Les auteurs tiennent à remercier le soutien financier apporté par la Fondation allemande pour la recherche (DFG) par l&#39;intermédiaire du centre de recherche en collaboration SFB 578 &quot;Du gène au produit&quot; à la Technische Universität Braunschweig, en Allemagne.

1. Configuration du réacteur et de démarrage de la culture du 4 cultures bioréacteurs au total sont effectuées. <ol><li> Utilisation d&#39;un bioréacteur 3 L réservoir agité avec un volume de travail de 2,2 L à la culture de A. Niger SKAn1015. </li><li> Verser 72,6 g de glucose monohydraté dans le réacteur et le remplir avec 1,9 L d&#39;eau déminéralisée. </li><li> Installez l&#39;équipement réacteur tel que 3 chicanes, deux à six pales turbine de disque, une électrode de pH, une entrée de gaz avec filtre à air, un doigt de refroidissement, un refroidisseur d&#39;air d&#39;échappement avec filtre à air, un tube plongeur pour l&#39;échantillonnage stérile avec filtre à air les tuyaux d&#39;arrivée et de support, l&#39;inoculum, l&#39;acide et la base. </li><li> Autoclaver le réacteur à 121 ° C pendant 20 min. </li><li> Connecter le réacteur avec le réservoir d&#39;acide-base (2 M de HCl, 2 M de NaOH) et les pompes correspondantes et mettre en place une valeur de pH de 5,0 ± 0,05 avec l&#39;unité de contrôle du pH. </li><li> Relier le réacteur avec le système de refroidissement à eau et mis l&#39;enveloppe chauffanteautour de la cuve du réacteur. </li><li> Installez le capteur de température avec l&#39;unité de commande correspondant et mettre en place une température de 37 ± 0,1 ° C à l&#39;unité de contrôle de température. </li><li> Appliquer le moteur d&#39;agitation au-dessus du réacteur et la mettre en service avec une vitesse d&#39;agitation de 200 min -1. </li><li> Ajouter le milieu stérile minimale croissance de 11 creux l&#39;un des tuyaux d&#39;arrivée d&#39;stériles (250 ml). Pour la préparation de tous les composants ont été moyennes en autoclave à 121 ° C pendant 20 min et mélangés. Pour trois cultures les composants comprennent le talc en poudre (3MgO • 2 • 4SiO H 2 O) dans les concentrations de 1 g / L (réacteur 2), 3 g / L (réacteur 3) et 10 g / L (réacteur 4). Avant d&#39;utiliser, de remettre en suspension les micro-particules dans 50 mM de tampon acétate de sodium (pH 6,5) et l&#39;ajouter dans le milieu stérile. Dans les cultures de contrôle (sans particules) remplacer la suspension de particules micro de 50 mM de tampon acétate de sodium (pH 6,5). </li><li> Ajouter la suspension de spores (inoculum) uns établi en Wucherpfennig et. Al (2011) 11 auge un des tuyaux d&#39;entrée stérile (50 ml) de sorte que la concentration de montants spores à 1X10 6 ml -1. L&#39;inoculation marque le début de la culture (h = 0 h). </li><li> Début de l&#39;aération avec un taux de 1,0 L -1 min. </li></ol> 2. D&#39;échantillonnage stériles après 24, 48 et 72 h de culture <ol><li> Prendre 50 ml de bouillon de culture stérile dans un tube flacon. </li><li> Utilisez l&#39;échantillon pour la détermination du poids de la biomasse sèche, β-fructofuranosidase activité et l&#39;analyse microscopique. </li></ol> 3. Détermination du poids de la biomasse sèche après 24, 48 et 72 h de culture <ol><li> Échantillons de biomasse sont à prendre au moins en double. </li><li> Un filtre en poids de cellulose avec une balance micro après séchage dans un dessiccateur et placer le filtre dans un entonnoir de Büchner avec pompe à vide connectée à jet d&#39;eau. </li><li> Filtrer un volume d&#39;échantillon défini (par exemple 10 ml) d&#39;unee rincer le filtre avec de l&#39;eau déminéralisée 10 ml pour éliminer les composés moyen de la biomasse. </li><li> Rides du filtre une fois dans le milieu, le placer dans un plat en verre de Petri et le mettre dans un sèche-compartiment jusqu&#39;à constance de poids (au moins 24 h). </li><li> Refroidir le filtre dans un dessiccateur et de mesurer le poids. </li><li> Calculer le poids sec de la biomasse à la différence entre le poids du filtre avec et sans biomasse séchée divisé par le volume d&#39;échantillon utilisé. </li></ol> 4. Détermination de l&#39;activité enzymatique extracellulaire des β-fructofuranosidase par DIEU / POD-essai après 24, 48 et 72 h de culture Conserver les échantillons sur glace en permanence tout en travaillant avec eux. <ol><li> Filtre 1,5 ml suspension de culture auge un acétate de cellulose filtre en appuyant sur la suspension de la culture avec une seringue à travers le filtre dans un tube de réaction. Stocker le tube de réaction à -20 ° C jusqu&#39;à son utilisation. </li><li> Pour le mélange réactionnel utiliser 20échantillon et ajouter 200 ul ul de 1,65 M de saccharose dissous dans du tampon phosphate 0,05 M (pH 5,4) pour initier la réaction à partir du saccharose en glucose. Cary la réaction au moins en double. </li><li> Incuber le mélange réactionnel à 40 ° C pendant 20 min dans un bloc de chauffage. Arrêter la réaction par incubation à 95 ° C pendant 10 min dans un bloc de chauffage. Refroidir le mélange réactionnel en le stockant sur la glace et centrifuger l&#39;eau condensée par centrifugation à 13.000 g pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Afin de tenir compte du pH et le clivage dépendant de la température de saccharose en glucose, mener à bien une valeur vide à l&#39;aide d&#39;eau de 20 uL désionisée au lieu de 20 uL d&#39;échantillon. </li><li> Pour tenir compte de glucose résiduel dans le bouillon de culture, effectuer un contrôle négatif pour chaque échantillon. Pour que l&#39;utilisation finale 20 ul de l&#39;échantillon et inactiver β-fructofuranosidase par chauffage à 95 ° C pendant 10 min avant d&#39;ajouter du saccharose et incuber comme décrit dans l&#39;étape 4.3. </li><li> Diluer les échantillons tels que les mesu suivantesURED d&#39;adsorption est dans la plage de valeurs calibrées. </li><li> Effectuer tous les dosages enzymatiques, en trois exemplaires. Appliquer un échantillon de 2 ul dilué dans une plaque de titrage micro bien. Appliquer une gamme standard de calibrage sur la plaque de titrage par chaque micro utilisant 2 pi de dix solutions de glucose avec des concentrations dix découvrir différentes (de 1 mM à 15 mM) à la place de deux échantillons pL. Pour réglage du point zéro utiliser 2 pi d&#39;eau déminéralisée au lieu de 2 ul d&#39;échantillon. </li><li> Ajouter 200 ul de la solution de réactif dans chaque puits en utilisant une pipette multi. </li><li> Incuber le mélange pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Rangez la plaque de titrage micro à 6 ° C jusqu&#39;à ce que la mesure (quelques heures tout au plus). </li><li> Mesurer l&#39;absorption à 450 nm en utilisant un lecteur de 96 puits Sunrise plaque micro et le logiciel de récupération de données Magellan. Réglez le temps de mélange à 5 sec. et la période de repos jusqu&#39;à 1 sec. </li><li> Ouvrir le tableau de résultat avec une feuille de calcul et de construire une courbe d&#39;étalonnage en utilisant la gamme standard: glucose concentration = a + b X d&#39;absorption </li><li> Calculer l&#39;activité: = activité (absorption X facteur de dilution-valeur vide) X a + b </li><li> Figure de l&#39;activité β-fructofuranosidase en calculant la différence entre les activités de l&#39;échantillon et le contrôle négative appropriée. </li><li> Calculer la productivité spécifique pour l&#39;utilisation suivante, en tenant compte du poids de la biomasse sèche et β-fructofuranosidase activité 11. </li></ol> 5. Microscopie et analyse d&#39;images automatisé après 72 h de culture <ol><li> Lieu d&#39;environ 3 ml de suspension de la culture dans un plat de Petri en plastique