Ce travail a été financé par des golfeurs contre le cancer, en Caroline du Centre de nanotechnologie excellence pilote de subvention, l&#39;Université Cancer Research Fund et l&#39;Institut national de la santé K-12 Prix du développement de carrière.

1. Synthèse de PLGA-b-polymère PEG <ol><li> Poly (D, L-lactide-co-glycolide) (PLGA) avec des groupes terminaux carboxylate (PLGA-carboxylate) est dissous dans un solvant pour le PLGA (comme mentionné dans la section matériaux) à une concentration de 5 mM. PLGA peut être dissoute à cette concentration avec une agitation douce. </li><li> Les deux NHS (poids moléculaire 115,09) et l&#39;EDC (poids moléculaire 191,7) sont dissous dans la solution de PLGA à une concentration de 25 mM. (EDC et du NHS sont ajoutés dans un excès stoechiométrique de 5 fois par rapport à PLGA). PLGA-carboxylate est converti en PLGA-NHS en ajoutant EDC et NHS de PLGA-carboxylate solution avec une agitation douce pendant environ 1 heure. </li><li> Le produit de réaction PLGA-NHS est précipité en ajoutant du méthanol solution de lavage. Environ 10 fois plus de volume de méthanol est ajouté à la solution. La solution est centrifugée à 2000 xg pour précipiter le PLGA-NHS et jeter le surnageant (supprime les traces d&#39;EDC et du NHS. Cette procédure de lavage avec du méthanol est répété au moins trois fois. </li><li> Le culot PLGA-NHS est séché sous vide pendant 30 minutes pour éliminer toute trace de la solution de lavage. </li><li> Le culot PLGA-NHS est maintenant re-dissous dans le même solvant à la même concentration qui a été utilisé initialement pour dissoudre PLGA. Le PEG hétérobifonctionnel (amine-PEG-carboxylate) est alors ajouté à la solution de PLGA à une concentration de 5 mm (rapport stœchiométrique de 1:1). La solution du mélange est incubé pendant 24 heures avec une agitation constante. </li><li> Après 24 heures, le produit de la réaction PLGA-b-PEG copolymère bloc est précipité en ajoutant du méthanol solution de lavage en excès. Répétez le processus de lavage et de centrifugation comme mentionné ci-dessus à trois reprises. Cela permettra d&#39;éliminer tous les excès de PEG n&#39;ayant pas réagi. </li><li> Le copolymère PLGA-b-PEG bloc est séché sous vide. </li></ol> 2. La préparation de nanoparticules PLGA-b-PEG Les nanoparticules avec un noyau recouvert de PLGA PEG à la surface peuvent être préparés avec ces copolymères diblocs. Une variété de différents médicaments hydrophobes peuvent être encapsulés dans des nanoparticules telles. Composés fluorescents peuvent être encapsulés dans des nanoparticules ou peuvent être conjugués à PLGA et donc ces nanoparticules peuvent être utilisés pour l&#39;imagerie de fluorescence. Méthode nanoprécipitation est utilisé pour faire des nanoparticules en particulier lorsque la cargaison souhaitée à encapsuler est hautement hydrophobe dans la nature. <ol><li> Le PLGA-b-PEG copolymère bloc et que le médicament / cargaison (à encapsuler) sont dissous dans un solvant qui dissout PLGA. PLGA peut être dissous par de nombreux solvants communs, y compris l&#39;acétonitrile, le DCM, le tétrahydrofuranne, l&#39;acétone ou l&#39;acétate d&#39;éthyle. Le choix du solvant est critique, car elle influe sur les propriétés des nanoparticules. Ainsi, un solvant approprié doit être utilisé dans cette étape. </li><li> Le mélange polymère / médicament est ensuite ajouté goutte à goutte à 3-5 volumes d&#39;eau en remuant pour obtenir une concentration polymère final d&#39;environ 3 mg / mL. (Fig. 2) </li><li> L&#39;agitation est poursuivie pendant 2 heures sous pression réduite pour permettre à des nanoparticules pour former par auto-assemblage et d&#39;éliminer les traces de solvant organique. </li><li> La récolte et la purification: Les nanoparticules sont ensuite concentrées par centrifugation à 2700 x g pendant 10 min en utilisant un filtre Amicon (20 kDa MWCO), lavé, et reconstitué dans du PBS. Cela supprime toutes les marchandises non-piégé de drogue /. Base caractérisations biophysiques, comme la taille, la charge de surface, et l&#39;efficacité de chargement de drogue peuvent être effectuées pour mieux comprendre les propriétés des nanoparticules. </li></ol> 3. Stockage La lyophilisation est un procédé couramment utilisé pour stocker des nanoparticules 11. La