Nombreux sont ceux qui ont contribué à ce travail et la plupart sont de la Caffrey membrane structurale et fonctionnelle groupe de biologie, les deux membres passés et présents. Pour tous, et surtout à Jingquan Tan et Joseph Lyons, nous adressons nos plus vifs remerciements et son appréciation. Ce travail a été financé en partie par des subventions de la Science Foundation Ireland (07/IN.1/B1836), le National Institutes of Health (GM75915, P50GM073210 et U54GM094599), et le 7e PC COST et Actions Marie Curie (CM0902 et PIEF-GA-2009 -235612).

1. Laboratoire Set-up pré-récolte <ol><li> En prévision de la récolte, remplir le sèche mousse Dewar d&#39;azote liquide et le placer à côté du microscope où la récolte doit avoir lieu. </li><li> Immerger la rondelle de stockage, ouvrez finissent, dans l&#39;azote liquide à l&#39;intérieur du Dewar mousse et laissez refroidir complètement. </li><li> Fixer un micro-montage d&#39;une taille qui correspond le cristal à être récoltées sur une baguette magnétique (figure 5). Il est important d&#39;avoir en main un certain nombre de pièces de rechange baguettes magnétiques préchargé avec des micro-supports pour répondre à des situations où il est nécessaire de récolter plusieurs cristaux à partir d&#39;un bolus les. Baguettes de rechange doivent être disponibles en tout temps. </li><li> Placez une micropipette, des conseils et de la solution de précipitant qui a été utilisé pour la croissance cristalline à côté du microscope récolte. Il peut être nécessaire pour couvrir la mésophase et pour éviter le dessèchement lorsque le bien est ouvert. </li><li> Ont un cahier et un stylo sur le banc à proximité et / oul&#39;ordinateur s&#39;ouvre. Ceux-ci seront utilisés pour consigner les observations relatives à la qualité, l&#39;apparence, l&#39;emplacement, le stockage rondelle numéro, etc, de cristaux, ils sont récoltés, cryo-refroidi et placé dans le stockage. </li><li> Si un assistant est disponible pour aider à la récolte de cette personne doit comprendre clairement le protocole qui sera suivi, l&#39;ordre dans lequel les différentes étapes auront lieu, ainsi que leur rôle dans le processus global. </li></ol> Avec tous les matériaux et l&#39;équipement en place notre prochaine tâche consiste à: 2. Identifier les plaques et les puits qui contiennent Cristaux <ol><li> La méthode la plus simple et la plus directe pour trouver des cristaux de exploitables est d&#39;inspecter les puits à la main en utilisant un microscope à la normale et en lumière polarisée croisée. Réglage de l&#39;intensité de la lumière d&#39;éclairage sur le microscope peut aider à localiser les cristaux. </li><li> Alternativement, un imageur où les plaques sont examinées automatiquement à la normale et traversé polarisentd la lumière, peut être utilisé pour rechercher des cristaux. </li><li> Évaluer l&#39;oeil a enregistré des images numériques sur un écran d&#39;ordinateur. </li><li> Marquer clairement les puits avec des cristaux de commentaires de récolte et d&#39;enregistrement sur la taille, la qualité et l&#39;emplacement des cristaux dans la mésophase dans le portable ou sur un ordinateur. </li><li> Retirer la plaque contenant des cristaux pour la récolte de l&#39;imageur. </li></ol> 3. Ouverture d&#39;un bien avec mésophase cube. Méthode 1 Les plaques dans lequel des cristaux croissent dans le procédé méso sont des plaques en sandwich en verre (figure 2). Pour accéder à la mésophase et les cristaux qui s&#39;y trouvent, il est nécessaire d&#39;ouvrir le puits. Ceci est fait en utilisant un outil de coupe pour couper le verre couvre-objet supérieure qui assure l&#39;étanchéité du puits qui peut alors être retiré. Il existe plusieurs approches pour couper et enlever la lamelle de plus d&#39;une cristallisation bien. La méthode à utiliser est dicté par le type of mésophase, dans lequel le cristal se trouve en pleine croissance. Cela peut être la phase très visqueuse et collante cube (figure 3A) ou sa variante plus fluide, la phase éponge (figure 3B). Dans cet article, nous montrons comment la vidéo pour ouvrir des puits et de récolter des cristaux de ces deux matériaux hébergement. <ol><li> Placer la plaque de cristallisation du verre en sandwich sur la scène d&#39;un microscope optique. </li><li> En utilisant un score outil de coupe de verre couvre-objet légèrement avec deux cercles concentriques situés au-dessus de l&#39;entretoise et à l&#39;extérieur du périmètre du puits. Avec un outil de coupe nouvelle, la notation requiert un minimum de pression appliquée. Remplacer l&#39;outil avec un nouveau quand la pression nécessaire au score augmente même très légèrement, ce qui se produit généralement après l&#39;ouverture de 10 puits. </li><li> Briser le verre dans l&#39;espace compris entre les deux cercles marqués dans le but de libérer la lamelle intérieure. Cela génère beaucoup d&#39;éclats de verre et la poussière. Les faire disparaître avec une humidifiéserviette en papier. </li><li> Retirer la lamelle libéré en le saisissant avec une pince à épiler à pointe fine et il pendulaires loin de et hors du puits. Dans ce cas, la phase cubique reste bloqué et mis en place sur la plaque de base du puits. </li><li> Zoomez pour obtenir une vision plus claire de la mésophase cubique qui est maintenant prêt à être utilisé pour la récolte de cristal. </li></ol> 4. Ouverture d&#39;un bien avec mésophase cubique. Méthode 2 <ol><li> Utilisation de la vitre coupe pointage outil lignes droites parallèles à la lamelle d&#39;un côté du puits et qui s&#39;étendent