Les auteurs tiennent à remercier le US Army Medical Research et du matériel de commande (Grant # W81XWH-10-1-0806) et le National Institutes of Health (Grant # U19-01 AI091031 et Grant # 1R01GM090280) pour un soutien financier. BN reconnaît la chaire Balloun en génie chimique et biologique et NLBP reconnaît la chaire de génie Wilkinson interdisciplinaire. Nous remercions Julia Vela pour son aide dans l&#39;exécution des expériences de fonctionnalisation des nanoparticules.

1. Synthèse des glucides à haut débit <ol><li> Avant la synthèse automatisée de dimannoside, un donneur de sucre convenablement protégé, généralement trichloroacétimidate, et l&#39;accepteur, essentiellement d&#39;un alcool fluoré alcényle, sont synthétisés sur le banc-dessus. </li><li> Un programme est écrit pour la synthèse automatisée de dimannoside. Une représentation schématique de la procédure de base automatisé est présenté dans la Figure 2. Dans le programme, il est assuré que, avant l&#39;addition du promoteur, le mélange de donneur et l&#39;accepteur est agité pendant au moins 30 min. </li><li> Solutions du donneur, accepteur synthétique et trimethylsilyltrifluoromethanesulfonate sont faites dans le dichlorométhane. Le toluène et le dichlorométhane sont le plus fréquemment utilisé pour les réactions de glycosylation. </li><li> En outre, préparer des solutions de réactifs pour la déprotection des groupements protecteurs temporaires dans le méthanol et le méthanol de 80% à 100%. </li><li> Avant le début du programme, veiller à ce que le RELAl&#39;humidité ive dans la salle est de 30% ou moins dans la chambre de l&#39;automatisation. Taux d&#39;humidité élevé est préjudiciable pour les réactions de glycosylation. </li><li> Une fois que le programme est lancé, le bras robotisé transfère les solutions de donneur et accepteur dans le flacon de réaction séquentielle. Ensuite, le mélange est agité pendant 30 min. </li><li> Ensuite, le bras robotisé transfère de 0,2 à 0,3 équivalents de trimethylsilyltrifluoromethanesulfonate dans le mélange, généralement à la température ambiante, bien que des températures plus basses, comme -20 ° C peut être atteint. Le mélange réactionnel est agité pendant 30 min. </li><li> Après 30 min, la réaction est arrêtée et une petite partie aliquote retiré de surveiller l&#39;avancement de la réaction. Si ce n&#39;est pas complet, la réaction peut être poursuivi et, finalement, le temps nécessaire peut être modifié. </li><li> Une fois la réaction terminée, le mélange réactionnel est transféré dans les fluorés extraction en phase solide (FSPE) cartouches contenant C 8 F 17-gel de silice modifiée pour la purification. </li><li> Le paniercrêtes sont d&#39;abord lavées avec une participation de 80% mélange méthanol-eau (8 ml) de se débarrasser de la fraction non fluorée. </li><li> Puis les cartouches sont lavées avec du méthanol à 100% pour obtenir le produit désiré fluorée-marqué. Si une purification supplémentaire est souhaitée, la machine peut être arrêtée et le produit de la réaction (s) enlevé pour purification par des moyens supplémentaires. </li><li> Après le cycle de purification, le bras robotisé distribue le méthylate de sodium dans le flacon de réaction. La réaction est agitée pendant 2 heures. Si ce n&#39;est pas complet, la réaction peut être à nouveau poursuivi pour une plus longue période et, finalement, le temps programmé nécessaire peut être modifié. </li><li> Après l&#39;achèvement de la réaction, le produit est purifié par FSPE et ensuite soumis à une dissolution dans du toluène anhydre suivie d&#39;une évaporation pour éliminer l&#39;eau résiduelle. </li><li> Puis le cycle (à partir de l&#39;étape 6 à 13) est répétée jusqu&#39;à ce que la longueur de chaîne désirée est obtenue pour la molécule cible. </li><li> Le produit protégé obtenu à partir de l&#39;automatisation est een outre purifié et entièrement caractérisé par des techniques telles que de résonance nucléaire (RMN) magnétique. Déprotection complète (suppression de tous les groupes protecteurs restants) de la molécule cible finale est ensuite complété en dehors de la plate-forme d&#39;automatisation comme une règle, car elle implique souvent des gaz d&#39;hydrogène explosif et le palladium. L&#39;étape de déprotection finale a été réalisée sur la paillasse en dehors de la plate-forme d&#39;automatisation. La première étape est ozonolyse de la double liaison dans la balise fluorée suivie d&#39;une oxydation de l&#39;aldéhyde produit en un acide carboxylique. Le produit a été purifié par Chromatographie sur colonne. La dernière étape était la déprotection des groupes éther benzylique par hydrogénation catalysée par le palladium. Le produit a été passé sur célite pad pour se débarrasser de palladium pour obtenir pur produit final. </li></ol> 2. À haut débit Fonctionnalisation de surface des nanoparticules <ol><li> La synthèse de polymères à haut débit et la fabrication de nanoparticules est réalisée en suivant le même protocole et robotique mis en place décrit par Petersen et al 19. Les systèmes de copolymères utilisés pour la fabrication de particules sont à base d&#39;acide sébacique (SA) et le 1,6-bis (para-carboxyphénoxy) hexane (CPH), et le 1,8-bis ( para-carboxyphénoxy) -3,6-dioxaoctane (CPTEG) et CPH. Une représentation schématique de l&#39;appareil de dépôt robotisé utilisé est présenté dans la figure 1b. </li><li> Après la fabrication des nanoparticules, le titulaire contenant les tubes avec la bibliothèque des nanoparticules est rattachée à l&#39;étape actionneur linéaire. </li><li> Pour la fixation d&#39;hydrates de carbone à la surface des particules polyanhydride, une réaction amine-acide carboxylique couplage consistant en 20 deux réactions consécutives est effectuée. </li><li> Pour la première réaction, la seringue dans la pompe à seringue programmable premier est rempli avec 10 équivalents (éq.) (équivalents de moyenne de concentration d&#39;acide carboxylique molaire sur la surface des particules) de 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)-bischlorhydrate rbodiimide (EDC) et 10 éq. d&#39;éthylènediamine dans une solution aqueuse, lorsque la seringue dans la pompe à seringue programmable seconde est chargé avec 12 éq. de N-hydroxysuccinimide (NHS) en solution aqueuse. </li><li> En utilisant le programme LabVIEW, les suspensions de réactifs sont déposés dans le * bibliothèque des nanoparticules. </li><li> Suivante, chaque échantillon est traité par ultrasons (30 s à 40 Hz) et le tube de support est détaché de la plate-forme robotique. </li><li> Suspensions de nanoparticules sont incubées pendant ** h 9 avec une rotation constante à 4 ° C. </li><li> Après un temps de réaction est terminée, les tubes sont centrifugés (12000 xg pendant 5 min) et a renvoyé à la station de robotique pour effectuer deux étapes de lavage. </li><li> Pour le lavage, une seringue reste vide et chargé dans le pousse-seringue programmable première pendant la seringue dans la deuxième pompe à seringue est remplie d&#39;eau froide. Le surnageant dans chaque tube est retiré dans la seringue vide et les dépôts de pompe deuxièmes eau froide. </li><li> Homogénéisation des nanosuspension de particules est réalisée comme décrit à l&#39;étape 2.6. Les tubes sont ensuite centrifugés (12000 xg pendant 5 min) et une étape second lavage est effectué comme décrit à l&#39;étape 2.9. </li><li> Pour la seconde réaction, deux étapes de dépôt sont utilisés. Dans le première étape de dépôt, 12 éq. des EDC sont chargés avec une pompe et 12 éq. NHS sont chargés avec de la seconde pompe. </li><li> La seconde étape de dépôt comprend 10 éq. d&#39;un saccharide spécifique sur les première et seconde pompes (c.-à-galactose, le lactose ou di-mannose) *** et une troisième pompe à 10 éq. l&#39;acide glycolique de (utilisé comme contrôle ****). </li><li> Suspensions de nanoparticules est homogénéisé comme décrit à l&#39;étape 2.6 et incubés pendant 9 heures avec de rotation constante à 4 ° C. </li><li> Après le temps de réaction est terminée, une étape de lavage est effectué comme décrit dans les étapes 2.8, 2.9 et 2.10. </li><li> La bibliothèque nanoparticule fonctionnalisée est ensuite placé dans une chambre à vide à sécher pendant au moins 2 h. </li><li> Les nanoparticules fonctionnalisées sont alors caractèreIzed par spectroscopie des rayons X des photoélectrons et un criblage à haut débit débit phénol-acide sulfurique afin de déterminer la composition de la surface et la concentration du saccharide respectivement. Microscopie électronique à balayage et de diffusion dynamique de la lumière sont utilisés pour déterminer la taille des particules, distribution en taille, et la charge de surface. </li></ol> Notes: * Dépôt volumes varient avec la masse de nanoparticules contenues dans chaque tube. Temps de réaction ** pour les réactions des premier et second peut être changé pour ajuster la concentration finale de saccharide. Chaque *** saccharide est déposé dans des tubes à essai en fonction du groupe désiré. **** Pour la réaction spécifique utilisé dans cette étude pour la fixation des hydrates de carbone, l&#39;acide glycolique est utilisé comme un contrôle de liaison depuis saccharides déprotégés déjà cette molécule liée de manière covalente, ce qui permet pour la fixation à la suite de surface des nanoparticules. 3. Les résultats représentatifs Le utiledimannoside ment protégée montre la figure 2 a été synthétisé en utilisant la plate-forme d&#39;automatisation. Le composé synthétisé a été caractérisé par RMN 1 H dans un spectromètre de 400 MHz VXR utilisant CDCl 3 comme solvant. Le spectre RMN est représenté sur la figure 3. Utilisant la fabrication de nanoparticules à haut débit et la fonctionnalisation des nanoparticules polyanhydride décrit ci-après, l&#39;attachement de dimannose, lactose et de galactose a été effectué avec succès 10, 11. En utilisant cette configuration, les conditions réactionnelles optimales (c.