lyophilisation préserve les caractéristiques physiques et chimiques des nanoparticules pour la stabilité à long terme 12. Le procédé de lyophilisation peut causer du stress sur les particules et de déstabiliser la formulation, afin de cryo-protecteurs (protection contre le stress de congélation) et Lyo-protecteurs (protection contre le stress de séchage) sont couramment utilisés. Le choix de ces protecteurs est déterminée par la longueur désirée de 13 temps de stockage. <ol><li> Dans la lyophilisation, il ya la solidification totale de l&#39;échantillon par le gel en dessous de sa Tg. </li><li> Dans l&#39;étape de séchage, la glace est éliminée par sublimation. La température et la pression doit être optimisé pour atteindre une efficacité lyophilisation. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs: Caractérisation de PLGA-b-PEG Di-copolymère bloc Différentes techniques peuvent être utilisées pour confirmer la conjugaison réussie de polymères. La composition de PLGA-b-PEG peut être caractérisée en utilisant un 400 MHz 1H résonance magnétique nucléaire (RMN). Poids moléculaire du produit formé (PLGA-b-PEG) peut être vérifiée par chromatographie sur gel perméable (GPC). Le PLGA-b - PEG de poids moléculaire Distributiocourbe de n et le temps d&#39;élution doit être différent de PLGA et PEG seul. En combinaison, ces techniques devraient caractériser le produit formé et déterminer si la réaction de conjugaison a été couronnée de succès. Caractérisation de PLGA-b-PEG nanoparticules La taille des particules et la distribution de la taille peut être mesurée par diffusion de lumière dynamique. Différents paramètres dans le processus de nanoprécipitation affecter la taille des particules. Les masses moléculaires des polymères utilisés initialement (à la fois PLGA et PEG) a également l&#39;effet de la distribution granulométrique. Microscopie électronique à la transition (TEM) peut également être utilisé pour confirmer la distribution de la taille et la structure des nanoparticules comme on le voit dans la figure 3. La granulométrie est généralement dans la gamme nm. Grandes tailles de particules avec une distribution de taille inégale peut indiquer soit une erreur dans la réaction de conjugaison ou de la méthode nanoprécipitation besoins d&#39;optimisation. De plus, la surface de potentiel zêta peut être mesuré par ZetaPALS. L&#39;efficacité du chargement de drogue / fret peut être quantifiée avec HPLC standard. Les particules sont dissoutes dans un solvant organique et par HPLC peuvent être effectuées pour mesurer l&#39;absorbance de la drogue / fret (fig. 4). L&#39;étude cinétique de libération du médicament peut être fait quand elle est connue des quantités fixes de nanoparticules sont dialysées dans 30 Slide-A-Lyzer unités de dialyse MINI. A intervalles de temps fixe, le contenu de l&#39;unité de dialyse sont collectées et un volume égal de solvant organique est ajouté pour dissoudre les nanoparticules. HPLC est effectuée sur ces échantillons pour quantifier la teneur en médicament / fret. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3398/3398fig1.jpg" /> Figure 1. EDC / NHS chimie <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3398/3398fig2.jpg" /> Figure 2. Méthode nanoprécipitation pour préparer des nanoparticules polymériques. La solution organique d&#39;un solvant (acétonitrile ou DCM) contenant le dibloc PEG-PLGA et de la drogue ou des marchandises à charger dans la particule est ajoutée goutte à goutte à 3-5 ml d&#39;agitation H 2 O. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3398/3398fig3.jpg" /> Figure 3. Transmission Electron Microscopy des nanopartices. Une image TEM de PEG-PLGA nanoparticules contenant wortamin. L&#39;acide phosphotungstique a été utilisé comme agent de contraste. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3398/3398fig4.jpg" /> Figure 4. La libération contrôlée de médicament à partir de nanoparticules. Libération de paclitaxel à partir de nanoparticules après la dialyse dans du PBS. Au moment indiqué, les particules ont été retirés de cassettes de dialyse et solubilisé dans l&#39;acétonitrile. La solution a été mesurée par HPLC. Deux lots distincts de nanoparticules ont été comparés. <div id="myEventWatcherDiv"></div><div id="myEventWatcherDiv"></div>