à travers le puits lui-même. Ceci permet de faciliter l&#39;accès à des pinces et l&#39;enlèvement du couvre-objet. </li></ol> Dans cette démonstration, notamment, la lamelle fissures dans la libération de la lamelle sur la surface collante entretoise. Dans le processus, le couvre-objet se déplace dans la position et l&#39;agent de précipitation se sépare de la phase cubique. Lorsque la lamelle est soulevée une partie de la précipitation va avec. Nous nous retrouvons avec un b exposésOlus de mésophase sans aucune précipitation environnante. Immédiatement, ajouter 1 précipitant ul fraîche sur le dessus du bol à l&#39;aide d&#39;une micropipette pour empêcher la mésophase de se dessécher et subissant un changement de phase qui peut endommager les cristaux. Le bolus est maintenant prêt à être utilisé pour la récolte de cristal. 5. Ouverture d&#39;un bien à la phase éponge. Sans succès La phase éponge est moins indulgent pour travailler avec en raison de son aptitude à l&#39;écoulement. Si les résultats que l&#39;écoulement dans la phase éponge en contact du périmètre de la capillarité et se dégager de la mésophase et les cristaux sont perdues. Un exemple de ce qui se passe est montré dans ce clip vidéo. <ol><li> Zoom sur la phase éponge et basculer entre la lumière polarisée normale et croisées pour localiser des cristaux dans la phase éponge. </li><li> En préparation pour l&#39;ouverture du score bien et couper la lamelle comme décrit dans la section 3. Dans le processus, la lamelle fissures. Pour tentertion pour ouvrir le précipitant ainsi les déplacements dans la direction de la fissure et, éventuellement, elle entre en contact avec l&#39;entretoise. Avec le précipitant va une partie de la phase éponge et de sa cargaison de cristaux qui sont perdus. </li></ol> Dans cette séquence particulière, les polariseurs sur le microscope ne sont pas complètement traversé et les cristaux peuvent être considérés comme des objets lumineux en même temps que le puits et son contenu reste visible. 6. Ouverture d&#39;un bien à la phase éponge. Avec succès <ol><li> Zoom sur la phase éponge et d&#39;identifier un cristal à la fois en lumière polarisée normale et croisées. </li><li> Score, couper et enlever une partie de lamelle couvrant le bien, comme dans la section 4.1. Incomplètement traversé la lumière polarisée est utilisé pour garder la trace du cristal. </li><li> Introduire une feuille de papier tissu sec à travers l&#39;ouverture dans le couvre-objet et dans le puits jusqu&#39;à ce qu&#39;il touche la solution de précipitant. Évacuer la solution attentionment jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit presque tous disparu, puis enlever le tissu. Cela provoque la précipitation restante et la phase éponge, avec le cristal toujours en place, à se rétracter sous la lamelle. </li><li> Score, couper et enlever avec une pince à épiler le reste de la lamelle, comme dans la section 4.1. Dans ce cas, la phase éponge divise, certains restent dans le puits et quelques bâtons de la lamelle. Le cristal est dans le bol sur le couvre-objet. Parce qu&#39;il ya très peu présente précipitant, la phase éponge commence à subir une transition de phase probablement dû au dessèchement. Cela peut être considéré comme un cycle de biréfringence qui migre vers le centre du bol. Ajouter immédiatement précipitant pour le bol pour arrêter la transition. Le bolus est maintenant prêt à être utilisé pour la récolte de cristal. </li></ol> 7. La récolte et la Cryo-refroidissement cristaux de la phase cubique <ol><li> Des allers-retours entre la lumière polarisée croisée normale et à localiser les cristaux en bolus dans la phase cubique et ouverte. En tsa séquence vidéo jusqu&#39;à quatre cristaux biréfringents peut être vu dans les bolus phase cubique avec une lumière polarisée croisée. </li><li> Utilisez un. Montée cryo-boucle (figure 5) pour sonder la mésophase fraîchement exposée pour les cristaux, les cristaux de pêcher et de les plonger, contenue dans le cryo-boucle, dans l&#39;azote liquide dans le Dewar immédiatement après la récolte Idéalement, la récolte et le composant logiciel enfichable de refroidissement devrait se faire dans un mouvement continu et rapide. En adhérant à mésophase peu que possible doivent être récoltées avec le cristal. Dans notre expérience, la cryo-protecteur n&#39;est pas nécessaire avec de méso-cultivés cristaux. </li><li> Comme il n&#39;est pas possible de rechercher le cristal dans le cryo-boucle immédiatement après la récolte inspecter le bolus mésophase utilisé pour la récolte de vérifier que le cristal n&#39;est plus là ce qui suggère qu&#39;il a été récoltée avec succès. </li></ol> 8. Cristaux de récolte et de Cryo-refroidissement de la phase éponge <ol><li> Des allers-retours entre la lumière polarisée croisée normale et à localiser les cristaux dans la phase éponge bolus dans le puits ouvert. Dans cette séquence vidéo de nombreux cristaux biréfringents peut être vu dans le bol en lumière polarisée croisée. </li><li> Utiliser un. Montée cryo-boucle (figure 5) pour repêcher les cristaux de la phase éponge et à les plonger, contenus dans ou sur le cryoloop, dans l&#39;azote liquide dans le vase de Dewar immédiatement après la récolte Comme pour la récolte de la phase cubique, dans l&#39;idéal, le processus cryo-refroidissement doit se faire immédiatement le cristal est récolté avec aussi peu de temps que possible écoulé entre l&#39;événement et la récolte réelle immersion dans l&#39;azote liquide. Comme phase éponge adhérant peu que possible