-à-la température de réaction et le temps) ont été identifiées pour atteindre la fonctionnalisation de nanoparticules et de la morphologie désirée. Lorsque la réaction a été réalisée à 4 ° C au lieu de la température ambiante, une diminution de l&#39;agrégation des nanoparticules a été observée par MEB (données non présentées). Le tableau 1 montre des résultats représentatifs de la caractérisation des CPTEG 50:50 fonctionnalisé: des nanoparticules avec CPH soit di-mannose oule lactose, synthétisé à 4 ° C. Les données indiquent une légère augmentation du diamètre des nanoparticules moyenne en raison de la fonctionnalisation. Tandis que les nanoparticules non fonctionnalisés ont un potentiel zêta négatif d&#39;env. -20 MV, les particules fonctionnalisées a montré une valeur zêta potentiel positif, démontrant la fonctionnalisation de succès de la surface des nanoparticules. Lactose et di-mannose sont à la fois les sucres neutres; cependant, des groupes aminés libres de l&#39;éthylène-diamine-lieur utilisé pour fixer les saccharides peuvent être responsables du potentiel zêta positif. Le temps de réaction est une autre variable qui pourrait affecter à la fois la morphologie finale des nanoparticules et le degré d&#39;attachement à sucre atteint. En ajustant le temps de réaction, la concentration en sucre final rattaché à la surface des nanoparticules peut être contrôlée comme le montre la figure 4A. Comme prévu, la concentration de dimannose sur la surface de 50:50 CPTEG: CPH nanoparticules augmente avecle temps total de réaction et atteint un maximum après 18 heures. Nanoparticules fonctionnalisées avec le temps total de réaction de 24 heures ont été utilisées pour évaluer leur capacité à cibler PLC sur la souris de la moelle osseuse provenant cellules dendritiques (CD). La cytométrie en flux a été utilisée pour évaluer l&#39;expression de deux récepteurs (c.-à-CL, le CIRE (CD209, DC-SIGN) et le récepteur du mannose (CD206)) après stimulation par la non-fonctionnalisé, et le lactose et le di-mannose nanoparticules fonctionnalisées (figure 4B). Un supérieur expression des deux récepteurs, qui est une indication de ciblage efficace, a été obtenue lorsque les cellules sont stimulées avec la fois du lactose et di-mannose nanoparticules fonctionnalisés. Cependant, di-mannose-fonctionnalisés particules ont un niveau plus élevé d&#39;expression indiquant une spécificité de ce ligand pour les récepteurs qui ont été étudiés. <table border="1"><tbody><tr><td> Type de nanoparticules </td><td> Diamètre de particule moyen (nm) </td><td> Aveparticules rage ζ-potentiel (mV) </td></tr><tr><td> Non-fonctionnalisé </td><td> 162 ± 43 </td><td> -20 ± 0,6 </td></tr><tr><td> Lactose </td><td> 235 ± 34 </td><td> 26 ± 2,4 </td></tr><tr><td> Di-mannose </td><td> 243 ± 32 </td><td> 30 ± 4,2 </td></tr></tbody></table> Tableau 1. La caractérisation des nanoparticules. Non-fonctionnalisé et fonctionnalisé ont été caractérisées par diffusion de lumière quasi-élastique et mesures du potentiel zêta. Données sur la taille des particules représentent la valeur moyenne ± déviation standard (SD) de données dynamiques de diffusion de lumière collectées dans trois expériences indépendantes. Données Zeta potentiels représentent la valeur moyenne ± écart-type de trois lectures indépendantes. Changement dans le signe du potentiel zêta démontre que le sucre était efficace conjugué à la CPTEG 50:50: surface des nanoparticules CPH. <img alt="Figure 1" src<html> = &quot;/ Files/ftp_upload/3967/3967fig1.jpg&quot; /&gt; Figure 1. (A) Représentation graphique de l&#39;approche poursuivie avec la fonctionnalisation de nanoparticules glucides polyanhydride et un exemple des bibliothèques de nanoparticules fonctionnalisées qui pourraient être conçus avec le décrit à haut débit approche. (B) la représentation schématique de l&#39;appareil de dépôt automatisé utilisé pour la fonctionnalisation de particules, qui consiste à i) trois pompes NE 1000, (ii) une étape robotique intégré par deux actionneurs (Zaber), un pour le mouvement dans la direction x et l&#39;autre pour un mouvement dans la direction y, (iii) une deuxième étape de robot avec deux crémaillères voisines (correspondant pour tubes et les cuvettes) constitué de trois actionneurs, un pour chaque direction (x, y et z). Les pompes et un total de cinq actionneurs sont connectés en série. Actionneurs et les pompes sont actionnées par un ordinateur utilisant le logiciel LabVIEW. Ce schéma n&#39;est pas à l&#39;échelle.arge.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Cliquez ici pour agrandir la figure. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3967/3967fig2.jpg" /> Figure 2. Représentation graphique de la automatisé itérative de synthèse des hydrates de carbone en utilisant le mannose comme un exemple. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3967/3967fig3.jpg" /> Figure 3. RMN 1 H de la dimannoside protégés. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3967/3967fig4.jpg" /> Figure 4. (A) Effet du temps de réaction sur la concentration de surface des nanoparticules de saccharide. Dans les données présentées, 50:50 CPTEG: nanoparticules CPH ont été fonctionnalisés avec dimannose à différents temps de réaction et la réaction a été réalisée à 4 ° C. L&#39;erreur moyenne et le niveau de deux expériences indépendantes de fonctionnalisation est montré. (B) des nanoparticules de lactose et de di-mannose fonctionnalisésrécepteur cible efficacement DC-SIGN (CIRE, CD209) et le mannose (CD206) sur la moelle osseuse des cellules dendritiques dérivées comme l&#39;a démontré par l&#39;expression accrue de ces deux marqueurs après stimulation par CPTEG 50:50 fonctionnalisé: nanoparticules CPH en comparaison avec l&#39;expression obtenue avec des particules non fonctionnalisés.