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	<li>Drotleffa, S., Lungwitz, U., Breuniga, M., Dennis, A., Blunk, T., Tessmarc, J., Go&#235;pferich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+polymers+in+pharmaceutical+and+biomedical+sciences.">Biomimetic polymers in pharmaceutical and biomedical sciences.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 58, 385-407 (2004).</li><li>Bulte, J. W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nanoparticles in Biomedical Imaging. 3, (2008).</li><li>Omid, C., Farokhzad, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Nanotechnology+on+Drug+Delivery.">Impact of Nanotechnology on Drug Delivery.</a> ACS NANO. 3, 16-20 (2009).</li><li>Li, Y. -. P., Pei, Y. -. Y., Xian-Ying, Z., Zhou-Hui, G., Zhao-Hui, Z., Wei-Fang, Y., Jian-Jun, Z., Jian-Hua, Z., Xiu-Jian, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEGylated+PLGA+nanoparticles+as+protein+carriers:+synthesis,+preparation+and+biodistribution+in+rats.">PEGylated PLGA nanoparticles as protein carriers: synthesis, preparation and biodistribution in rats.</a> Journal of Controlled Release. 71, 203-211 (2011).</li><li>Hermanson, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioconjugate techniques. , (2008).</li><li>Jeong, B., Bae, Y. H., Lee, D. S., Kim, S. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formulation+of+Functionalized+PLGA-PEG+Nanoparticles+for+In+Vivo+Targeted+Drug+Delivery.">Formulation of Functionalized PLGA-PEG Nanoparticles for In Vivo Targeted Drug Delivery.</a> Biomaterials. 28, 869-876 (2007).</li><li>Gu, F., Zhang, L. F., Teply, B. A., Mann, N., Wang, A., Radovic-Moreno, A. F., Langer, R., Farokhzad, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+engineering+of+targeted+nanoparticles+by+using+self-assembled+biointegrated+block+copolymers.">Precise engineering of targeted nanoparticles by using self-assembled biointegrated block copolymers.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 105, 2586-2591 (2008).</li><li>Sanna, V., Pintus, G., Roggio, A. M., Punzoni, A., Posadino, A. M., Arca, A., Marceddu, S., Bandiera, P., Uzzau, S., Sechi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Biocompatible+Nanoparticles+for+the+Delivery+of+(-)-Epigallocatechin+3-Gallate+to+Prostate+Cancer+Cells.">Targeted Biocompatible Nanoparticles for the Delivery of (-)-Epigallocatechin 3-Gallate to Prostate Cancer Cells.</a> J. Med. Chem. 54, 1321-1332 (2011).</li><li>Abdelwahed, W., Degobert, G., Stainmesse, S., Fessi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freeze-drying+of+nanoparticles:+Formulation,+process+and+storage+considerations.">Freeze-drying of nanoparticles: Formulation, process and storage considerations.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 58, 1688-1713 (2006).</li><li>Holzer, M., Vogel, V., M&#228;ntele, W., Schwartz, D., Haase, W., Langer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physico-chemical+characterisation+of+PLGA+nanoparticles+after+freeze-drying+and+storage.">Physico-chemical characterisation of PLGA nanoparticles after freeze-drying and storage.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 72, 428-437 (2009).</li><li>Lee, M. K., Kim, M. Y., Kim, S., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryoprotectants+for+Freeze+Drying+of+Drug+Nano-Suspensions:+Effect+of+Freezing+Rate.">Cryoprotectants for Freeze Drying of Drug Nano-Suspensions: Effect of Freezing Rate.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 98, 4808-4817 (2009).</li><li>Wang, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofunctionalized+targeted+nanoparticles+for+therapeutic+applications.">Biofunctionalized targeted nanoparticles for therapeutic applications.</a> Expert opinion on biological therapy. 8, 1063-1070 (2008).</li><li>Jeong, B., Bae, Y. H., Kim, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+release+from+biodegradable+injectable+thermosensitive+hydrogel+of+PEG-PLGA-PEG+triblock+copolymers.">Drug release from biodegradable injectable thermosensitive hydrogel of PEG-PLGA-PEG triblock copolymers.</a> J. Control Release. 63, 155-163 (2000).</li><li>Gref, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+long-circulating+polymeric+nanospheres.">Biodegradable long-circulating polymeric nanospheres.</a> Science. 263, 1600-1603 (1994).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