doivent être récoltées avec le cristal. Comme indiqué précédemment, cryo-protecteur n&#39;est pas nécessaire avec de méso-cultivés cristaux. </li></ol> 9. Cristaux de stocker dans Dewars <ol><li> Après avoir plongé la boucle montée en liquide niTrogen le placer dans une des fentes de retenue de la rondelle de stockage dans la mousse Dewar. Toutes les manipulations sont effectuées avec la boucle, la partie supérieure de la baguette magnétique et la rondelle immergé dans de l&#39;azote liquide. </li><li> Notez l&#39;emplacement et les détails de l&#39;récolté et cryo-refroidi cristal dans le bloc-notes et / ou sur l&#39;ordinateur. </li><li> Lorsque la rondelle dans le Dewar est rempli de mousse ou de la récolte de la journée est terminée transfert de la rondelle dans un porte-rondelle mis de côté dans un stockage ou d&#39;un transport de Dewar rempli d&#39;azote liquide. Les cristaux peuvent être expédiés dans Dewars transport à l&#39;installation synchrotron pour la diffraction de collecte de données. </li></ol> 10. Les résultats représentatifs Les objectifs des exercices de récolte et de cryo-refroidissement démontré ici sont pour transférer un cristal de la mésophase hébergement en cryo-boucles, pour vitrifier le cristal en forme de boucle et de le placer dans le stockage dans l&#39;azote liquide dans un Dewar. La situation idéale est où la récolte et cryo-refroidissement sont réalisées de telle sorte que la qualité de diffraction du cristal est conservé dans le processus. Comme mésophase peu que possible doivent être récoltées avec le cristal. Ceci est de rendre la localisation du cristal et son centrage dans le faisceau de rayons X beaucoup moins exigeant que, pour accélérer le refroidissement cryogénique en vue de la vitrification, et à réduire les interférences de fond à partir de la dispersion de mésophase de diffraction pendant la collecte de données. Quelques exemples de cryo-refroidis échantillons où le cristal peuvent et ne peuvent pas être vus sont présentés dans la figure 6. Lorsque le cristal ne peut pas être vu par les yeux, il est généralement nécessaire de recourir à tramage de diffraction afin de trouver le cristal et de le centrer dans le faisceau pour la collecte de données 27. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Représentation schématique d&#39;une membrane biologique montrant la bicouche lipidique dans et sur ​​lequel are trouve une variété de protéines. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. A pleine charge et scellé plaque de 96 puits de cristallisation du verre sandwich. Chaque puits contient 50 nl phase cubique et 1 ul de solution de précipitation. Pour plus de clarté, la phase cubique a été coloré avec le rouge Soudan et la solution de précipitant comprend le bleu de méthylène. De la référence 5. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Cristaux de protéines membranaires qui poussent dans la mésophase lipidique. A. La phase cubique avec un cristal de bactériorhodopsine à partir de H. halobium. B. La phase éponge contenant un cristal de la vitamine B12 btuB récepteur / transporteur, de E. coli. De la référence 25. Les phases cubiques et une éponge contrastées appearances est aussi évident en comparant les caches A et B. La phase cubique dans A est extrêmement visqueuse et conserve sa forme originale. Il ne s&#39;écoule pas. Cela est particulièrement évident sur les bords du bol mésophase qui ont une apparence rugueuse. Par contrat, la phase éponge est beaucoup moins visqueux et ne coule. Ainsi, la phase éponge ne parvient pas à conserver sa forme originale et ses bords sont typiquement lisse. Précipitants qui comprennent Jeffamine, le PEG 400, le 2-méthyl-2 ,4-pentanediol, le pentaérythritol propoxylé, le butanediol et l&#39;hexanediol, peut se traduire par une transition de la phase cubique à 4,26 éponge. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. L&#39;organigramme résume les étapes de la production, de récolte et de cryo-refroidissement à méso-cultivés cristaux de protéines membranaires (A). Seules les étapes, entourée par le pointillé rougeligne, et décrit en détail dans (B), sont couverts dans cet article JoVE. Panel A est de la référence 3. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4001/4001fig4large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig5.jpg" alt="Figure 5" /> Figure 5. Un vide cryo-boucle monté sur un axe qui est maintenu en place sur une baguette magnétique. Vues élargies de la broche (A) et de micro-montage (B) de cet important outil pour la récolte et cryo-refroidissement sont affichés. La boucle vide à la fin de la micro-montage en B est de 30 pm de diamètre. Bien que n&#39;ayant pas testé d&#39;autres types de boucles largement, nous constatons que la MiTeGen boucles travail montre bien à la fois les phases cubique et une éponge. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig6.jpg" alt="Figure 6" /> Cristaux Figure 6. Récoltés et cryo-refroidi de protéines membranaires en cryo-boucles tel que vu avec un microscope en ligne sur une ligne de lumière synchrotron. A, B,. Exemples de cristaux récoltés (Caa3 la cytochrome oxydase 34 (A), diacylglycérol kinase, DgkA (B)), où les cristaux (flèche bleue) sont visibles à travers la mésophase cryo-refroidi sur un exemple cryo-boucle. C. récoltées, où le cristal n&#39;est pas visible dans la mésophase cryo-refroidi sur un cryo-boucle. L&#39;extrémité de la boucle est identifiée par une flèche rouge. Faire adhérer la cryo-refroidissement mésophase est identifiée par une flèche bleue.