etles diluer avec une solution de chlorure de sodium physiologique jusqu&#39;à ce que les structures morphologiques sont séparés. </li><li> Situer la boîte de Petri sous un microscope, qui dispose d&#39;un appareil photo intégré ou connecté. Acquérir et économiser environ 100 images (Figure 2) des structures morphologiques par échantillon. Veillez à ce que sur chaque image au moins un objet est complètement représenté. </li><li> Ouvrez toutes les images d&#39;un même échantillon avec le programme de traitement d&#39;image ImageJ 12. Convertir des images en noir et blanc en utilisant l&#39;outil de processus &quot;Faire binaire&quot; (Figure 2). Pour l&#39;application de la commande à toute la série d&#39;images d&#39;utiliser un code de macro comme suit. exécuter (,, Faire binaire &quot;) </li><li> Ouvrez les images binaires transformés avec ImageJ nouveau. Calculer le diamètre de la forme facteurs Féret, surface projetée, le périmètre, la circularité, ratio d&#39;aspect, la solidité und rondeur pour chaque image avec la &quot;mesure Set&quot; outil d&#39;analyse. Pour l&#39;application de la commande à un Series d&#39;images utiliser un code de macro comme suit. run (&quot;8-bit&quot;); exécuter («Faire binaire&quot;); run (&quot;Scale Set ...&quot;, &quot;distance = X connue = 1000 pixel = 1 unité = um mondiale&quot;); exécuter («Mesures Set ...», «limite d&#39;affichage de zone de forme périmètre Féret rediriger décimal = Aucun = 3&quot;); exécuter («analyser les particules ...&quot;, &quot;size = 10000-Infinity circularité = 0,00 à 1,00 show = Décrit affichage&quot;); Déterminer que X le nombre de pixels qui est corrélée à 1000 um, en construisant une ligne droite à travers une barre d&#39;échelle. Corréler le nombre de pixels de la ligne droite avec la longueur de la barre d&#39;échelle dans um. </li><li> Ouvrez le tableau résultat contient des valeurs de facteur de forme pour chaque image avec une feuille de calcul. Calculer un certain nombre Morphologie comme suit pour chaque image. <img alt="L&#39;équation 1" src="/files/ftp_upload/4023/4023eq1.jpg" /></li><li> Calculer la valeur moyenne et écart-type pour le nombre Morphologie tenant compte de toutes les images d&#39;un échantillon. </li&gt; <li> Utilisez un graphique et d&#39;analyse de données pour la corrélation graphique du nombre Morphologie avec la productivité spécifique et de déterminer la relation mathématique par régression mathématique. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs Grâce à plus de talc micro particules A. Niger SKAN 1015 morphologie est changé d&#39;une morphologie vraie culot à une morphologie dispersée ou même du mycélium. Alors que la morphologie culot est exposé à des conditions normales une morphologie du mycélium est créé par la supplémentation du milieu avec 10 g / L de micro-particules de talc (Figure 4.). Parallèlement l&#39;activité de β-fructofuranosidase augmente autour de 3-5 mars fois. Un supplément de 1 ou 3 g / l de poudre de talc conduit à une morphologie dispersée, ayant une activité fructofurannosidase doublé (figure 4.). La morphologie des particules micro dépendante peut être décrite de manière exhaustive par le Morphologie nombre qui peut être calculé en utilisant les paramètres déterminés par analyse d&#39;image automatique. Granules parfaitement rondes et lisses seront en images microscopiques apparaissent comme des cercles parfaits. Pour de telles particules de morphologie le nombre a une valeur de 1. Le plus petit fragment de la morphologie du mycélium peut être simplifiée comme une ligne unidimensionnelle pour obtenir un nombre de 0 Morphologie. Toutes les formes intermédiaires morphologiques comme boulettes allongées ou irrégulières bouquets aura donc des valeurs comprises entre 0 et 1. Particules relativement grandes se traduira par un niveau élevé, particules fongiques avec une grande surface ou particules allongées, dans un certain nombre Morphologie plutôt faible 11. Dans des conditions standard de la morphologie dans le réacteur 1 présente un certain nombre Morphologie autour de 0,8. La morphologie dans le réacteur 4 avec 10 g de poudre / L talc dispose d&#39;un Mn d&#39;environ 0,1. Le nombre Morphologie pour les réacteurs 2 et 3, avec des concentrations de poudre de talc 1 et 3 g / L, se situe entre ces deux extrêmes, la démonstration d&#39;une dispersion morphologie. Depuis la morphologie des particules micro dépendante est étroitement liée à la productivité β-fructofuranosidase, une corrélation mathématique du nombre Morphologie et la productivité similaire à la figure 5 est obtenu. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4023/4023fig1.jpg" /> Figure 1. D&#39;ensemble de la conception expérimentale et de la procédure analytique. A. Niger est cultivée (avec ou sans micro-particules) dans un bioréacteur agité de 3 L du réservoir pendant 72 h. Après 24, 48 et 72 ha d&#39;échantillon est prélevé pour la détermination du poids de la biomasse sèche et β-fructofuranosidase activité, qui sont à nouveau utilisés pour le calcul de la productivité spécifique. Après 48 h la morphologie fongique est examiné au microscope et caractérisé par analyse d&#39;image numérique. Les paramètres pertinents de l&#39;analyse d&#39;image sont combinés à un certain nombre de morphologie, qui est corrélée avec l&#39;mathématique productivité spécifique. <imgalt = &quot;Figure 2&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/4023/4023fig2.jpg&quot; /&gt; Figure 2. Étapes de traitement d&#39;image pour microscopique des images générées par des structures morphologiques de A. Niger. Etape 1: acquisition de l&#39;image au microscope. Étape 2: amélioration de l&#39;image si nécessaire. Étape 3: binarisation d&#39;image, en noir et blanc (binaire) image générée dans ImageJ. Étape 4: l&#39;image binaire est traitée par et objet indésirable sont effacés. Étape 5: analyse morphologique est effectuée avec le &quot;Analyser particules&quot; en fonction de la source de programme ouvert ImageJ. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/4023/4023fig3.jpg" /> Figure 3. Différentes formes morphologiques de A. dépend de la concentration de micro-particules ajoutée Niger. Avec une concentration croissante de micro-particules de la taille ajouté à granulés peut être précisément diminué jusqu&#39;à de petites boulettes de core-shell, des troupeaux de petits et le mycélium même librement dispersé. Morphologie de l&#39;ingénierie Commepergillus Niger SKAn1015 par la supplémentation en micro-particules en culture submergée. Sans microparticules (A), 10 mg / L (B), 0,1 g / L (C), 0,2 g / L (D), 0,3 g / L (E), 0,6 g / L (F), 1,0 g / L (G), 1,5 g / L (H), 2,0 g / L (I), 2,5 g / L (J), 3,0 g / L (K), 3,5 g / L (L), 4,0 g / L (M ), 4,5 g / L (N), 5,0 g / L (O), 10 g / l (p), 15 g / L (Q), 20 g / L (R), 30 g / L (S) et 40-50 g / L (T). Les images ont été prises en microscopie optique après 72 h de culture. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/4023/4023fig4.jpg" /> Figure 4. Activité FRUCTOFURANOSIDASE en fonction de talc micro particules concentration de 1 g / L (réacteur 2), 3 g / L (réacteur 3) et 10 g / L (réacteur 4). Le réacteur 1 n&#39;est pas complétée par les micro-particules, ici la culture est réalisée dans des conditions standard. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/4023/4023fig5.jpg" /> Figure 5. Représentant une bonne corrélation (R 2 = 0,91) de la morphologienombre et la productivité spécifique. Le nombre Morphologie est tracée (en abscisse) contre la productivité spécifique (en ordonnée). La régression non linéaire donne la corrélation exponentielle.

