Nous avons reçu une assistance technique de l’installation de biopolymères de la Harvard Medical School pour le bioanalyseur. Ce travail a été soutenu par la subvention de recherche RG-1707-28516 (H.L.W. et S.L.) de la National Multiple Sclerosis Society.

Toutes les méthodes impliquant des animaux de recherche décrites ici ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) du Brigham and Women’s Hospital de la Harvard Medical School.
Toutes les méthodes impliquant des sujets de recherche humains décrites ici sont conformes aux lignes directrices établies par le Comité de recherche humaine des partenaires.
1. Prélèvement d’échantillons fécaux
<ol><li>Autoclaver ou préparer un tube microcentrifuge stérile et sans nucléase de 2 mL avec un bouchon à vis pour chaque animal soumis à une expérience.<ol><li>Pour les sujets humains, fournir un dispositif de prélèvement d’échantillons de selles approprié, exempt de nucléases et stérile pour chaque sujet.</li>
	</ol></li>
	<li>Prélever 25 à 100 mg (environ 1 à 4 granulés fécaux pour les échantillons fécaux de souris) d’échantillons fécaux de chaque animal sujet dans un environnement stérile. REMARQUE: Deux granulés fécaux ou plus (~ 50 mg ou plus) sont préférés pour obtenir de l’ARN de la plus haute pureté.<ol><li>Utilisez tout l’équipement de protection individuelle (EPI) et le matériel nécessaires, par exemple : une paire de gants de laboratoire, un spray désinfectant et une serviette en papier stérile, pour stériliser la zone de travail, où le sujet de recherche animale est placé, afin d’éviter la contamination des échantillons fécaux.<ol><li>Pour les sujets humains, demander à chaque sujet de recherche/collecteur de prélever de 100 à 200 mg d’échantillons de selles dans un environnement aussi stérile que possible. Utilisez un fonctionnement stérile standard et évitez la contamination des échantillons de selles.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Prélever des échantillons fécaux de chaque animal directement dans un tube microcentrifuge de 2 ml muni d’un bouchon à vis sans toucher d’autres surfaces pour éviter toute contamination.<ol><li>Pour les sujets humains, demandez à chaque sujet de déféquer directement dans un dispositif de prélèvement applicable fourni (p. ex. une trousse de prélèvement d’échantillons de selles stériles) pour éviter la contamination. REMARQUE: Donner des instructions sous réserve d’éviter la contamination par les surfaces des toilettes, l’eau, l’urine ou toute autre surface / objet non stérile.</li>
	</ol></li>
	<li>Congeler immédiatement à -80 °C les échantillons fécaux prélevés dans des tubes à microcentrifugation de 2 ml ou les placer dans un seau de glace sèche pour obtenir une meilleure quantité et une meilleure qualité d’ARN avant la remise en suspension des matières fécales comme décrit dans les étapes ci-dessous.<ol><li>Pour les échantillons de selles humaines, aliquote chaque échantillon frais de 200 mg dans des tubes microcentrifugés de 2 mL munis de bouchons à vis et les congeler à -80 °C avant la remise en suspension des matières fécales comme décrit ci-dessous.<ol><li>Pour l’entreposage d’échantillons de selles qui ne sont pas dans des tubes microcentrifugés de 2 mL munis de bouchons à vis, peser et transférer de 100 à 200 mg chacun des échantillons congelés dans des tubes microcentrifugeuses séparés de 2 mL munis de bouchons à vis avant la remise en suspension des matières fécales, comme décrit ci-dessous. NOTE: Pour les échantillons de selles humaines, évitez de prendre plus de 200 mg d’échantillons de selles pour l’isolement de l’ARN car cela peut causer des difficultés dans les étapes suivantes. Avec un échantillon surchargé dans un tube microcentrifuge de 2 mL, la phase aqueuse, la phase organique et l’interphase peuvent ne pas être clairement formées et séparées. La procédure peut être interrompue ici.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. Préparations de solutions de lavage