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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+an+irreversible+agonist-beta(2)+adrenoceptor+complex.">Structure and function of an irreversible agonist-beta(2) adrenoceptor complex.</a> Nature. 469, 236-240 (2011).</li><li>Shimamura, T., Shiroishi, M., Weyand, S., Tsujimoto, H., Winter, G., Katritch, V., Abagyan, R., Cherezov, V., Liu, W., Han, G. W., Kobayashi, T., Setvens, R. C., Iwata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+histamine+H1+receptor+complex+with+doxepin.">Structure of the human histamine H1 receptor complex with doxepin.</a> Nature. 475, 65-70 (2011).</li><li>Thompson, A. A., Liu, W., Chun, E., Katritch, V., We, H., Vardy, E., Huang, X. P., Trapella, C., Guerrini, R., Calo, G., Roth, B. L., Cherezov, V., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+nociceptin/orphanin+FQ+receptor+in+complex+with+a+peptide+mimetic.">Structure of the nociceptin/orphanin FQ receptor in complex with a peptide mimetic.</a> Nature. 485, 395-399 (2012).</li><li>Wu, B., Chien, E. Y., Mol, C. D., Fenalti, G., Liu, W., Katritch, V., Abagyan, R., Brooun, A., Wells, P., Bi, F. C., Hamel, D. J., Kuhn, P., Handel, T. M., Cherezov, V., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+the+CXCR4+Chemokine+GPCR+with+Small-Molecule+and+Cyclic+Peptide+Antagonists.">Structures of the CXCR4 Chemokine GPCR with Small-Molecule and Cyclic Peptide Antagonists.</a> Science. 330, 1066-1071 (2010).</li><li>Wu, H., Wacker, D., Mileni, M., Katritch, V., Han, G. W., Vardy, E., Liu, W., Thompson, A. A., Huang, X. P., Carroll, F. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+kappa-opioid+receptor+in+complex+with+JDTic.">Structure of the human kappa-opioid receptor in complex with JDTic.</a> Nature. 485, 327-332 (2012).</li><li>Cherezov, V., Abola, E., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+the+structure+determination+of+GPCRs,+a+membrane+protein+family+with+high+potential+as+pharmaceutical+targets.">Recent progress in the structure determination of GPCRs, a membrane protein family with high potential as pharmaceutical targets.</a> Methods Mol. Biol. 654, 141-168 (2010).</li><li>Liu, W., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases.">Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-volume+plates+with+excellent+optical+properties+for+fast,+inexpensive+crystallization+screening+of+membrane+proteins.">Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins.</a> J. Appl. Cryst. 36, 1372-1377 (2003).</li><li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picolitre-scale+crystallization+of+membrane+proteins.">Picolitre-scale crystallization of membrane proteins.</a> J. Appl. Cryst. 39, 604-606 (2006).</li><li>W&#246;hri, A. B., Johansson, L. C., Wadsten-Hindrichsen, P., Wahlgren, W. Y., Fischer, G., Horsefield, R., Katona, G., Nyblom, M., Oberg, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Lipidic-Sponge+Phase+Screen+for+Membrane+Protein+Crystallization.">A Lipidic-Sponge Phase Screen for Membrane Protein Crystallization.</a> Structure. 16, 1003-1009 (2008).</li><li>Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rastering+strategy+for+screening+and+centring+of+microcrystal+samples+of+human+membrane+proteins+with+a+sub-10+microm+size+X-ray+synchrotron.">Rastering strategy for screening and centring of microcrystal samples of human membrane proteins with a sub-10 microm size X-ray synchrotron.</a> 6, 587-597 (2009).</li><li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lipid's+eye+view+of+membrane+protein+crystallization+in+mesophases.">A lipid's eye view of membrane protein crystallization in mesophases.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 10, 486-497 (2000).</li><li>Briggs, J., Chung, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+temperature-composition+phase+diagram+and+mesophase+structure+characterization+of+the+monoolein/water+system.">The temperature-composition phase diagram and mesophase structure characterization of the monoolein/water system.</a> J. Phys. Ii. 6, 723-751 (1996).</li><li>Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phase+diagram+of+the+monoolein/water+system:+metastability+and+equilibrium+aspects.">The phase diagram of the monoolein/water system: metastability and equilibrium aspects.