La méthode utilisant nanoprécipitation diblocs co-polymères représente une méthode simple et rapide aux ingénieurs des nanoparticules polymériques. Les nanoparticules obtenues sont composées d&#39;un noyau hydrophobe qui peut être utilisé pour la livraison de composés peu solubles. La couche de surface hydrophile permet une excellente solubilité aqueuse tout en fournissant un motif pour la conjugaison potentielle supplémentaire à un ligand de ciblage. Il ya des plates-formes de...

<table border="1"><tbody><tr><td> Réactifs </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> EDC </td><td> Thermo Scientific </td><td> 22980 </td><td> Réactif Conjugaison </td></tr><tr><td> NHS </td><td> Thermo Scientific </td><td> 24500 </td><td> Réactif Conjugaison </td></tr><tr><td> amine-PEG-carboxylate </td><td> Laysan Bio Inc </td><td> NH2-PEG-CM-5000 </td><td> Polymère (Peut utiliser n&#39;importe MW PEG, 5000 est indiqué ici) </td></tr><tr><td> PLGA-carbxylate </td><td> Lactel </td><td> B6013-2 </td><td> Polymères </td></tr><tr><td> Le dichlorométhane (DCM) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 34856 </td><td> Solvant </td></tr><tr><td> Acétonitrile pureté&gt; 99% </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 34851 </td><td> Solvant </td></tr><tr><td> Méthanol pureté&gt; 99% </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 34860 </td><td> Laver </td></tr></tbody></table>

formulation of diblock polymeric nanoparticles through nanoprecipitation technique

La nanotechnologie est une branche relativement nouvelle de la science qui consiste à mobiliser les propriétés uniques des particules qui sont nanomètres échelle (nanoparticules). Les nanoparticules peuvent être conçus de façon précise où leur chimie taille, la composition et la surface peut être soigneusement contrôlée. Cela permet une liberté sans précédent de modifier certaines des propriétés fondamentales de leur cargaison, telles que la solubilité, diffusivité des caractéristiques de biodistribution, la libération et l&#39;immunogénicité. Depuis leur création, les nanoparticules ont été utilisées dans de nombreux domaines de la science et la médecine, y compris la livraison de médicaments, imagerie, biologie cellulaire et 1-4. Cependant, il n&#39;a pas été entièrement utilisé en dehors des «laboratoires nanotechnologies» en raison de barrières techniques perçue. Dans cet article, nous décrivons une méthode simple pour synthétiser une plate-forme de nanoparticules à base de polymère qui a une large gamme d&#39;applications potentielles. La première étape consiste à synthétiser un dibloc co-polymère qui possède à la fois un domaine hydrophobe et hydrophile de domaine. Utiliser PLGA et PEG que les polymères modèle, nous a décrit une réaction de conjugaison avec EDC / NHS chimie 5 (figure 1). Nous discutons également le processus de purification de polymères. Le dibloc synthétisé co-polymère peuvent s&#39;auto-assembler dans des nanoparticules dans le processus de nanoprécipitation travers hydrophobe-hydrophile interactions. Les nanoparticules de polymère décrite est très polyvalent. Le noyau hydrophobe de la nanoparticule peut être utilisé pour transporter de la drogue peu solubles pour experiments6 livraison de drogue. Par ailleurs, les nanoparticules peuvent surmonter le problème des solvants toxiques pour peu solubles réactifs de biologie moléculaire, telles que wortmannine, ce qui nécessite un solvant comme le DMSO. Cependant, le DMSO peut être toxique pour les cellules et d&#39;interférer avec l&#39;expérience. Ces médicaments peu solubles et réactifs peuvent être dispensés de manière efficace en utilisant des nanoparticules de polymères avec une toxicité minimale. Nanoparticules de polymère peut également être chargé avec un colorant fluorescent et utilisées pour les études de trafic intracellulaire. Enfin, ces nanoparticules de polymère peut être conjugué au ciblage des ligands par PEG surface. Ces nanoparticules ciblées peuvent être utilisées pour étiqueter des épitopes spécifiques sur ou dans les cellules de 7-10.