<ol><li>Ajouter 21 ml d’éthanol 100 % de qualité American Chemical Society (ACS) à la solution de lavage 1 fournie dans la trousse d’isolation des miARN (voir le tableau des matériaux) pour atteindre le volume final de 30 mL, comme indiqué sur le flacon. Vortex jusqu’à ce que tout se dissolve dans la bouteille.</li>
	<li>Ajouter 40 mL d’éthanol 100 % de qualité ACS à la solution de lavage 2/3 fournie pour atteindre le volume final de 50 mL, comme indiqué sur la bouteille. Vortex pendant 5 s ou jusqu’à ce que le mélange final soit bien mélangé.</li>
</ol>3. Préparation de l’équipement et du matériel
<ol><li>Pulvériser la zone de travail et l’équipement, par exemple : la paillasse de laboratoire, la zone de travail dans la hotte chimique et les supports de tubes microcentrifugés, avec une solution de décontamination Ribonuclease (RNase) (p. ex. solution de décontamination RNase disponible dans le commerce). Pour éviter toute contamination, appliquer avec la solution de décontamination RNase sur les surfaces où et quand cela est jugé nécessaire.</li>
	<li>Enfilez une blouse de laboratoire propre, mettez un masque facial et portez des gants de laboratoire appropriés pour protéger l’ARN dans les échantillons fécaux des nucléases présentes sur la peau humaine. Vaporisez des gants avec une solution de décontamination RNase et changez fréquemment de gants pour éviter la contamination.</li>
	<li>Préparez un seau de glace sèche pour les échantillons fécaux stockés à -80 °C pour éviter la décongélation avant la remise en suspension des matières fécales et un seau de glace pour les matériaux, par exemple: Acide-phénol: Chloroforme, pour prolonger la durée de conservation. REMARQUE : S’assurer que les matériaux, y compris les milieux utilisés dans le protocole, sont stériles sans contamination des nucléases.</li>
</ol>4. Remise en suspension des matières fécales
<ol><li>Remettez en suspension 25 à 100 mg d’échantillons fécaux dans 600 μL de solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) stérile 1x Dulbecco. ATTENTION : Les échantillons fécaux doivent être traités immédiatement lorsqu’ils sont décongelés à partir de -80 °C sans même décongélation partielle afin de minimiser la libération de RNases et d’ARN cellulaire, car les cristaux de glace rompent les compartiments cellulaires intérieurs et extérieurs lorsque les cellules de l’échantillon dégèlent.<ol><li>Ajouter 600 μL de 1x DPBS au tube microcentrifuge de 2 mL avec un bouchon à vis contenant des échantillons de matières fécales à température ambiante (RT).</li>
		<li>Incuber le mélange d’échantillons fécaux immergés dans 600 μL de 1x DPBS dans le tube microcentrifugeuse de 2 mL coiffé pendant 30 min à TA.</li>
		<li>Remettez le mélange en suspension en écrasant avec 1 mL d’embout de pipette et en remutant bien vortex avec le tube microcentrifugeuse de 2 mL bouché. Pour optimiser et augmenter la quantité et la qualité de l’ARN, remettre le mélange en suspension avec un homogénéisateur avec le réglage pour un cycle à S4000 (ou 4000 rpm) et 45 s.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Extraction biologique
ATTENTION : Utilisez la hotte chimique dangereuse pour les étapes suivantes jusqu’à l’étape 6 avec l’utilisation d’acide-phénol : chloroforme et ACS grade 100% éthanol en raison de leur toxicité et de leur inflammabilité. Changez l’EPI au besoin et suivez les précautions standard appropriées lorsque vous manipulez des matières dangereuses.