<ol>
	<li>Wucherpfennig, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advances in Applied Microbiology. 72, 89-136 (2010).</li><li>Driouch, H., H&#228;nsch, R., Wucherpfennig, T., Krull, R., Wittmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+enzyme+production+by+bio-pellets+of+Aspergillus+niger:+Targeted+morphology+engineering+using+titanate+microparticles.">Improved enzyme production by bio-pellets of Aspergillus niger: Targeted morphology engineering using titanate microparticles.</a> Biotechnology and Bioengineering. 109, 462-471 (2012).</li><li>Driouch, H., Roth, A., Dersch, P., Wittmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+bioprocess+for+production+of+fructofuranosidase+by+recombinant+Aspergillus+niger.">Optimized bioprocess for production of fructofuranosidase by recombinant Aspergillus niger.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 87, 2011-2024 (2010).</li><li>Driouch, H., Roth, A., Dersch, P., Wittmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filamentous+fungi+in+good+shape:+Microparticles+for+tailor-made+fungal+morphology+and+enhanced+enzyme+production.">Filamentous fungi in good shape: Microparticles for tailor-made fungal morphology and enhanced enzyme production.</a> Bioengineered Bugs. 2, 100-104 (2011).</li><li>Driouch, H., Sommer, B., Wittmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+engineering+of+Aspergillus+niger+for+improved+enzyme+production.">Morphology engineering of Aspergillus niger for improved enzyme production.</a> Biotechnology and Bioengineering. 105, 1058-1068 (2010).</li><li>Kaup, B. -. A., Ehrich, K., Pescheck, M., Schrader, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microparticle-enhanced+cultivation+of+filamentous+microorganisms:+Increased+chloroperoxidase+formation+by+Caldariomyces+fumago+as+an+example.">Microparticle-enhanced cultivation of filamentous microorganisms: Increased chloroperoxidase formation by Caldariomyces fumago as an example.</a> Biotechnology and Bioengineering. 99, 491-498 (2008).</li><li>Hirayama, M., Sumi, N., Hidaka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+a+fructooligosaccharide-producing+beta-fructofuranosidase+from+Aspergillus+niger+ATCC+20611.">Purification and characterization of a fructooligosaccharide-producing beta-fructofuranosidase from Aspergillus niger ATCC 20611.</a> Agricultural and Biological Chemistry. 53, 667-673 (2006).</li><li>Rajoka, M. I., Yasmeen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+productivity+of+beta-fructofuranosidase+by+a+derepressed+mutant+of+Aspergillus+niger+form+conventional+and+non-conventional+substrates.">Improved productivity of beta-fructofuranosidase by a derepressed mutant of Aspergillus niger form conventional and non-conventional substrates.</a> World Journal of Microbiology and Biotechnology. 21, 471-478 (2005).</li><li>Zuccaro, A., G&#195;&#182;tze, S., Kneip, S., Dersch, P., Seibel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailor-made+fructooligosaccharides+by+a+combination+of+substrate+and+genetic+engineering.">Tailor-made fructooligosaccharides by a combination of substrate and genetic engineering.</a> ChemBioChem. 9, 143-149 (2008).</li><li>Huggett, A. S. G., Nixon, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+glucose+oxidase,+peroxidase,+and+o-dianisidin+in+determination+of+blood+and+urinary+glucose.">Use of glucose oxidase, peroxidase, and o-dianisidin in determination of blood and urinary glucose.</a> The Lancet. , 270-368 (1957).</li><li>Wucherpfenning, T., Hestler, T., Krull, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+engineering+-+Osmolality+and+its+effect+on+Aspergillus+niger+morphology+and+productivity.">Morphology engineering - Osmolality and its effect on Aspergillus niger morphology and productivity.</a> Microb. Cell Fact. 10, (2011).</li><li>Rasband, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ImageJ. , (1997).</li><li>Papagianni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+the+fractal+nature+of+mycelial+aggregation+in+Aspergillus+niger+submerged+cultures.">Quantification of the fractal nature of mycelial aggregation in Aspergillus niger submerged cultures.</a> Microbial Cell Factories. 5, 5 (2006).</li></ol>