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Formulation of Diblock Polymeric Nanoparticles through Nanoprecipitation Technique

Cet article décrit une méthode pour synthétiser nanoprécipitation à base de polymères diblocs nanoparticules à l&#39;aide de co-polymères. Nous allons discuter de la synthèse de co-polymères diblocs, la technique nanoprécipitation, et les applications potentielles.

Formulation de nanoparticules polymériques dibloc par la technique nanoprécipitation

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale ...

formulation-diblock-polymeric-nanoparticles-through-nanoprecipitation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

37.1K vues.  University of North Carolina School of Medicine. Cet article décrit une méthode pour synthétiser nanoprécipitation à base de polymères diblocs nanoparticules à l'aide de co-polymères. Nous allons discuter de la synthèse de co-polymères diblocs, la technique nanoprécipitation, et les applications potentielles.

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Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

Évaluation de livraison Gene polymère nanoparticules d&#39;analyse de suivi par des nanoparticules et de cytométrie en flux à haut débit

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Recherche

Bio-ingénierie

Programming Stem Cells for Therapeutic Angiogenesis Using Biodegradable Polymeric Nanoparticles

Controlled vascular growth is critical for successful tissue regeneration and wound healing, as well as for treating ischemic diseases such as stroke, heart attack or peripheral arterial diseases. Direct delivery of angiogenic growth factors has the potential to stimulate new blood vessel growth, but is often associated with limitations such as lack of targeting and short half-life in vivo. Gene therapy offers an alternative approach by delivering genes encoding angiogenic factors, but often requires using virus, and is limited by safety concerns. Here we describe a recently developed strategy for stimulating vascular growth by programming stem cells to overexpress angiogenic factors in situ using biodegradable polymeric nanoparticles. Specifically our strategy utilized stem cells as delivery vehicles by taking advantage of their ability to migrate toward ischemic tissues in vivo. Using the optimized polymeric vectors, adipose-derived stem cells were modified to overexpress an angiogenic gene encoding vascular endothelial growth factor (VEGF). We described the processes for polymer synthesis, nanoparticle formation, transfecting stem cells in vitro, as well as methods for validating the efficacy of VEGF-expressing stem cells for promoting angiogenesis in a murine hindlimb ischemia model.

We describe the method of programming stem cells to overexpress therapeutic factors for angiogenesis using biodegradable polymeric nanoparticles. Processes described include polymer synthesis, transfecting adipose-derived stem cells in vitro, and validating the efficacy of programmed stem cells to promote angiogenesis in a murine hindlimb ischemia model.

Les cellules souches de programmation pour angiogenèse thérapeutique utilisant polymère biodégradable nanoparticules

Controlled vascular growth is critical for successful tissue regeneration and wound healing, as well as for treating ischemic diseases such as stroke, ...

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and used to dictate the shape as well as the diameter of a core stream.&#160;Grooves in the top and bottom of a microfluidic channel were designed to direct the sheath fluid and shape the core fluid.&#160;By matching the viscosity and hydrophilicity of the sheath and core fluids, the interfacial effects are minimized and complex fluid shapes can be formed.&#160;Controlling the relative flow rates of the sheath and core fluids determines the cross-sectional area of the core fluid.&#160;Fibers have been produced with sizes ranging from 300 nm to ~1 mm, and fiber cross-sections can be round, flat, square, or complex as in the case with double anchor fibers. Polymerization of the core fluid downstream from the shaping region solidifies the fibers.&#160;Photoinitiated click chemistries are well suited for rapid polymerization of the core fluid by irradiation with ultraviolet light.&#160;Fibers with a wide variety of shapes have been produced from a list of polymers including liquid crystals, poly(methylmethacrylate), thiol-ene and thiol-yne resins, polyethylene glycol, and hydrogel derivatives. Minimal shear during the shaping process and mild polymerization conditions also makes the fabrication process well suited for encapsulation of cells and other biological components.