<ol><li>Extraire l’ARN avec 600 μL d’acide-phénol: chloroforme (le volume d’acide-phénol: chloroforme requis est égal au volume initial de 1x DPBS ajouté à l’étape 4.1).<ol><li>Ajouter 600 μL de chloroforme acide-phénol à la suspension de l’étape 4.1. NOTE: Retirer l’acide-phénol: chloroforme de la phase inférieure dans la bouteille lorsque la phase supérieure est mélangée avec un tampon aqueux. Si l’interphase entre ces deux phases est perturbée, alors attendre et retirer l’acide-phénol: chloroforme uniquement lorsque l’interphase se rétablit pour éviter la contamination.</li>
	</ol></li>
	<li>Vortex le mélange pendant 60 s pour bien mélanger. Alternativement, pour optimiser et augmenter la quantité d’ARN dans le rendement, mélanger en utilisant un homogénéisateur avec le réglage pour un cycle à S4000 et 45 s.</li>
	<li>Centrifuger pendant 15 min à 10 000 x g à TA pour séparer les phases aqueuse et organique avec une microcentrifugeuse. Après centrifugation, l’interphase doit être compacte. Si ce n’est pas le cas, répétez la centrifugation. NOTE: Si l’interphase n’a pas pu être aussi compacte que souhaité en raison d’un rapport inégal du volume initial au volume d’acide-phénol: chloroforme ajouté après plusieurs répétitions de centrifugation, procéder à la récupération de la phase aqueuse avec un plus grand soin pour éviter la contamination.</li>
	<li>Récupérer la phase aqueuse et la transférer dans un nouveau tube microcentrifuge de 2 mL muni d’un capuchon de charnière (non fourni par le kit d’isolation miARN).<ol><li>Retirez soigneusement la phase aqueuse (ou supérieure) sans perturber la phase inférieure et transférez-la dans un nouveau tube microcentrifuge de 2 mL muni d’un capuchon de charnière. Notez le volume transféré (p. ex., ~500 μL). REMARQUE: Lorsque l’interphase est compacte et que la phase supérieure est clairement séparée, il y a peut-être quelques minuscules particules résiduelles flottant au-dessus de la phase aqueuse. Pipeter soigneusement pour éviter ces résidus et ne récupérer que la phase aqueuse visiblement et clairement séparée pour assurer un rendement en ARN de qualité, même si vous ne pouvez obtenir qu’un faible volume de la phase aqueuse.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Isolement final de l’ARN
<ol><li>Ajouter 1,25 volume d’éthanol 100 % de qualité RT ACS à la phase aqueuse dans le tube microcentrifuge de 2 mL (p. ex., ajouter 625 μL d’éthanol à 100 % si 500 μL de phase aqueuse sont récupérés à l’étape 5.4). Vortex 3 s.</li>
	<li>Chargez le mélange phase aqueuse/éthanol à travers la cartouche filtrante fournie dans le kit d’isolation miARN.<ol><li>Pour chaque échantillon, placez la cartouche filtrante dans l’un des tubes de prélèvement fournis par le kit.<ol><li>Pipeter et charger 600 μL du mélange phase aqueuse/éthanol dans la cartouche filtrante. NOTE: Vortex le mélange brièvement pour bien mélanger l’éthanol avec la phase aqueuse avant le pipetage. Pas plus de 700 μL du mélange phase aqueuse/éthanol peuvent être chargés à la fois.</li>
		</ol></li>
		<li>Centrifuger à 10 000 x g pendant 90 s pour filtrer à travers le mélange. La rotation à une vitesse plus élevée peut endommager le filtre.</li>
		<li>Jeter le filtrat et répéter les étapes 6.2.1 à 6.2.2 jusqu’à ce que tout le mélange soit filtré à travers la même membrane filtrante dans des applications successives. Conservez et réutilisez le même tube de collecte pour les étapes de lavage ci-dessous.</li>
		<li>Lavez le filtre avec 700 μL de solution de lavage miARN 1. ATTENTION : miRNA Wash Solution 1 contient du thiocyanate de guanidine qui peut provoquer une irritation de la peau et de graves lésions oculaires. Portez l’EPI nécessaire, par exemple : gants, écran facial, blouse de laboratoire de protection. Changez de gants fréquemment au besoin.<ol><li>Appliquez 700 μL de miRNA Wash Solution 1, la solution de travail préparée avec l’éthanol 100% ACS, dans la cartouche filtrante.</li>