</a> Biomaterials. 21, 223-234 (2000).</li><li>Misquitta, Y., Cherezov, V., Havas, F., Patterson, S., Mohan, J. M., Wells, A. J., Hart, D. J., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+lipid+for+membrane+protein+crystallization.">Rational design of lipid for membrane protein crystallization.</a> J. Struct. Biol. 148, 169-175 (2004).</li><li>Caffrey, M., Porter, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallizing+Membrane+Proteins+for+Structure+Determination+using+Lipidic+Mesophases.">Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases.</a> J. Vis. Exp. , e1712 (2010).</li><li>Li, D., Boland, C., Walsh, K., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+robot+for+high-throughput+crystallization+of+membrane+proteins+in+lipidic+mesophase.">Use of a robot for high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophase.</a> J. Vis. Exp. , e4000 (2012).</li><li>Lyons, J. A., Aragao, D., Slattery, O., Pisliakov, A. V., Soulimane, T., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+insights+into+electron+transfer+in+caa(3)-type+cytochrome+oxidase.">Structure insights into electron transfer in caa(3)-type cytochrome oxidase.</a> Nature. 10, (2012).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Dans cet article, nous avons montré comment la vidéo cristaux cultivés dans une mésophase lipidique sont récoltées et cryo-refroidi en préparation pour une utilisation dans la collecte des données de diffraction et en fin de compte pour la détermination de la structure. La mésophase hébergement peut être la phase visqueuse et collante cubique ou la phase éponge plus fluide 4. Comment les plaques sandwich de verre sont ouverts et la façon dont les cristaux sont récoltés dépend beaucoup du type de mésophase. Il est donc important de savoir qui de l&#39;un deux a affaire à l&#39;avance. L&#39;identité de l&#39;hébergement des lipides et le précipitant utilisé est importante à cet égard, et l&#39;apparence physique des bolus mésophase dans la cristallisation et peut être utilisée pour les distinguer (figure 3). La récolte de ces deux types de mésophase a été illustrée dans cet article. La récolte de petits cristaux d&#39;une mésophase lipidique dans les plaques sandwich de verre est un processus laborieux qui nécessite du temps, des compétences, expertiseience, de la patience et une main ferme. Il est important de mettre de côté une quantité appropriée de temps pour la récolte et de mettre en place le laboratoire de sorte que toutes les fournitures et les équipements sont à portée de main à l&#39;avance. Une deuxième personne pour aider à la récolte n&#39;est pas indispensable mais est recommandée. Cette personne peut vous aider à fournir des plaques pré-marqués à l&#39;individu de faire la récolte ainsi que de placer cryo-refroidis boucles montées avec des cristaux récoltés dans la rondelle de stockage. L&#39;assistant peut également jouer un rôle de soutien important dans la documentation des observations sur les cristaux faites au cours de la récolte qui pourrait s&#39;avérer crucial lors de la collecte des données de diffraction. En l&#39;absence d&#39;une assistante, commande vocale enregistrement audio dispositif pourrait être mis à profit pour la documentation. En suivant le protocole décrit dans cet article vous aidera à faire la visionneuse lever et courir avec la récolte de cristal. Cependant, il est important de comprendre que le processus n&#39;est pas simple et que practice est nécessaire avant de se lancer dans la récolte de précieux cristaux de protéines membranaires. Il est donc recommandé que les plaques d&#39;essai avec des cristaux de protéines qui ne sont pas particulièrement utiles être expérimenté en premier lieu. Ce sera le néophyte avec une expérience précieuse dans la découpe du verre, l&#39;élimination des tessons de verre, en soulevant le couvre-objet à partir de plus de la mésophase, en utilisant la caractéristique de polarisation sur le microscope pour voir les cristaux et de les suivre au cours de la récolte, et enfin traiter les différents types de mésophases et la récolte de leur part. La texture de la mésophase, et par extension de la facilité avec laquelle