Two adjacent fluids passing through a grooved microfluidic channel can be directed to form a sheath around a prepolymer core; thereby&#160;determining both shape and cross-section. Photoinitiated polymerization, such as thiol click chemistry, is well suited for rapidly solidifying the core fluid into a microfiber with predetermined size and shape.

Fabrication microfluidique de fibres polymères et biohybrides avec une taille et une forme redessinées

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a photomask consisting of embedded micro-lenses. Embedded micro-lenses were found to influence MN geometry (sharpness). Robust MN arrays with tip diameters ranging between 41.5 &#181;m &#177; 8.4 &#181;m and 71.6 &#181;m &#177; 13.7 &#181;m, with two different lengths (1,336 &#181;m &#177; 193 &#181;m and 957 &#181;m &#177; 171 &#181;m) were fabricated. These MN arrays may provide potential applications in delivery of low molecular and macromolecular therapeutic agents through skin.

Here, we present a protocol describing a mold-free fabrication process of the polymeric microneedles by photolithography.

Polymère Microneedle tableau Fabrication par photolithographie

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

Fabricating Superhydrophobic Polymeric Materials for Biomedical Applications

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial applications. Here we describe how electrospinning or electrospraying a polymer mixture containing a biodegradable, biocompatible aliphatic polyester (e.g., polycaprolactone and poly(lactide-co-glycolide)), as the major component, doped with a hydrophobic copolymer composed of the polyester and a stearate-modified poly(glycerol carbonate) affords a superhydrophobic biomaterial. The fabrication techniques of electrospinning or electrospraying provide the enhanced surface roughness and porosity on and within the fibers or the particles, respectively. The use of a low surface energy copolymer dopant that blends with the polyester and can be stably electrospun or electrosprayed affords these superhydrophobic materials. Important parameters such as fiber size, copolymer dopant composition and/or concentration, and their effects on wettability are discussed. This combination of polymer chemistry and process engineering affords a versatile approach to develop application-specific materials using scalable techniques, which are likely generalizable to a wider class of polymers for a variety of applications.

Two- and three-dimensional superhydrophobic polymeric materials are prepared by electrospinning or electrospraying biodegradable polymers blended with a lower surface energy polymer of similar composition.

Superhydrophobes fabrication de matériaux polymères pour des applications biomédicales

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial ...

Predicting Gene Silencing Through the Spatiotemporal Control of siRNA Release from Photo-responsive Polymeric Nanocarriers

New materials and methods are needed to better control the binding vs. release of nucleic acids for a wide range of applications that require the precise regulation of gene activity. In particular, novel stimuli-responsive materials with improved spatiotemporal control over gene expression would unlock translatable platforms in drug discovery and regenerative medicine technologies. Furthermore, an enhanced ability to control nucleic acid release from materials would enable the development of streamlined methods to predict nanocarrier efficacy a priori, leading to expedited screening of delivery vehicles. Herein, we present a protocol for predicting gene silencing efficiencies and achieving spatiotemporal control over gene expression through a modular photo-responsive nanocarrier system. Small interfering RNA (siRNA) is complexed with mPEG-b-poly(5-(3-(amino)propoxy)-2-nitrobenzyl methacrylate) (mPEG-b-P(APNBMA)) polymers to form stable nanocarriers that can be controlled with light to facilitate tunable, on/off siRNA release. We outline two complementary assays employing fluorescence correlation spectroscopy and gel electrophoresis for the accurate quantification of siRNA release from solutions mimicking intracellular environments. Information gained from these assays was incorporated into a simple RNA interference (RNAi) kinetic model to predict the dynamic silencing responses to various photo-stimulus conditions. In turn, these optimized irradiation conditions allowed refinement of a new protocol for spatiotemporally controlling gene silencing. This method can generate cellular patterns in gene expression with cell-to-cell resolution and no detectable off-target effects. Taken together, our approach offers an easy-to-use method for predicting dynamic changes in gene expression and precisely controlling siRNA activity in space and time. This set of assays can be readily adapted to test a wide variety of other stimuli-responsive systems in order to address key challenges pertinent to a multitude of applications in biomedical research and medicine.