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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+solution-phase+oligosaccharide+synthesis+and+carbohydrate+microarrays:+development+of+fluorous-based+tools+for+glycomics.">Automated solution-phase oligosaccharide synthesis and carbohydrate microarrays: development of fluorous-based tools for glycomics.</a> Chemical Glycobiology. , 272-287 (2008).</li></ol>

NLBP est co-fondateur et titulaire d&#39;équité dans la société glucides LuCella Biosciences, Inc

L&#39;efficacité des hydrates de carbone comme agents de ciblage à des interactions nanoparticules directs aux cellules immunitaires a été démontré précédemment 10, 11. Des recherches antérieures dans nos laboratoires ont montré que les sucres spécifiques attachés aux nanoparticules polyanhydrides sont en mesure de cibler PLC différents sur les cellules présentatrices d&#39;antigènes (APC), améliorant ainsi l&#39;activation des cellules immunitaires qui peut être important pour l&#39;activati...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom </td><td> Entreprise </td><td> Le numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Motorisée XYZ scène: 3x T-LSM050A, 50 mm de débattement par axe </td><td> Technologies Zaber </td><td> T-XYZ-LSM050A-KT04 </td></tr><tr><td> NE-1000 Pompe seringue à usage unique </td><td> Nouveaux systèmes de pompage Era </td><td> NE-1000 </td></tr><tr><td> Pyrex * Vista * Monture réutilisables Tubes de culture en verre </td><td> Corning </td><td> 07-250-125 </td></tr><tr><td> ASW 1000 </td><td> Technologies Chemspeed </td><td></td></tr><tr><td> LabVIEW </td><td> National Instruments </td><td> 776671-35 </td></tr><tr><td> Seringues SGE étanches aux gaz, de Luer Loc </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 509507 </td></tr><tr><td> XL-2000 Sonicator </td><td> Qsonica </td><td> Q55 </td></tr><tr><td> Mini-tube à rotateurs </td><td> Fisher Scientific </td><td> 05-450-127 </td></tr></tbody></table>

high-throughput synthesis of carbohydrates and functionalization of polyanhydride nanoparticles

Approches transdisciplinaires impliquant des domaines tels que la conception de matériel, les nanotechnologies, la chimie, et de l&#39;immunologie doivent être utilisés pour concevoir rationnellement efficaces transporteurs de vaccins. À base de nanoparticules plates-formes peuvent prolonger la durée de la persistance d&#39;antigènes vaccinaux, ce qui pourrait améliorer l&#39;immunogénicité vaccin 1. Plusieurs polymères biodégradables ont été étudiés en tant que véhicules de livraison des vaccins 1, en ​​particulier, les particules polyanhydride ont démontré la capacité de fournir à libération prolongée d&#39;antigènes protéiques stables et à activer les cellules présentatrices d&#39;antigènes et de moduler les réponses immunitaires 2-12. La conception moléculaire de ces porte-vaccins se doit d&#39;intégrer la sélection rationnelle des propriétés des polymères, ainsi que l&#39;incorporation de appropriées des agents de ciblage. De fabrication à haut débit automatisé des ligands de ciblage et de particules fonctionnalisées est un outil puissant qui permettra d&#39;améliorer la capacité d&#39;étudier un large rAnge de propriétés et mènera à la conception de dispositifs reproductibles de livraison des vaccins. L&#39;ajout de ligands de ciblage susceptibles d&#39;être reconnus par des récepteurs spécifiques sur les cellules immunitaires a été démontré pour moduler et adapter les réponses immunitaires 10,11,13 récepteurs lectine de type C (PLC) sont des récepteurs de reconnaissance des formes du porc (SDRP) qui reconnaissent les hydrates de carbone présents sur le surface de pathogènes. La stimulation des cellules immunitaires via PLC permet l&#39;internalisation accrue de l&#39;antigène et la présentation subséquente pour l&#39;activation des lymphocytes T en outre 14,15. Par conséquent, les molécules d&#39;hydrates de carbone jouent un rôle important dans l&#39;étude des réponses immunitaires; cependant, l&#39;utilisation de ces biomolécules souffre souvent du manque de disponibilité de la structure bien définie et des hydrates de carbone purs. Une plate-forme d&#39;automatisation basée sur la solution itérative des réactions en phase peut permettre la synthèse rapide et contrôlée de ces molécules de synthèse difficiles en utilisant b significativement plus faibleonstruire quantités de blocs que les traditionnels en phase solide des méthodes 16,17. Ici on signaler un protocole pour la solution automatisée en phase de synthèse d&#39;oligosaccharides tels que le mannose à base fluorée avec des ligands de ciblage extraction en phase solide pour la purification intermédiaire. Après développement de procédés automatiques pour faire l&#39;agent à base de carbohydrate ciblage, on décrit les méthodes pour leur fixation sur la surface de nanoparticules polyanhydride employant un ensemble robotique automatisé jusqu&#39;à actionné par LabVIEW comme décrit précédemment 10. Fonctionnalisation de surface avec des hydrates de carbone a montré son efficacité dans le ciblage PLC 10,11 et augmenter le débit du procédé de fabrication pour déterrer les complexités associées à un système multi-paramétrique sera d&#39;une grande valeur (Figure 1a).