les cristaux peuvent être récoltés, qui change avec le temps pendant la cristallisation. Il est donc important de pratiquer la récolte de cristaux de moindre valeur, mais avec ceux qui ont grandi dans les mêmes conditions que celles de plus grande valeur. Il est possible de faire croître des cristaux de lysozyme et la thaumatine par le méso ou en phase cubique lipidique méthode 28 et ceux-ci devraient être consiEred par voie de se familiariser avec les matériaux et la méthode. On devrait aussi envisager de travailler avec des protéines sans mésophase premier à apprendre de ses caprices. Les procédures démontré ici ont toutes été faites à un niveau confortable de 20 ° C environ. Il est possible de faire croître des cristaux par la méthode de méso à des températures plus basses. Ainsi, monooléine que le lipide hébergement dans un état ​​de phase métastable peut être utilisée à 4 ° C 1,2,29,30. Une alternative est d&#39;utiliser la conception rationnelle 7.9 MAG pour la cristallisation à basse température 31. Nous faisons crysallogenesis basse température couramment avec certains objectifs de protéines membranaires. Dans ce cas, la croissance des cristaux et la récolte se fait de plain-pied réfrigérateur à 4 ° C. Travailler dans de telles conditions a ses propres défis non la moindre, est la nécessité pour les vêtements chauds et confortables. La prochaine étape dans le processus global de détermination de la structure à l&#39;aide crys macromoléculairestallography est de recueillir des données de diffraction sur des cristaux récoltés et composant logiciel enfichable refroidi comme l&#39;a démontré dans cet article. Dans méso-adulte cristaux sont généralement de petite taille. Toutefois, la collecte de données utiles de diffraction a été possible avec des cristaux ayant une dimension maximale de 20 um 9. A cet effet, les micro-faisceau synchrotron de rayons X est utilisé et fait l&#39;objet d&#39;un article séparé JoVE dans cette série 32,33.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Composants </td></tr><tr><td> Pinces courbes </td><td> Sigma </td><td> F4142 </td><td> Outil </td></tr><tr><td> Embouts de pipette jetables </td><td> Gilson </td><td> Divers </td><td> Jetable </td></tr><tr><td> Mousse Dewar </td><td> Spearlab </td><td> FD-500 </td><td> Outil </td></tr><tr><td> Conteneurs de déchets de verre et de métal </td><td> Daniels soins de santé </td><td> DD479OL </td><td> Outil </td></tr><tr><td> Boucles de récolte </td><td> MiTeGen </td><td> Divers </td><td> Outil </td></tr><tr><td> La récolte microscope </td><td> Nikon </td><td> SMZ1500 </td><td> Outil </td></tr><tr><td> Cahier de laboratoire </td><td> Divers </td><td> NA </td><td> Outil </td></tr><tr><td> Poussoir magnétiquebaguette de chargement bouton échantillon </td><td> Hampton Research / dimensions moléculaires </td><td> HR4-729/MD7-411 </td><td> Outil </td></tr><tr><td> Puck originale (pour une utilisation avec la SLA de type robots uniquement) </td><td> Systèmes de positionnement en cristal </td><td> CP-111-035 </td><td> Outil </td></tr><tr><td> Dispositifs de pipetage </td><td> Gilson </td><td> Divers </td><td> Outil </td></tr><tr><td> Solutions précipitants </td><td> Divers </td><td> Divers </td><td> Réactif </td></tr><tr><td> Puck Bent Cryo-Tong </td><td> Systèmes de positionnement en cristal </td><td> CP-111-030 </td><td> Outil </td></tr><tr><td> Cane Puck Livraison Mise à l&#39;écart (SLA originales de style) avec poignée crochet et tige de verrouillage </td><td> Systèmes de positionnement en cristal </td><td> CP-111-029 </td><td> Outil </td></tr><tr><td> L&#39;eau purifiée </td><td> Millipore </td><td></td><td> Réactif </td></tr><tr><td> Lunettes de sécurité </td><td&gt; Divers </td><td> NA </td><td> Outil </td></tr><tr><td> Bases Pin exemples - magnétique (sans cuivre) </td><td> Systèmes de positionnement en cristal </td><td> CP-111-015 </td><td> Outil </td></tr><tr><td> Livraison Dewar </td><td> Taylor-Wharton </td><td> CX100 </td><td> Outil </td></tr><tr><td> Tissus </td><td> NA </td><td> NA </td><td> Jetable </td></tr><tr><td> Carbure de tungstène coupe-verre (Pointe à tracer carbure) </td><td> Outils Silverline (Yeovil, Royaume-Uni) </td><td> 633657 </td><td> Outil </td></tr></tbody></table>