Je n&#39;ai rien à communiquer.

La modification de la morphologie fongique a été d&#39;intérêt en matière de biotechnologie depuis de nombreuses décennies. Différentes études ont tenté de faire varier les paramètres du procédé choisis tels que la valeur pH, puissance, température, nutriments moyennes ou 1 concentration de l&#39;inoculum, mais souffrent de contrôle plutôt imprécise et incomplète de la morphologie, les coûts élevés de l&#39;énergie, des effets d&#39;inhibition ou de l&#39;instabilité du produit, En revanche, la supplémentation en micro-particules permet une ingénierie précise de la morphologie fongique grâce à affiner la variation de la taille des particules et la concentration. Cela ouvre de nouvelles possibilités d&#39;utiliser les micro-particules pour l&#39;optimisation et conception sur mesure de la morphologie production élevée dans la production biotechnologique avec A. Niger et d&#39;autres micro-organismes filamenteux. L&#39;analyse d&#39;image numérique est une méthode facile reproductible pour caractériser la morphologie macro fongique. Cependant, la variété de paramètres pour ca taille, la forme et la surfaceter des structures morphologiques décrits dans la littérature fait une évaluation rapide de la morphologie fongique compliquée. Le nombre Morphologie présenté comme une combinaison de paramètres pertinents, évite cette lacune et peut être utilisé non seulement pour la caractérisation complète des structures morphologiques, mais aussi pour la corrélation mathématique direct avec la productivité. Cela rend encore une fois une estimation de la productivité par la morphologie donnée et donc une personnalisation de la morphologie des processus doit possible. En utilisant le numéro Morphologie, il est possible de distinguer entre les différents granulés et morphologies touffe 4,5. Pour les développements futurs du nombre Morphologie de l&#39;examen de la dimension fractale semble être prometteuse. Une dimension fractale donne une mesure de la complexité et la masse de remplissage des propriétés d&#39;un objet 13 et est donc prédestiné pour la caractérisation globale de la morphologie du mycélium. Le creation d&#39;une morphologie de haut mycélienne production, cependant, pourrait conduire à des problèmes avec la performance du processus en particulier dans la culture à grande échelle, parce que la forme la croissance du mycélium a été démontré antérieurement que présentent beaucoup plus de viscosités bouillon de culture 2. Cela conduit à des problèmes avec le transfert de chaleur et de masse et la formation de la stagnation des zones non mixtes, qui nécessitent une entrée de puissance plus élevée et rendre la culture plus coûteux à exploiter 1. Par conséquent, la relation entre la morphologie fongique et de la viscosité bouillon de culture doit être considérée lors du changement de la morphologie et être incorporées dans d&#39;autres modèles.