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High-throughput Synthesis of Carbohydrates and Functionalization of Polyanhydride Nanoparticles

Dans cet article, une méthode à haut débit est présenté pour la synthèse d&#39;oligosaccharides et de leur attachement à la surface de nanoparticules polyanhydrides pour une utilisation ultérieure dans le ciblage des récepteurs spécifiques sur les cellules présentatrices d&#39;antigènes.

À haut débit la synthèse des glucides et fonctionnalisation de nanoparticules polyanhydride

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design ...

high-throughput-synthesis-carbohydrates-functionalization

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.3K vues.  Iowa State University. Dans cet article, une méthode à haut débit est présenté pour la synthèse d'oligosaccharides et de leur attachement à la surface de nanoparticules polyanhydrides pour une utilisation ultérieure dans le ciblage des récepteurs spécifiques sur les cellules présentatrices d'antigènes.

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Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Microarrays polymères pour la découverte à haut débit des biomatériaux

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Recherche

Bio-ingénierie

Combinatorial Synthesis of and High-throughput Protein Release from Polymer Film and Nanoparticle Libraries

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with conventional one-sample-at-a-time synthesis techniques, a more recent high-throughput approach has been developed enabling the synthesis and testing of large libraries of polyanhydrides1. This will facilitate more efficient optimization and design process of these biomaterials for drug and vaccine delivery applications. The method in this work describes the combinatorial synthesis of biodegradable polyanhydride film and nanoparticle libraries and the high-throughput detection of protein release from these libraries. In this robotically operated method (Figure 1), linear actuators and syringe pumps are controlled by LabVIEW, which enables a hands-free automated protocol, eliminating user error. Furthermore, this method enables the rapid fabrication of micro-scale polymer libraries, reducing the batch size while resulting in the creation of multivariant polymer systems. This combinatorial approach to polymer synthesis facilitates the synthesis of up to 15 different polymers in an equivalent amount of time it would take to synthesize one polymer conventionally. In addition, the combinatorial polymer library can be fabricated into blank or protein-loaded geometries including films or nanoparticles upon dissolution of the polymer library in a solvent and precipitation into a non-solvent (for nanoparticles) or by vacuum drying (for films). Upon loading a fluorochrome-conjugated protein into the polymer libraries, protein release kinetics can be assessed at high-throughput using a fluorescence-based detection method (Figures 2 and 3) as described previously1. This combinatorial platform has been validated with conventional methods2 and the polyanhydride film and nanoparticle libraries have been characterized with 1H NMR and FTIR. The libraries have been screened for protein release kinetics, stability and antigenicity; in vitro cellular toxicity, cytokine production, surface marker expression, adhesion, proliferation and differentiation; and in vivo biodistribution and mucoadhesion1-11. The combinatorial method developed herein enables high-throughput polymer synthesis and fabrication of protein-loaded nanoparticle and film libraries, which can, in turn, be screened in vitro and in vivo for optimization of biomaterial performance.

This method describes the combinatorial synthesis of biodegradable polyanhydride film and nanoparticle libraries and the high-throughput detection of protein release from these libraries.

Synthèse combinatoire des protéines et de décharge à haut débit à partir du film polymère et bibliothèques nanoparticules

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with ...

Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Biodegradable nanoparticles have emerged as a versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines against respiratory infectious diseases. Specifically, polyanhydride nanoparticles composed of the aliphatic sebacic acid (SA), the aromatic 1,6-bis(p-carboxyphenoxy)hexane (CPH), or the amphiphilic 1,8-bis(p-carboxyphenoxy)-3,6-dioxaoctane (CPTEG) display unique bulk and surface erosion kinetics1,2 and can be exploited to slowly release functional biomolecules (e.g., protein antigens, immunoglobulins, etc.) in vivo3,4,5. These nanoparticles also possess intrinsic adjuvant activity, making them an excellent choice for a vaccine delivery platform6,7,8.
	In order to elucidate the mechanisms governing the activation of innate immunity following intranasal mucosal vaccination, one must evaluate the molecular and cellular responses of the antigen presenting cells (APCs) responsible for initiating immune responses. Dendritic cells are the principal APCs found in conducting airways, while alveolar macrophages (AM&#632;) predominate in the lung parenchyma9,10,11. AM&#632; are highly efficient in clearing the lungs of microbial pathogens and cell debris12,13. In addition, this cell type plays a valuable role in the transport of microbial antigens to the draining lymph nodes, which is an important first step in the initiation of an adaptive immune response9. AM&#632; also express elevated levels of innate pattern recognition and scavenger receptors, secrete pro-inflammatory mediators, and prime na&iuml;ve T cells12,14. A relatively pure population of AM&#632; (e.g., greater than 80%) can easily be obtained via lung lavage for study in the laboratory. Resident AM&#632; harvested from immune competent animals provide a representative phenotype of the macrophages that will encounter the particle-based vaccine in vivo. Herein, we describe the protocols used to harvest and culture AM&#632; from mice and examine the activation phenotype of the macrophages following treatment with polyanhydride nanoparticles in vitro.

Herein, we describe protocols for harvesting murine alveolar macrophages, which are resident innate immune cells in the lung, and examining their activation in response to co-culture with polyanhydride nanoparticles.

La récolte macrophages alvéolaires murins et l&#39;évaluation d&#39;activation cellulaire induite par des nanoparticules polyanhydride

Biodegradable nanoparticles have emerged as a  versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines  against respiratory ...