We present a novel method that uses photo-responsive block copolymers for more efficient spatiotemporal control of gene silencing with no detectable off-target effects. Additionally, changes in gene expression can be predicted using straightforward siRNA release assays and simple kinetic modeling.

Prévoir le silencieux des gènes grâce au contrôle spatiotemporel de la libération de siRNA de Nanocarriers polymériques adaptés à la photo

New materials and methods are needed to better control the binding vs. release of nucleic acids for a wide range of applications that require the precise ...

Rapid, Scalable Assembly and Loading of Bioactive Proteins and Immunostimulants into Diverse Synthetic Nanocarriers Via Flash Nanoprecipitation

Nanomaterials present a wide range of options to customize the controlled delivery of single and combined molecular payloads for therapeutic and imaging applications. This increased specificity can have significant clinical implications, including decreased side effects and lower dosages with higher potency. Furthermore, the in situ targeting and controlled modulation of specific cell subsets can enhance in vitro and in vivo investigations of basic biological phenomena and probe cell function. Unfortunately, the required expertise in nanoscale science, chemistry and engineering often prohibit laboratories without experience in these fields from fabricating and customizing nanomaterials as tools for their investigations or vehicles for their therapeutic strategies. Here, we provide protocols for the synthesis and scalable assembly of a versatile non-toxic block copolymer system amenable to the facile formation and loading of nanoscale vehicles for biomedical applications. Flash nanoprecipitation is presented as a methodology for rapid fabrication of diverse nanocarriers from poly(ethylene glycol)-bl-poly(propylene sulfide) copolymers. These protocols will allow laboratories with a wide range of expertise and resources to easily and reproducibly fabricate advanced nanocarrier delivery systems for their applications. The design and construction of an automated instrument that employs a high-speed syringe pump to facilitate the flash nanoprecipitation process and to allow enhanced control over the homogeneity, size, morphology and loading of polymersome nanocarriers is described.

Nanomaterials provide versatile mechanisms of controlled therapeutic delivery for both basic science and translational applications, but their fabrication often requires expertise that is unavailable in most biomedical laboratories. Here, we present protocols for the scalable fabrication and therapeutic loading of diverse self-assembled nanocarriers using flash nanoprecipitation.

Assemblage rapide, évolutive et dans divers Nanocarriers synthétique Via Flash nanoprécipitation apport de protéines bioactives et Immunostimulants

Nanomaterials present a wide range of options to customize the controlled delivery of single and combined molecular payloads for therapeutic and imaging ...

Protein Kinase C-delta Inhibitor Peptide Formulation using Gold Nanoparticles

Protein kinase C-delta inhibitor (PKC&#948;i) is a promising drug to prevent ischemia-reperfusion-induced organ injury. It is usually conjugated to a cell-penetrating peptide, TAT, for intracellular delivery. However, TAT has shown non-specific biological activities. Gold nanoparticles (GNPs) can be used as drug delivery carriers without recognized toxicity. Therefore, we have used a GNP/peptide hybrid to deliver PKC&#948;i. Two short peptides (P2: CAAAAE and P4: CAAAAW), at a 95:5 ratio, were used to modify the surface properties of GNP. GNPs conjugated with PKC&#948;i (GNP/PKCi) are stable in distilled water, 0.9% NaCl, and phosphate-buffered saline (PBS) containing bovine serum albumin or fetal bovine serum. Intravenous injection of GNP-PKCi was previously shown to prevent ischemia-reperfusion injury of the lung. This article outlines a protocol to formulate GNP/PKCi and assess the physiochemical properties of GNP/PKCi. We have used similar methods to formulate other peptide-based drugs with GNP. This article will hopefully draw more attention to this novel intracellular drug delivery technology and its applications in vivo.