Table of Equipment:
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>
			Equipment</td>
			<td>
			Company</td>
			<td>
			Catalogue Number/model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			autoclave</td>
			<td>
			Systec</td>
			<td>
			V150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			B&uuml;chner funnel (plastic)</td>
			<td>
			VWR</td>
			<td>
			-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			cellulose filter (for biomass dry weight)</td>
			<td>
			Sartorius Stedim Biotech</td>
			<td>
			Filter Discs Grade 389</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			cellulose acetate filter (for air filtration at reactor)</td>
			<td>
			Sartorius stedim biotech</td>
			<td>
			Midisart 200 PTFE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			cellulose acetate filter (for enzyme activity)</td>
			<td>
			Sartorius Stedim Biotech</td>
			<td>
			Midisart NML</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			centrifuge</td>
			<td>
			Eppendorf</td>
			<td>
			Centrifuge 5415R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			centrifuge</td>
			<td>
			Heraeus</td>
			<td>
			Biofuge fresco</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			centrifuge</td>
			<td>
			Heraeus sepatech</td>
			<td>
			Varifuge 3.0R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			compartment dryer (105 &deg;C)</td>
			<td>
			Heraeus</td>
			<td>
			Kelvitran t</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			control unit (temperature)</td>
			<td>
			Jumo</td>
			<td>
			Jumo iTron 08</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			control unit (pH-value)</td>
			<td>
			meredos</td>
			<td>
			pH Control 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			desiccator</td>
			<td>
			Duran</td>
			<td>
			Vacuum stable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Falcon tubes</td>
			<td>
			Omnilab</td>
			<td>
			FALC352070</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			heating block 40 &deg;C</td>
			<td>
			Biometra</td>
			<td>
			TB1 Thermoblock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			heating block 95 &deg;C</td>
			<td>
			HLC</td>
			<td>
			HBT 130</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			micro plate reader</td>
			<td>
			Tecan</td>
			<td>
			Sunrise-Microplate-Reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			micro scales</td>
			<td>
			Sartorius</td>
			<td>
			CP 225</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			microscope (digital inverted)</td>
			<td>
			AMG</td>
			<td>
			EVOS xl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			micro pipettes and tips (different sizes)</td>
			<td>
			Omnilab</td>
			<td>
			5283303
			5283298 
			5283299 
			5283300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			micro titer plate</td>
			<td>
			Nunc</td>
			<td>
			MaxiSorp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			multi pipette and tips</td>
			<td>
			Eppendorf/ Omnilab</td>
			<td>
			5283611/ 5283611</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			pH-electrode</td>
			<td>
			Schott</td>
			<td>
			pH-Meter CG840</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			reaction tubes</td>
			<td>
			Roth</td>
			<td>
			E518.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			scale</td>
			<td>
			Sartorius</td>
			<td>
			CP 3202 S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			stirred tank bioreactor with equipment</td>
			<td>
			Applikon Biotechnology</td>
			<td>
			2L Bioreactor set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			syringe</td>
			<td>
			Eppendorf</td>
			<td>
			Combitips Plus 5 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table of Reagents:
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>
			Name of the reagent</td>
			<td>
			Company </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Acetic acid</td>
			<td>
			Roth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Disodium hydrogen phosphate</td>
			<td>
			Merck</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Ethanol (95%)</td>
			<td>
			Roth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Glucose monohydrate, (&alpha;-D-)</td>
			<td>
			Roth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Glucose oxidase (Typ II from Aspergillus niger)</td>
			<td>
			Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Hydrochloride acid (37 % w/v)</td>
			<td>
			Fiedel-de Ha&euml;n</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Hydrous magnesium silicate</td>
			<td>
			Roth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Monopotassium phosphate</td>
			<td>
			Merck</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			o-dianoisidine dihydrochloride</td>
			<td>
			Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Peroxidase (Typ II from horseradish)</td>
			<td>
			Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Sodium acetate</td>
			<td>
			Roth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Sodium hydroxide</td>
			<td>
			Merck</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Sucrose, D-(+)</td>
			<td>
			Fluka</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Water (deionized)</td>
			<td>
			-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table of Solutions and Medium Composition:
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>
			Solution</td>
			<td>
			Components</td>
			<td>
			Amount</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			50 mM sodium acetate buffer (pH 6.5)</td>
			<td>
			Sodium acetate
			Bring to volume with deionized water
			Adjust at pH 6.5 with acetic acid</td>
			<td>
			4.1 g L-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			0.05 M monopotassium phosphate solution</td>
			<td>
			Monopotassium phosphate
			Bring to volume with deionized water</td>
			<td>
			6.805 g L-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			0.05 M disodium hydrogen phosphate solution</td>
			<td>
			Disodium hydrogen phosphate
			Bring to volume with deionized water</td>
			<td>
			7.1 g L-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			0.05 M phosphate buffer (pH 7.0)</td>
			<td>
			0.05 M disodium hydrogen phosphate solution
			Bring to volume with 0.05 M monopotassium phosphate solution</td>
			<td>
			61.2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			0.05 M phosphate buffer (pH 5.4)</td>
			<td>
			0.05M disodium hydrogen phosphate solution
			Bring to volume with 0.05 M monopotassium phosphate solution</td>
			<td>
			3 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			1.65 M sucrose solution</td>
			<td>
			D-(+)-sucrose
			Bring to volume with phosphate buffer (pH 5.4)</td>
			<td>
			564.8 g L-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			reagent solution</td>
			<td>
			o-Dianisidin-Dihydrochlorid
			Ethanol (95%)</td>
			<td>
			25 mg
			10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Glucose reagent solution</td>
			<td>
			Glucose oxidase
			Peroxidase
			Phosphate buffer (pH 7.0)
			reagent solution</td>
			<td>
			10.5 mg
			3 mg
			90 mL
			10 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

customization of aspergillus niger morphology through addition of talc micro particles

Le champignon filamenteux A. Niger est une souche largement utilisés dans un large éventail de procédés industriels de l&#39;alimentation à l&#39;industrie pharmaceutique. Une des caractéristiques les plus fascinantes et souvent incontrôlables de cet organisme filamenteux est sa morphologie complexe. Il va de granules sphériques denses à visqueux mycélium (Figure 1). Différents paramètres du procédé et les ingrédients sont connus pour influencer la morphologie fongique 1. Depuis une productivité optimale est fortement corrélé avec une forme morphologique spécifique, la morphologie fongique représente souvent le goulot d&#39;étranglement de la productivité dans la production industrielle. Une démarche simple et élégant pour contrôler avec précision la forme morphologique est l&#39;ajout d&#39;inorganiques insolubles micro particules (comme silicate de magnésium hydraté, d&#39;oxyde d&#39;aluminium ou d&#39;oxyde de titane de silicate) à milieu de culture contribuant à la production d&#39;enzymes augmenté 2-6. Comme il ya une OBVcorrélation entre la morphologie des particules ious micro dépendante et la production d&#39;enzymes, il est souhaitable de lier mathématiquement la productivité et l&#39;aspect morphologique. Par conséquent, une description précise et quantitative globale morphologique est ciblé. Ainsi, nous présentons une méthode pour générer et caractériser des micro particules dépendantes des structures morphologiques et de corréler la morphologie fongique de la productivité (Figure 1) qui contribue éventuellement à une meilleure compréhension de la morphogenèse des micro-organismes filamenteux. La souche recombinante A. Niger SKAn1015 est cultivé pendant 72 h dans un bioréacteur agité de 3 L du réservoir. Par addition de micro-particules de talc à des concentrations de 1 g / L, 3 g / L et 10 g / L avant l&#39;inoculation une variété de structures morphologiques est reproductible généré. Échantillons stériles sont prises après les heures de 24, 48 et 72 pour la détermination des progrès accomplis croissance et l&#39;activité de l&#39;enzyme produite. Laproduit formé est l&#39;enzyme de grande valeur β-fructofurannosidase, un biocatalyseur important pour néo-sucre dans la formation industrie alimentaire ou pharmaceutique, qui catalyse la réaction entre autres de saccharose au glucose 7-9. Par conséquent, la quantification du glucose après addition de saccharose implique la quantité de β-fructofuranosidase produit. La quantification du glucose se fait par un Dieu / POD-test 10, qui est modifiée pour analyse à haut débit dans des plaques de titrage à 96 puits micro. Morphologie fongique après 72 heures est examiné au microscope et caractérisé par analyse d&#39;image numérique. Ce faisant, les facteurs de forme des particules de morphologie macro fongique comme diamètre Féret, surface projetée, le périmètre, la circularité, ratio d&#39;aspect, la solidité und rondeur sont calculées avec le open source de traitement d&#39;image ImageJ programme. Les paramètres pertinents sont combinés à un certain nombre sans dimension Morphologie (Mn) 11, qui permet une caractérisation complète desmorphologie fongique. La corrélation étroite entre le nombre Morphologie et la productivité sont mis en évidence par la régression mathématique.