harvesting and cryo-cooling crystals of membrane proteins grown in lipidic mesophases for structure determination by macromolecular crystallography

Une voie importante pour comprendre comment les protéines fonctionnent à un niveau mécanistique, c&#39;est d&#39;avoir la structure de la protéine cible disponible, idéalement avec une résolution atomique. Actuellement, il n&#39;existe qu&#39;une seule façon de recueillir de l&#39;information telle qu&#39;appliquée à des protéines membranaires intégrales (Figure 1), et les complexes qu&#39;ils forment, et que cette méthode est macromoléculaire cristallographie aux rayons X (MX). Pour ce faire cristaux MX qualité de diffraction sont nécessaires qui, dans le cas des protéines membranaires, ne forment pas facilement. Une méthode de cristallisation de protéines membranaires qui implique l&#39;utilisation de mésophases lipidiques, en particulier les phases cubiques et éponge 1-5, a gagné une attention considérable en raison de la fin des succès qu&#39;il a eu dans le domaine G du récepteur couplé aux protéines 21.06 ( <a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www . mpdb.tcd.ie</a> ). Cependant, la méthode, ci-après dénommé le méso ou dans lipidique méthode de phase cubique, est livré avec son propre techniquedéfis. Celles-ci proviennent, en partie, en raison de la nature généralement visqueuse et collante de la mésophase lipidique dans laquelle les cristaux, qui sont souvent des micro-cristaux, grandir. Manipulation des cristaux devient difficile en raison, en particulier pendant la récolte afin 22,23. Des problèmes se posent aussi à l&#39;étape qui précède la récolte, qui exige que les plaques sandwich de verre dans laquelle les cristaux se développent (figure 2) 24,25 sont ouvertes pour exposer le bolus mésophase, et les cristaux y sont, pour la récolte, cryo-refroidissement et X éventuels diffraction des rayons collecte de données. Les variantes mésophases cubiques et une éponge (figure 3) à partir de laquelle les cristaux doivent être récoltés ont profondément différentes rhéologies 4,26. La phase cubique est visqueuse et collante semblable à une pâte dentifrice d&#39;épaisseur. En revanche, la phase éponge est plus fluide avec une nette tendance à couler. En conséquence, les différentes approches pour l&#39;ouverture de cristallisation puits containing cristaux poussent dans le cube et la phase éponge sont appelés pour aussi bien des méthodes différentes sont nécessaires pour la récolte des cristaux à partir des deux types de mésophase. Protocoles pour faire juste cela ont été affinés et mis en œuvre dans la membrane Biologie Structurale et Fonctionnelle (MS &amp; FB), et sont décrits en détail dans cet article JoVE (figure 4). Des exemples sont donnés de situations où les cristaux sont récoltés avec succès et cryo-refroidi. Nous fournissons également des exemples de cas où des problèmes se posent qui conduisent à la perte irrémédiable de cristaux et de décrire la façon dont ces problèmes peuvent être évités. Dans cet article, le Viewer est fourni avec étape par étape les instructions pour l&#39;ouverture de puits de verre en sandwich de cristallisation, pour la récolte et pour cryo-refroidissement des cristaux de protéines membranaires qui poussent dans des phases cubique et d&#39;éponges.

