be applied to both protein and nucleic acid applications 3-5. The beads have the capture antibody covalently immobilized on a smaller surface area, requiring less capture antibody and smaller sample volumes, compared to ELISA, and non-specific binding is significantly reduced. Smaller sample volumes are important when working with limiting samples such as cerebrospinal fluid, synovial fluid, etc. 6. Multiplexing the assay further reduces sample volume requirements, enabling multiple results from a single sample.
Recent improvements by Luminex include: the new MAGPIX system, a smaller, less expensive, easier-to-use analyzer; Low-Concentration Magnetic MagPlex Microspheres which eliminate the need for expensive filter plates and come in a working concentration better suited for assay development and low-throughput applications; and the xMAP Antibody Coupling (AbC) Kit, which includes a protocol, reagents, and consumables necessary for coupling beads to the capture antibody of interest. (See Materials section for a detailed list of kit contents.)
In this experiment, we convert a pre-optimized ELISA assay for TNF-alpha cytokine to the xMAP platform and compare the performance of the two methods 7-11. TNF-alpha is a biomarker used in the measurement of inflammatory responses in patients with autoimmune disorders.
We begin by coupling four candidate capture antibodies to four different microsphere sets or regions. When mixed together, these four sets allow for the simultaneous testing of all four candidates with four separate detection antibodies to determine the best antibody pair, saving reagents, sample and time. Two xMAP assays are then constructed with the two most optimal antibody pairs and their performance is compared to that of the original ELISA assay in regards to signal strength, dynamic range, and sensitivity.

An ELISA can be easily converted to a Luminex xMAP assay and, through the benefits of multiplexing, several antibodies can be screened simultaneously to identify an optimum antibody pair, resulting in increased sensitivity and dynamic range, while reducing assay cost.

Conversion d&#39;un test ELISA de capture à un test Luminex xMAP utilisant une méthode de dépistage d&#39;anticorps Multiplex

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC is based on the production of fluorescence using two non-fluorescent fragments of a fluorescent protein (Venus, a Yellow Fluorescent Protein variant, is used here). Non-fluorescent Venus fragments (VN and VC) are fused to two interacting proteins (in this case, AKAP-Lbc and PDE4D3), yielding fluorescence due to VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 interaction and the formation of a functional fluorescent protein inside cells.
BiFC provides information on the subcellular localization of protein complexes and the strength of protein interactions based on fluorescence intensity. However, BiFC analysis using microscopy to quantify the strength of protein-protein interaction is time-consuming and somewhat subjective due to heterogeneity in protein expression and interaction. By coupling flow cytometric analysis with BiFC methodology, the fluorescent BiFC protein-protein interaction signal can be accurately measured for a large quantity of cells in a short time. Here, we demonstrate an application of this methodology to map regions in PDE4D3 that are required for the interaction with AKAP-Lbc. This high throughput methodology can be applied to screening factors that regulate protein-protein interaction.

Flow cytometric analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation provides a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction. This methodology can be applied to mapping protein binding sites and for screening factors that regulate protein-protein interaction.

L&#39;analyse par cytométrie de flux par fluorescence bimoléculaire complémentation: une méthode quantitative à haut débit pour étudier l&#39;interaction protéine-protéine

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. However, the use of biochemical screens aimed at extending the knowledge gained from genetic analysis was explored only recently. Here we describe a method to purify the protein complex that associates with any protein of interest from adult fly heads. This method takes advantage of the Drosophila GAL4/UAS system to express a bait protein fused with a Tandem Affinity Purification (TAP) tag in fly neurons in vivo, and then implements two rounds of purification using a TAP procedure similar to the one originally established in yeast1 to purify the interacting protein complex. At the end of this procedure, a mixture of multiple protein complexes is obtained whose molecular identities can be determined by mass spectrometry. Validation of the candidate proteins will benefit from the resource and ease of performing loss-of-function studies in flies. Similar approaches can be applied to other fly tissues. We believe that the combination of genetic manipulations and this proteomic approach in the fly model system holds tremendous potential for tackling fundamental problems in the field of neurobiology and beyond.

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Drosophila is famous for its powerful genetic manipulation, but not for its suitability of in-depth biochemical analysis. Here we present a TAP-based procedure to identify interacting partners of any protein of interest from the fly brain. This procedure can potentially lead to new avenues of research.

Identifier les interactions protéine-protéine dans<em&gt; Drosophila</em&gt; Têtes de Tandem Affinity Purification adultes (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may result in disease, making protein interactions important drug targets. It is thus highly important to understand these interactions at the molecular level. Protein interactions are studied using a variety of techniques ranging from cellular and biochemical assays to quantitative biophysical assays, and these may be performed either with full-length proteins, with protein domains or with peptides. Peptides serve as excellent tools to study protein interactions since peptides can be easily synthesized and allow the focusing on specific interaction sites. Peptide arrays enable the identification of the interaction sites between two proteins as well as screening for peptides that bind the target protein for therapeutic purposes. They also allow high throughput SAR studies. For identification of binding sites, a typical peptide array usually contains partly overlapping 10-20 residues peptides derived from the full sequences of one or more partner proteins of the desired target protein. Screening the array for binding the target protein reveals the binding peptides, corresponding to the binding sites in the partner proteins, in an easy and fast method using only small amount of protein.
In this article we describe a protocol for screening peptide arrays for mapping the interaction sites between a target protein and its partners. The peptide array is designed based on the sequences of the partner proteins taking into account their secondary structures. The arrays used in this protocol were Celluspots arrays prepared by INTAVIS Bioanalytical Instruments. The array is blocked to prevent unspecific binding and then incubated with the studied protein. Detection using an antibody reveals the binding peptides corresponding to the specific interaction sites between the proteins.