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Customization of Aspergillus niger Morphology Through Addition of Talc Micro Particles

Une méthode pour générer et précisément à leur morphologie globale du champignon filamenteux<em&gt; Aspergillus Niger</em&gt; Est décrit, ce qui permet la corrélation mathématique de l&#39;apparence morphologique et la productivité.

Personnalisation des Aspergillus Niger Morphologie par addition de micro-particules de talc

The filamentous fungus A. niger is a widely used strain in a broad range of industrial processes from food to pharmaceutical industry. One of the most ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Customization of Aspergillus niger Morphology Through Addition of Talc Micro Particles

18.8K vues.  Technische Universität Braunschweig. Une méthode pour générer et précisément à leur morphologie globale du champignon filamenteux Aspergillus Niger Est décrit, ce qui permet la corrélation mathématique de l'apparence morphologique et la productivité.

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Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs &amp; Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient expression of effectors. Packaging lentiviral expression constructs into pseudoviral particles, however, enables up to 100% transduction, even with difficult-to-transfect cells, such as primary, stem, and differentiated cells. Moreover, the lentiviral delivery does not produce the specific cellular responses typically associated with chemical transfections, such as cell death resulting from toxicity of the transfection reagent 1, 2. When transduced into target cells, the lentiviral construct integrates into genomic DNA and provides stable expression of the small hairpin RNA (shRNA), cDNA, microRNA or reporter gene 3, 4. Target cells stably expressing the effector molecule can be isolated using a selectable marker contained in the expression vector construct such as puromycin or GFP. After pseudoviral particles infect target cells, they cannot replicate within target cells because the viral structural genes are absent and the long terminal repeats (LTRs) are designed to be self-inactivating upon transduction 5, 6.
There are three main components necessary for efficient lentiviral packaging 1, 5, 6, 7. 
1. The lentiviral expression vector that contains some of the genetic elements required for packaging, stable integration of the viral expression construct into genomic DNA, and expression of the effector or reporter. 
2. The lentiviral packaging plasmids that provide the proteins essential for transcription and packaging of an RNA copy of the expression construct into recombinant pseudoviral particles. This protocol uses the pPACK plasmids (SBI) that encode for gag, pol, and rev from the HIV or FIV genome and Vesicular Stomatitis Virus g protein (VSV-G) for the viral coat protein. 
3. 293TN producer cells (derived from HEK293 cells) that express the SV40 large T antigen, which is required for high-titer lentiviral production and a neomycin resistance gene, useful for reselecting the cells for maintenance.
An overview of the viral production protocol can be seen in Figure 1. Viral production starts by co-transfecting 293TN producer cells with the lentiviral expression vector and the packaging plasmids. Viral particles are secreted into the media. After 48-72 hours the cell culture media is harvested. Cellular debris is removed from the cell culture media, and the viral particles are precipitated by centrifugation with PEG-it for concentration. Produced lentiviral particles are then titered and can be used to transduce target cells. Details of viral titering are not included in this protocol, but can be found at:
<a href="http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf" target="_blank">http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf</a> 8.
This protocol has been optimized using the specific products indicated. Other reagents may be substituted, but the same results cannot be guaranteed.

Lentiviral expression vectors are the most effective vehicles for stably expressing different effector molecules or reporter constructs in dividing and non-dividing mammalian cells and whole organisms. Here we provide a protocol on how to package lentivector expression constructs in pseudoviral particles and to transduce target cells using the pseudoviral particles.

Emballage VIH ou FIV à base de constructions d&#39;expression et de transduction du Lentivector VSV-G pseudotypés particules virales

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient ...

Recherche

Immunologie et infection

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable method of analysis by flow cytometry to study nanoparticle interaction with immune cells. Primary immune cells can be easily purified from human or mouse tissues by antibody-mediated magnetic isolation. In the first instance, the different cell populations running in a flow cytometer can be distinguished by the forward-scattered light (FSC), which is proportional to cell size, and the side-scattered light (SSC), related to cell internal complexity. Furthermore, fluorescently labeled antibodies against specific cell surface receptors permit the identification of several subpopulations within the same sample. Often, all these features vary when cells are boosted by external stimuli that change their physiological and morphological state. Here, 50 nm FITC-SiO2 nanoparticles are used as a model to identify the internalization of nanostructured materials in human blood immune cells. The cell fluorescence and side-scattered light increase after incubation with nanoparticles allowed us to define time and concentration dependence of nanoparticle-cell interaction. Moreover, such protocol can be extended to investigate Rhodamine-SiO2 nanoparticle interaction with primary microglia, the central nervous system resident immune cells, isolated from mutant mice that specifically express the Green Fluorescent Protein (GFP) in the monocyte/macrophage lineage. Finally, flow cytometry data related to nanoparticle internalization into the cells have been confirmed by confocal microscopy.

Analysis of nanoparticle interaction with defined subpopulations of immune cells by flow cytometry.

Détection de nanoparticules fluorescentes Interactions avec immunitaire primaire sous-populations de cellules par cytométrie en flux

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.

This study describes an imaging-based micro-neutralization assay to analyze the antigenic relationships between viruses. The protocol employs a flatbed scanner and has four steps, including titration, titration quantitation, neutralization, and neutralization quantitation. The assay works well with current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses.