High Throughput Single-cell and Multiple-cell Micro-encapsulation

Microfluidic encapsulation methods have been previously utilized to capture cells in picoliter-scale aqueous, monodisperse drops, providing confinement from a bulk fluid environment with applications in high throughput screening, cytometry, and mass spectrometry. We describe a method to not only encapsulate single cells, but to repeatedly capture a set number of cells (here we demonstrate one- and two-cell encapsulation) to study both isolation and the interactions between cells in groups of controlled sizes. By combining drop generation techniques with cell and particle ordering, we demonstrate controlled encapsulation of cell-sized particles for efficient, continuous encapsulation. Using an aqueous particle suspension and immiscible fluorocarbon oil, we generate aqueous drops in oil with a flow focusing nozzle. The aqueous flow rate is sufficiently high to create ordering of particles which reach the nozzle at integer multiple frequencies of the drop generation frequency, encapsulating a controlled number of cells in each drop. For representative results, 9.9 &mu;m polystyrene particles are used as cell surrogates. This study shows a single-particle encapsulation efficiency Pk=1 of 83.7% and a double-particle encapsulation efficiency Pk=2 of 79.5% as compared to their respective Poisson efficiencies of 39.3% and 33.3%, respectively. The effect of consistent cell and particle concentration is demonstrated to be of major importance for efficient encapsulation, and dripping to jetting transitions are also addressed. 
Introduction 
Continuous media aqueous cell suspensions share a common fluid environment which allows cells to interact in parallel and also homogenizes the effects of specific cells in measurements from the media. High-throughput encapsulation of cells into picoliter-scale drops confines the samples to protect drops from cross-contamination, enable a measure of cellular diversity within samples, prevent dilution of reagents and expressed biomarkers, and amplify signals from bioreactor products. Drops also provide the ability to re-merge drops into larger aqueous samples or with other drops for intercellular signaling studies.1,2 The reduction in dilution implies stronger detection signals for higher accuracy measurements as well as the ability to reduce potentially costly sample and reagent volumes.3 Encapsulation of cells in drops has been utilized to improve detection of protein expression,4 antibodies,5,6 enzymes,7 and metabolic activity8 for high throughput screening, and could be used to improve high throughput cytometry.9 Additional studies present applications in bio-electrospraying of cell containing drops for mass spectrometry10 and targeted surface cell coatings.11 Some applications, however, have been limited by the lack of ability to control the number of cells encapsulated in drops. Here we present a method of ordered encapsulation12 which increases the demonstrated encapsulation efficiencies for one and two cells and may be extrapolated for encapsulation of a larger number of cells.
To achieve monodisperse drop generation, microfluidic "flow focusing" enables the creation of controllable-size drops of one fluid (an aqueous cell mixture) within another (a continuous oil phase) by using a nozzle at which the streams converge.13 For a given nozzle geometry, the drop generation frequency f and drop size can be altered by adjusting oil and aqueous flow rates Qoil and Qaq. As the flow rates increase, the flows may transition from drop generation to unstable jetting of aqueous fluid from the nozzle.14 
When the aqueous solution contains suspended particles, particles become encapsulated and isolated from one another at the nozzle. For drop generation using a randomly distributed aqueous cell suspension, the average fraction of drops Dk containing k cells is dictated by Poisson statistics, where Dk = &lambda;k exp(-&lambda;)/(k!) and &lambda; is the average number of cells per drop. The fraction of cells which end up in the "correctly" encapsulated drops is calculated using Pk = (k x Dk)/&Sigma;(k' x Dk'). The subtle difference between the two metrics is that Dk relates to the utilization of aqueous fluid and the amount of drop sorting that must be completed following encapsulation, and Pk relates to the utilization of the cell sample. As an example, one could use a dilute cell suspension (low &lambda;) to encapsulate drops where most drops containing cells would contain just one cell. While the efficiency metric Pk would be high, the majority of drops would be empty (low Dk), thus requiring a sorting mechanism to remove empty drops, also reducing throughput.15
Combining drop generation with inertial ordering provides the ability to encapsulate drops with more predictable numbers of cells per drop and higher throughputs than random encapsulation. Inertial focusing was first discovered by Segre and Silberberg16 and refers to the tendency of finite-sized particles to migrate to lateral equilibrium positions in channel flow. Inertial ordering refers to the tendency of the particles and cells to passively organize into equally spaced, staggered, constant velocity trains. Both focusing and ordering require sufficiently high flow rates (high Reynolds number) and particle sizes (high Particle Reynolds number).17,18 Here, the Reynolds number Re =uDh/&nu; and particle Reynolds number Rep =Re(a/Dh)2, where u is a characteristic flow velocity, Dh [=2wh/(w+h)] is the hydraulic diameter, &nu; is the kinematic viscosity, a is the particle diameter, w is the channel width, and h is the channel height. Empirically, the length required to achieve fully ordered trains decreases as Re and Rep increase. Note that the high Re and Rep requirements (for this study on the order of 5 and 0.5, respectively) may conflict with the need to keep aqueous flow rates low to avoid jetting at the drop generation nozzle. Additionally, high flow rates lead to higher shear stresses on cells, which are not addressed in this protocol. The previous ordered encapsulation study demonstrated that over 90% of singly encapsulated HL60 cells under similar flow conditions to those in this study maintained cell membrane integrity.12 However, the effect of the magnitude and time scales of shear stresses will need to be carefully considered when extrapolating to different cell types and flow parameters. The overlapping of the cell ordering, drop generation, and cell viability aqueous flow rate constraints provides an ideal operational regime for controlled encapsulation of single and multiple cells.
Because very few studies address inter-particle train spacing,19,20 determining the spacing is most easily done empirically and will depend on channel geometry, flow rate, particle size, and particle concentration. Nonetheless, the equal lateral spacing between trains implies that cells arrive at predictable, consistent time intervals. When drop generation occurs at the same rate at which ordered cells arrive at the nozzle, the cells become encapsulated within the drop in a controlled manner. This technique has been utilized to encapsulate single cells with throughputs on the order of 15 kHz,12 a significant improvement over previous studies reporting encapsulation rates on the order of 60-160 Hz.4,15 In the controlled encapsulation work, over 80% of drops contained one and only one cell, a significant efficiency improvement over Poisson (random) statistics, which predicts less than 40% efficiency on average.12
In previous controlled encapsulation work,12 the average number of particles per drop &lambda; was tuned to provide single-cell encapsulation. We hypothesize that through tuning of flow rates, we can efficiently encapsulate any number of cells per drop when &lambda; is equal or close to the number of desired cells per drop. While single-cell encapsulation is valuable in determining individual cell responses from stimuli, multiple-cell encapsulation provides information relating to the interaction of controlled numbers and types of cells. Here we present a protocol, representative results using polystyrene microspheres, and discussion for controlled encapsulation of multiple cells using a passive inertial ordering channel and drop generation nozzle.

Combining monodisperse drop generation with inertial ordering of cells and particles, we describe a method to encapsulate a desired number of cells or particles in a single drop at kHz rates. We demonstrate efficiencies twice exceeding those of unordered encapsulation for single- and double-particle drops.

High Throughput unicellulaire et multiples cellules de micro-encapsulation

Microfluidic encapsulation methods have been previously utilized to capture cells in picoliter-scale aqueous, monodisperse drops, providing confinement ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

Évaluation de livraison Gene polymère nanoparticules d&#39;analyse de suivi par des nanoparticules et de cytométrie en flux à haut débit

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Microwave-driven Synthesis of Iron Oxide Nanoparticles for Fast Detection of Atherosclerosis

A fast and reproducible microwave-driven protocol has been developed for the synthesis of neridronate-functionalized nanoparticles. Starting from the synthesis of hydrophobic nanoparticles, our method is based on an adaptation from thermal decomposition method to microwave driven synthesis. The new methodology produces a decrease in the reaction times in comparison with traditional procedures. Moreover, the use of the microwave technology increases the reproducibility of the reactions, something important from the point of view of clinical applications. The novelty of this iron oxide nanoparticle is the attachment of Neridronate. The use of this molecule leads a bisphosphonate moiety towards the outside of the nanoparticle that provides Ca2+ binding properties in vitro and selective accumulation in vivo in the atheroma plaque. The protocol allows the synthesis and plaque detection in about 3 hr since the initial synthesis from organic precursors. Their accumulation in the atherosclerotic area in less than 1 hr provides a contrast agent particularly suitable for clinical applications.