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

Identifier les sites d&#39;interaction protéine-protéine à l&#39;aide de peptides tableaux

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example

RNA/protein interactions are critical for post-transcriptional regulatory pathways. Among the best-characterized cytosolic RNA-binding proteins are iron regulatory proteins, IRP1 and IRP2. They bind to iron responsive elements (IREs) within the untranslated regions (UTRs) of several target mRNAs, thereby controlling the mRNAs translation or stability. IRE/IRP interactions have been widely studied by EMSA. Here, we describe the EMSA protocol for analyzing the IRE-binding activity of IRP1 and IRP2, which can be generalized to assess the activity of other RNA-binding proteins as well. A crude protein lysate containing an RNA-binding protein, or a purified preparation of this protein, is incubated with an excess of32 P-labeled RNA probe, allowing for complex formation. Heparin is added to preclude non-specific protein to probe binding. Subsequently, the mixture is analyzed by non-denaturing electrophoresis on a polyacrylamide gel. The free probe migrates fast, while the RNA/protein complex exhibits retarded mobility; hence, the procedure is also called &#8220;gel retardation&#8221; or &#8220;bandshift&#8221; assay. After completion of the electrophoresis, the gel is dried and RNA/protein complexes, as well as free probe, are detected by autoradiography. The overall goal of the protocol is to detect and quantify IRE/IRP and other RNA/protein interactions. Moreover, EMSA can also be used to determine specificity, binding affinity, and stoichiometry of the RNA/protein interaction under investigation.

Electrophoretic Mobility Shift Assay EMSA for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example

Here we present a protocol to analyze RNA/protein interactions. The electrophoretic mobility shift assay (EMSA) is based on the differential migration of RNA/protein complexes and free RNA during native gel electrophoresis. By using a radiolabeled RNA probe, RNA/protein complexes can be visualized by autoradiography.

Maj de mobilité électrophorétique Assay (EMSA) pour l&#39;étude des interactions ARN-protéine: L&#39;IRE / IRP Exemple

RNA/protein interactions are critical for post-transcriptional regulatory pathways. Among the best-characterized cytosolic RNA-binding proteins are iron ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often depend on its interactions with other proteins. Here, we describe a protocol for the yeast protein-fragment complementation assay (PCA), a powerful method to detect direct and proximal associations between proteins in living cells. The interaction between two proteins, each fused to a dihydrofolate reductase (DHFR) protein fragment, translates into growth of yeast strains in presence of the drug methotrexate (MTX). Differential fitness, resulting from different amounts of reconstituted DHFR enzyme, can be quantified on high-density colony arrays, allowing to differentiate interacting from non-interacting bait-prey pairs. The high-throughput protocol presented here is performed using a robotic platform that parallelizes mating of bait and prey strains carrying complementary DHFR-fragment fusion proteins and the survival assay on MTX. This protocol allows to systematically test for thousands of protein-protein interactions (PPIs) involving bait proteins of interest and offers several advantages over other PPI detection assays, including the study of proteins expressed from their endogenous promoters without the need for modifying protein localization and for the assembly of complex reporter constructs.

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Proteins interact with each other and these interactions determine in a large part their functions. Protein interaction partners can be identified at high-throughput in vivo using a yeast fitness assay based on the dihydrofolate reductase protein-fragment complementation assay (DHFR-PCA).

L&#39;échelle du génome interaction protéine-protéine Le dépistage par Protein-fragment complémentation Assay (PCA) dans les cellules vivantes

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell proliferation, migration, and alignment to form tubular structures followed by recruitment of pericytes to provide mural support and facilitate vessel maturation. Current in vitro cell culture approaches cannot fully reproduce the complex biological environment where endothelial cells and pericytes interact to produce functional vessels. We present a novel application of the in vivo matrix gel plug assay to study endothelial-pericyte interactions and formation of functional blood vessels using severe combined immune deficiency mutation (SCID) mice. Briefly, matrix gel is mixed with a solution containing endothelial cells with or without pericytes followed by injection into the back of anesthetized SCID mice. After 14 days, the matrix gel plugs are removed, fixed and sectioned for histological analysis. The length, number, size and extent of pericyte coverage of mature vessels (defined by the presence of red blood cells in the lumen) can be quantified and compared between experimental groups using commercial statistical platforms. Beyond its use as an angiogenesis assay, this matrix gel plug assay can be used to conduct genetic studies and as a platform for drug discovery. In conclusion, this protocol will allow researchers to complement available in vitro assays for the study of endothelial-pericyte interactions and their relevance to either systemic or pulmonary angiogenesis.

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

We present a protocol to study human endothelial-pericyte interactions in mouse using a variation of the matrix gel plug angiogenesis assay.