L&#39;optimisation d&#39;un micro-neutralisation quantitative de dosage

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting

The protocol aims to generate coronavirus (CoV) spike (S) fusion protein pseudotyped particles with a murine leukemia virus (MLV) core and luciferase reporter, using a simple transfection procedure of the widely available HEK-293T cell line. Once formed and released from producer cells, these pseudovirions incorporate a luciferase reporter gene. Since they only contain the heterologous coronavirus spike protein on their surface, the particles behave like their native coronavirus counterparts for entry steps. As such, they are the excellent surrogates of native virions for studying viral entry into host cells. Upon successful entry and infection into target cells, the luciferase reporter gets integrated into the host cell genome and is expressed. Using a simple luciferase assay, transduced cells can be easily quantified. An important advantage of the procedure is that it can be performed in biosafety level 2 (BSL-2) facilities instead of BSL-3 facilities required for work with highly pathogenic coronaviruses such as Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV) and severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV). Another benefit comes from its versatility as it can be applied to envelope proteins belonging to all three classes of viral fusion proteins, such as the class I influenza hemagglutinin (HA) and Ebola virus glycoprotein (GP), the class II Semliki forest virus E1 protein, or the class III vesicular stomatitis virus G glycoprotein. A limitation of the methodology is that it can only recapitulate virus entry steps mediated by the envelope protein being investigated. For studying other viral life cycle steps, other methods are required. Examples of the many applications these pseudotype particles can be used in include investigation of host cell susceptibility and tropism and testing the effects of virus entry inhibitors to dissect viral entry pathways used.

Here, we present a protocol to generate pseudotyped particles in a BSL-2 setting incorporating the spike protein of the highly pathogenic viruses Middle East respiratory syndrome and severe acute respiratory syndrome coronaviruses. These pseudotyped particles contain a luciferase reporter gene allowing quantification of virus entry into target host cells.

Production de pseudo particules pour étudier les coronavirus hautement pathogènes dans un cadre de niveau 2 de Biosafety

The protocol aims to generate coronavirus (CoV) spike (S) fusion protein pseudotyped particles with a murine leukemia virus (MLV) core and luciferase ...

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are cleared from the human lung alveoli by being phagocytosed by innate monocytes and/or neutrophils. This protocol offers a fast and reliable measurement of phagocytosis by flow cytometry using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled conidia for co-incubation with human leukocytes and subsequent counterstaining with an anti-FITC antibody to allow discrimination of internalized and cell-adherent conidia. Major advantages of this protocol are its rapidness, the possibility to combine the assay with cytometric analysis of other cell markers of interest, the simultaneous analysis of monocytes and neutrophils from a single sample and its applicability to other cell wall-bearing fungi or bacteria. Determination of percentages of phagocytosing leukocytes provides a means to microbiologists for evaluating virulence of a pathogen or for comparing pathogen wildtypes and mutants as well as to immunologists for investigating human leukocyte capabilities to combat pathogens.

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

This protocol provides a fast and reliable method to quantitatively measure phagocytosis of Aspergillus fumigatus conidia by human primary phagocytes using flow cytometry and to discriminate phagocytosis of conidia from mere adhesion to leukocytes.

Mesure de la phagocytose d'Aspergillus fumigatus Conidia par des leucocytes humains à l'aide de la cytométrie du flux

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal drugs, IA can cause &#62;50% mortality in infected immunocompromised patients. It is crucial to determine both host and pathogen factors that contribute to infection susceptibility and low survival rates in infected patients in order to develop novel therapeutics. Innate immune responses play a pivotal role in recognition and clearance of Aspergillus spores, though little is known about the exact cellular and molecular mechanisms. Reliable models are required to investigate detailed mechanistic interactions between the host and pathogen. The optical clarity and genetic tractability of zebrafish larvae make them an intriguing model&#160;to study host-pathogen interactions of multiple human bacterial and fungal infections in a live and intact host. This protocol describes a larval zebrafish Aspergillus infection model. First, Aspergillus spores are isolated and injected into the zebrafish hindbrain ventricle via microinjection. Then, chemical inhibitors such as immunosuppressive drugs are added directly to the larval water. Two methods to monitor the infection in injected larvae are described, including the 1) homogenization of larvae for colony forming unit (CFU) enumeration and 2) a repeated, daily live imaging setup. Overall, these techniques can be used to mechanistically analyze the progression of Aspergillus infection in vivo and can be applied to different host backgrounds and Aspergillus strains to interrogate host-pathogen interactions.

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

This protocol describes an Aspergillus infection model in zebrafish larvae. Aspergillus spores are microinjected into the hindbrain of larvae, and chemical treatment is used to induce immunosuppression. Infection progression is monitored via a daily imaging setup to monitor fungal growth and immune responses as well as enumeration of live spores by colony forming unit plating.

Infection des larves de poisson zèbre par des spores d’Aspergillus pour l’analyse des interactions hôte-pathogène

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal ...

Supervised Machine Learning for Semi-Quantification of Extracellular DNA in Glomerulonephritis

Glomerular cell death is a pathological feature of myeloperoxidase anti neutrophil cytoplasmic antibody associated vasculitis (MPO-AAV). Extracellular deoxyribonucleic acid (ecDNA) is released during different forms of cell death including apoptosis, necrosis, necroptosis, neutrophil extracellular traps (NETs) and pyroptosis. Measurement of this cell death is time consuming with several different biomarkers required to identify the different biochemical forms of cell death. Measurement of ecDNA is generally conducted in serum and urine as a surrogate for renal damage, not in the actual target organ where the pathological injury occurs. The current difficulty in investigating ecDNA in the kidney is the lack of methods for formalin fixed paraffin embedded tissue (FFPE) both experimentally and in archived human kidney biopsies. This protocol provides a summary of the steps required to stain for ecDNA in FFPE tissue (both human and murine), quench autofluorescence and measure the ecDNA in the resulting images using a machine learning tool from the publicly available open source ImageJ plugin trainable Weka segmentation. Trainable Weka segmentation is applied to ecDNA within the glomeruli where the program learns to classify ecDNA. This classifier is applied to subsequent acquired kidney images, reducing the need for manual annotations of each individual image. The adaptability of the trainable Weka segmentation is demonstrated further in kidney tissue from experimental murine anti-MPO glomerulonephritis (GN), to identify NETs and ecMPO, common pathological contributors to anti-MPO GN. This method provides objective analysis of ecDNA in kidney tissue that demonstrates clearly the efficacy in which the trainable Weka segmentation program can distinguish ecDNA between healthy normal kidney tissue and diseased kidney tissue. This protocol can easily be adapted to identify ecDNA, NETs and ecMPO in other organs.

Extracellular DNA (ecDNA) released during cell death is proinflammatory and contributes to inflammation. Measurement of ecDNA at the site of injury can determine the efficacy of therapeutic treatment in the target organ. This protocol describes the use of a machine learning tool to automate measurement of ecDNA in kidney tissue.