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Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

Ici est décrit procédures mises en place dans la membrane Caffrey structurale et fonctionnelle du Groupe Biologie des cristaux de récolte et de cryo-cool protéines membranaires lipidiques cultivés dans des phases cubiques et une éponge pour une utilisation dans la détermination de la structure macromoléculaire à l&#39;aide cristallographie aux rayons X.

Cristaux de récolte et de Cryo-refroidissement de protéines membranaires cultivées dans des mésophases lipidiques pour la détermination de la structure par cristallographie macromoléculaire

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

harvesting-cryo-cooling-crystals-membrane-proteins-grown-lipidic

Research

JoVE Journal

Biology

24.7K vues.  Trinity College Dublin. Ici est décrit procédures mises en place dans la membrane Caffrey structurale et fonctionnelle du Groupe Biologie des cristaux de récolte et de cryo-cool protéines membranaires lipidiques cultivés dans des phases cubiques et une éponge pour une utilisation dans la détermination de la structure macromoléculaire à l'aide cristallographie aux rayons X.

Vidéo: Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

Cristallisant protéines membranaires pour déterminer la structure à l&#39;aide mésophases lipidique

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Recherche

Biologie

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

L&#39;importance de la concentration de protéines correct pour Cinétique et Détermination d&#39;affinité en analyse structure-fonction

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray crystallography to study structure-function questions of membrane proteins, as well as soluble proteins. Screening for two-dimensional (2D) crystals by transmission electron microscopy (EM) is the critical step in finding, optimizing, and selecting samples for high-resolution data collection by cryo-EM. Here we describe the fundamental steps in identifying both large and ordered, as well as small 2D arrays, that can potentially supply critical information for optimization of crystallization conditions.
By working with different magnifications at the EM, data on a range of critical parameters is obtained. Lower magnification supplies valuable data on the morphology and membrane size. At higher magnifications, possible order and 2D crystal dimensions are determined. In this context, it is described how CCD cameras and online-Fourier Transforms are used at higher magnifications to assess proteoliposomes for order and size.
While 2D crystals of membrane proteins are most commonly grown by reconstitution by dialysis, the screening technique is equally applicable for crystals produced with the help of monolayers, native 2D crystals, and ordered arrays of soluble proteins. In addition, the methods described here are applicable to the screening for 2D crystals of even smaller as well as larger membrane proteins, where smaller proteins require the same amount of care in identification as our examples and the lattice of larger proteins might be more easily identifiable at earlier stages of the screening.

Evaluating two-dimensional (2D) crystallization trials for the formation of ordered membrane protein arrays is a highly critical and difficult task in electron crystallography. Here we describe our approach in screening for and identifying 2D crystals of predominantly small membrane proteins in the range of 15 &#x2013; 90kDa.

L&#39;évaluation des essais de cristallisation bidimensionnelle de protéines membranaires petites pour les études en biologie structurale par cristallographie électronique

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

La cristallisation des protéines membranaires dans des mésophases lipidique

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

Haut débit cristallisation des protéines membranaires en utilisant la méthode lipidique Bicelle

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

Utilisation d&#39;un robot pour haut-débit cristallisation des protéines membranaires dans des mésophases lipidiques

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

Microscopie intravitale pour l&#39;imagerie Subcellular ouvrages chez des souris vivantes exprimant des protéines fluorescentes

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and pathophysiology. This protocol describes a technique where mitochondria isolated from rodent tissue are immunolabeled and analyzed by flow cytometry. Mitochondria are isolated from rodent spinal cords and subjected to a rapid enrichment step so as to remove myelin, a major contaminant of mitochondrial fractions prepared from nervous tissue. Isolated mitochondria are then labeled with an antibody of choice and a fluorescently conjugated secondary antibody. Analysis by flow cytometry verifies the relative purity of mitochondrial preparations by staining with a mitochondrial specific dye, followed by detection and quantification of immunolabeled protein. This technique is rapid, quantifiable and high-throughput, allowing for the analysis of hundreds of thousands of mitochondria per sample. It is applicable to assess novel proteins at the mitochondrial surface under normal physiological conditions as well as the proteins that may become mislocalized to this organelle during pathology. Importantly, this method can be coupled to fluorescent indicator dyes to report on certain activities of mitochondrial subpopulations and is feasible for mitochondria from the central nervous system (brain and spinal cord) as well as liver.

Described here is a method to detect and quantify mitochondrial outer membrane proteins by immunolabeling of mitochondria isolated from rodent tissue and analysis by flow cytometry. This method can be extended to assess functional aspects of mitochondrial subpopulations.

Immunodétection de la membrane externe de protéines par cytométrie en flux de mitochondries isolées

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein base Expression dépistage des protéines membranaires dans<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.