We have previously used a gold nanoparticle peptide hybrid to intravenously deliver a synthetic peptide, protein kinase C-delta inhibitor, which reduced ischemia-reperfusion-induced acute lung injury. Here we show the detailed protocol of the drug formulation. Other intracellular peptides can be formulated similarly.

Protéine Kinase C-delta inhibiteur Peptide Formulation utilisant des nanoparticules d’or

Protein kinase C-delta inhibitor (PKC&#948;i) is a promising drug to prevent ischemia-reperfusion-induced organ injury. It is usually conjugated to a ...

Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can improve bioavailability and modify drug distribution within the body. For hydrophilic drugs like peptides or proteins, encapsulation within NPs can also provide protection from natural clearance mechanisms. There are few techniques for the production of polymeric NPs that are scalable. Flash NanoPrecipitation (FNP) is a process that uses engineered mixing geometries to produce NPs with narrow size distributions and tunable sizes between 30 and 400 nm. This protocol provides instructions on the laboratory-scale production of core-shell polymeric nanoparticles of a target size using FNP. The protocol can be implemented to encapsulate either hydrophilic or hydrophobic compounds with only minor modifications. The technique can be readily employed in the laboratory at milligram scale to screen formulations. Lead hits can directly be scaled up to gram- and kilogram-scale. As a continuous process, scale-up involves longer mixing process run time rather than translation to new process vessels. NPs produced by FNP are highly loaded with therapeutic, feature a dense stabilizing polymer brush, and have a size reproducibility of &#177; 6%.

Flash NanoPrecipitation (FNP) is a scalable approach to produce polymeric core-shell nanoparticles. Lab-scale formulations for the encapsulation of hydrophobic or hydrophilic therapeutics are described.

Flash Nanoprécipitation pour l’Encapsulation des composés hydrophobes et hydrophiles en nanoparticules polymériques

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can ...

Preparation of Neutrally-charged, pH-responsive Polymeric Nanoparticles for Cytosolic siRNA Delivery

The success of siRNA as a targeted molecular medicine is dependent upon its efficient cytosolic delivery to cells within the tissue of pathology. Clinical success for treating previously &#8216;undruggable&#8217; hepatic disease targets with siRNA has been achieved. However, efficient tumor siRNA delivery necessitates additional pharmacokinetic design considerations, including long circulation time, evasion of clearance organs (e.g., liver and kidneys), and tumor penetration and retention. Here, we describe the preparation and in vitro physicochemical/biological characterization of polymeric nanoparticles designed for efficient siRNA delivery, particularly to non-hepatic tissues such as tumors. The siRNA nanoparticles are prepared by electrostatic complexation of siRNA and the diblock copolymer poly(ethylene glycol-b-[2-(dimethylamino)ethyl methacrylate-co-butyl methacrylate]) (PEG-DB) to form polyion complexes (polyplexes) where siRNA is sequestered within the polyplex core and PEG forms a hydrophilic, neutrally-charged corona. Moreover, the DB block becomes membrane-lytic as vesicles of the endolysosomal pathway acidify (&#60; pH 6.8), triggering endosomal escape and cytosolic delivery of siRNA. Methods to characterize the physicochemical characteristics of siRNA nanoparticles such as size, surface charge, particle morphology, and siRNA loading are described. Bioactivity of siRNA nanoparticles is measured using luciferase as a model gene in a rapid and high-throughput gene silencing assay. Designs which pass these initial tests (such as PEG-DB-based polyplexes) are considered appropriate for translation to preclinical animal studies assessing the delivery of siRNA to tumors or other sites of pathology.

Methods to prepare and characterize the physicochemical properties and bioactivity of neutrally-charged, pH-responsive siRNA nanoparticles are presented. Criteria for successful siRNA nanomedicines such as size, morphology, surface charge, siRNA loading, and gene silencing are discussed.

Préparation de nanoparticules polymériques à charge neutralement et sensibles au pH pour la livraison de siRNA cytosoliques

The success of siRNA as a targeted molecular medicine is dependent upon its efficient cytosolic delivery to cells within the tissue of pathology. Clinical ...