Apprentissage automatique supervisé pour la semi-quantification de l’ADN extracellulaire dans la glomerulonephrite

Glomerular cell death is a pathological feature of myeloperoxidase anti neutrophil cytoplasmic antibody associated vasculitis (MPO-AAV). Extracellular ...

Fecal (micro) RNA Isolation

It is becoming clear that RNA exists in the gut lumen and feces in animals and humans. The protocol described below isolates total RNA including microRNAs from fecal samples of animal and human subjects. The aim is to isolate total RNA with high purity and quantity for downstream analyses such as RNA sequencing, RT-PCR, and micro-array. The advantages of this optimized protocol in the miRNA isolation are capabilities of isolating highly purified RNA products with additional washing steps described, increased quantity of RNA obtained with an improved method in the resuspension of sample, and important tips of decontamination. One limitation is the inability to process and purify larger sample of more than 200 mg as these sample sizes would cause a difficulty in the clear formation of the interphase. Consequently, the large sample size may contaminate the aqueous phase to be extracted as described in the protocol with organic matters that affect the quality of RNA isolated in the end. However, RNA isolates from a sample of up to 200 mg are sufficient for most of downstream analyses.

Fecal micro RNA Isolation

This protocol isolates high quality total RNA from fecal samples of animal and human subjects. A commercial miRNA isolation kit is used with significant adaption to isolate pure RNA with optimized quantity and quality. The RNA isolates are good for most downstream RNA assays such as sequencing, micro-array, and RT-PCR.

Isolement de l’ARN fécal (micro)

It is becoming clear that RNA exists in the gut lumen and feces in animals and humans. The protocol described below isolates total RNA including microRNAs ...

Confocal Laser Scanning Microscopy-Based Quantitative Analysis of Aspergillus fumigatus Conidia Distribution in Whole-Mount Optically Cleared Mouse Lung

Aspergillus fumigatus conidia are airborne pathogens that can penetrate human airways. Immunocompetent people without allergies exhibit resistance and immunological tolerance, while in immunocompromised patients, conidia can colonize airways and cause severe invasive respiratory disorders. Various cells in different airway compartments are involved in the immune response that prevents fungal invasion; however, the spatio-temporal aspects of pathogen elimination are still not completely understood. Three-dimensional (3D) imaging of optically cleared whole-mount organs, particularly the lungs of experimental mice, permits detection of fluorescently labeled pathogens in the airways at different time points after infection. In the present study, we describe an experimental setup to perform a quantitative analysis of A. fumigatus conidia distribution in the airways. Using fluorescent confocal laser scanning microscopy (CLSM), we traced the location of fluorescently labeled&#160;conidia in the bronchial branches and the alveolar compartment 6 hours after oropharyngeal application to mice. The approach described here was previously used for detection of the precise pathogen location and identification of the pathogen-interacting cells at different phases of the immune response. The experimental setup can be used to estimate the kinetics of the pathogen elimination in different pathological conditions.

Confocal Laser Scanning Microscopy-Based Quantitative Analysis of Aspergillus fumigatus Conidia Distribution in Whole-Mount Optically Cleared Mouse Lung

We describe the method for quantitative analysis of the distribution of Aspergillus fumigatus conidia (3 &#181;m in size) in the airways of mice. The method also can be used for the analysis of microparticles and nanoparticle agglomerate distribution in the airways in various pathological condition models.

Analyse quantitative basée sur la microscopie confocale à balayage laser de la distribution des conidies d’Aspergillus fumigatus dans le poumon de souris optiquement nettoyé à montage entier

Aspergillus fumigatus conidia are airborne pathogens that can penetrate human airways. Immunocompetent people without allergies exhibit resistance and ...

<meta charset="utf8"></head><body>Analyse du SARS-CoV-2 à l’aide de la technologie à double rapporteur et multiplex

Profiling of Surface Protein Epitopes on Viral Particles by Multiplex Dual-Reporter Strategy

Membrane proteins on enveloped viruses play an important role in many biological functions involving virus attachment to target cell receptors, fusion of viral particles to host cells, host-virus interactions, and disease pathogenesis. Furthermore, viral membrane proteins on virus particles and presented on host cell surfaces have proven to be excellent targets for antivirals and vaccines. Here, we describe a protocol to investigate surface proteins on intact severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) particles using the dual-reporter flow cytometric system. The assay exploits multiplex technology to obtain a triple detection of viral particles by three independent affinity reactions. Magnetic beads conjugated to recombinant human angiotensin-converting enzyme-2 (ACE2) were used to capture viral particles from the supernatant of cells infected with SARS-CoV-2. Then, two detection reagents labeled with R-phycoerythrin (PE) or Brilliant Violet 421 (BV421) were applied simultaneously. As a proof-of-concept, antibody fragments targeting different epitopes of the SARS-CoV-2 surface protein Spike (S1) were used. The detection of viral particles by three independent affinity reactions provides strong specificity and confirms the capture of intact virus particles. Dose-dependency curves of SARS-CoV-2 infected cell supernatant were generated with replicate coefficient variances (mean/SD) &#706;14%. Good assay performance in both channels confirmed that two virus surface target protein epitopes are detectable in parallel. The protocol described here could be applied for (i) high-multiplex, high-throughput profiling of surface proteins expressed on enveloped viruses; ii) detection of active intact viral particles; and (iii) assessment of specificity and affinity of antibodies and antiviral drugs for surface epitopes of viral antigens.The application can be potentially extended to any type of extracellular vesicles and bioparticles, exposing surface antigens in body fluids or other liquid matrices.

<meta charset="utf8"></head><body>Pleins feux sur l’auteur : Faire progresser les stratégies antivirales grâce à de nouvelles techniques d’immunocapture et de spectrométrie de masse

Here, we describe a newly developed multiplex fluorescent immunoassay that uses a dual-reporter flow cytometric system to concurrently detect two unique spike protein epitopes on intact severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) viral particles that had been captured by angiotensin-converting enzyme-2-coupled magnetic microspheres.

Profilage d’épitopes de protéines de surface sur des particules virales par stratégie de double rapporteur multiplex

Membrane proteins on enveloped viruses play an important role in many biological functions involving virus attachment to target cell receptors, fusion of ...