Microwave technology enables extremely fast synthesis of iron oxide nanoparticles for atherosclerosis plaque characterization. The use of an aminobisphosphonate in the external side of the nanoparticle provides a fast accumulation in the atherosclerotic area.

Synthèse entraînée par micro-ondes de l&#39;oxyde de fer Nanoparticules pour la détection rapide de l&#39;athérosclérose

A fast and reproducible microwave-driven protocol has been developed for the synthesis of neridronate-functionalized nanoparticles. Starting from the ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Une plate-forme microfluidique pour l&#39;isolement à haut débit unique cellule et Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

High-throughput Identification of Bacteria Repellent Polymers for Medical Devices

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as contributing to antimicrobial resistance. One possible avenue for the reduction of device-associated infections is the identification of bacteria-repellent polymer coatings for these devices, which would prevent bacterial binding at the initial attachment step. A method for the identification of such repellent polymers, based on the parallel screening of hundreds of polymers using a microarray, is described here. This high-throughput method resulted in the identification of a range of promising polymers that resisted binding of various clinically relevant bacterial species individually and also as multi-species communities. One polymer, PA13 (poly(methylmethacrylate-co-dimethylacrylamide)), demonstrated significant reduction in attachment of a number of hospital isolates when coated onto two commercially available central venous catheters. The method described could be applied to identify polymers for a wide range of applications in which modification of bacterial attachment is important.

A high-throughput microarray method for the identification of polymers which reduce bacterial surface binding on medical devices is described.

Haut-débit Identification des bactéries Polymères répulsifs pour les dispositifs médicaux

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous microscale cryogels (microcryogels), which can be loaded with a variety of cell types to form 3D microtissues. Herein, we present the protocol to fabricate versatile 3D microtissues and their applications in regenerative therapy and drug screening. Size and shape-controllable microcryogels can be fabricated on an array chip, which can be harvested off-chip as individual cell-loaded carriers for injectable regenerative therapy or be further assembled on-chip into 3D microtissue arrays for high-throughput drug screening. Due to the high elastic nature of these microscale cryogels, the 3D microtissues exhibit great injectability for minimally invasive cell therapy by protecting cells from mechanical shear force during injection. This ensures enhanced cell survival and therapeutic effect in the mouse limb ischemia model. Meanwhile, assembly of 3D microtissue arrays in a standard 384-multi-well format facilitates the use of common laboratory facilities and equipment, enabling high-throughput drug screening on this versatile 3D cell culture platform.

This protocol describes the fabrication of elastic 3D macroporous microcryogels by integrating microfabrication with cryogelation technology. Upon loading with cells, 3D microtissues are generated, which can be readily injected in vivo to facilitate regenerative therapy or assembled into arrays for in vitro high-throughput drug screening.

Microtissues 3D pour thérapie régénérative Injectable et de dépistage des drogues de haut débit

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of various diseases. This application relies on genetic modification, self-assembly, and cysteine conjugation to fulfill the tumor-targeting application of recombinant VLPs. Compared with genetic modification alone, chemical conjugation of foreign peptides to VLPs offers a significant advantage because it allows a variety of entities, such as synthetic peptides or oligosaccharides, to be conjugated to the surface of VLPs in a modulated and flexible manner without alteration of the VLP assembly.
Here, we demonstrate how to use the hepatitis E virus nanoparticle (HEVNP), a modularized theranostic capsule, as a multifunctional delivery carrier. Functions of HEVNPs include tissue-targeting, imaging, and therapeutic delivery. Based on the well-established structural research of HEVNP, the structurally independent and surface-exposed residues were selected for cysteine replacement as conjugation sites for maleimide-linked chemical groups via thiol-selective linkages. One particular cysteine-modified HEVNP (a Cys replacement of the asparagine at 573 aa (HEVNP-573C)) was conjugated to a breast cancer cell-specific ligand, LXY30 and labeled with near-infrared (NIR) fluorescence dye (Cy5.5), rendering the tumor-targeted HEVNPs as effective diagnostic capsules (LXY30-HEVNP-Cy5.5). Similar engineering strategies can be employed with other macromolecular complexes with well-known atomic structures to explore potential applications in theranostic delivery.

We have engineered the capsid protein of hepatitis E virus as a theranostic nanoparticle (HEVNP). HEVNP self-assembles into a stable icosahedral cage in mucosal delivery. Here, we describe the modification of HEVNPs for tumor targeting by mutating surface-exposed residues to cysteines, which conjugate synthetic ligands that specifically bind tumor cells.

Fonctionnalisation de surface des nanoparticules de Virus de l’hépatite E à l’aide de méthodes chimiques de conjugaison

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of ...