			<li>Centrifuger pendant 60 s pour filtrer la solution de lavage miARN 1 à travers la cartouche filtrante.</li>
			<li>Jetez le filtrat du tube de collecte et placez la même cartouche filtrante dans le même tube de collecte.</li>
		</ol></li>
		<li>Lavez le filtre avec la solution de lavage 2/3 une fois chacun avec des volumes de 700 μL, 500 μL et 250 μL consécutivement.<ol><li>Appliquez 700 μL de Wash Solution 2/3, la solution de travail préparée avec l’éthanol 100% ACS, dans la cartouche filtrante.<ol><li>Centrifuger à 10 000 x g pendant 1 min.</li>
				<li>Jetez le filtrat du tube de collecte et placez la même cartouche filtrante dans le même tube de collecte.</li>
			</ol></li>
			<li>Appliquer 500 μL de Wash Solution 2/3 dans la cartouche filtrante.<ol><li>Centrifuger à 10 000 x g pendant 1 min.</li>
				<li>Jetez le filtrat du tube de collecte et placez la même cartouche filtrante dans le même tube de collecte.</li>
			</ol></li>
			<li>Appliquer 250 μL de solution de lavage 2/3 dans la cartouche filtrante.<ol><li>Centrifuger à 10 000 x g pendant 1 min.</li>
				<li>Jetez le filtrat du tube de collecte.</li>
			</ol></li>
			<li>Transférez la cartouche filtrante dans un nouveau tube de collecte et faites tourner l’ensemble pendant 5 minutes pour éliminer le liquide résiduel du filtre.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>7. ARN éluté avec 50 μL d’eau sans nucléase
<ol><li>Transférez la cartouche filtrante dans un nouveau tube de collecte. Pipeter 50 μL d’eau sans nucléase au centre du filtre et boucher le tube de collecte.<ol><li>Incuber à TA pendant 10 min.</li>
		<li>Faire tourner pendant 5 min à 8 000 x g pour récupérer l’ARN dans le nouveau tube de collecte.</li>
		<li>Déterminer la concentration et la pureté de l’ARN fécal récupéré à l’aide d’un fluoromètre. L’ARN fécal récupéré peut être conservé à -80 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Das, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+RNA+communication+consortium:+Establishing+foundational+knowledge+and+technologies+for+extracellular+RNA+research.">The extracellular RNA communication consortium: Establishing foundational knowledge and technologies for extracellular RNA research.</a> Cell. 177 (2), 231-242 (2019).</li><li>Ahmed, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+microRNA+markers+for+screening+sporadic+human+colon+cancer+and+active+ulcerative+colitis+in+stool+and+tissue.">Diagnostic microRNA markers for screening sporadic human colon cancer and active ulcerative colitis in stool and tissue.</a> Cancer Genomics &amp; Proteomics. 6 (5), 281-295 (2009).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host+shapes+the+gut+microbiota+via+fecal+microRNA.">The host shapes the gut microbiota via fecal microRNA.</a> Cell Host &amp; Microbe. 19 (1), 32-43 (2016).</li><li>Viennois, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-derived+fecal+microRNAs+can+indicate+gut+microbiota+healthiness+and+ability+to+induce+inflammation.">Host-derived fecal microRNAs can indicate gut microbiota healthiness and ability to induce inflammation.</a> Theranostics. 9 (15), 4542-4557 (2019).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+administration+of+miR-30d+from+feces+of+MS+patients+suppresses+MS-like+symptoms+in+mice+by+expanding+Akkermansia+muciniphila.">Oral administration of miR-30d from feces of MS patients suppresses MS-like symptoms in mice by expanding Akkermansia muciniphila.</a> Cell Host &amp; Microbe. 26 (6), 779-794 (2019).</li><li>Masotti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+small+non-coding+RNAs+allows+an+accurate+comparison+of+miRNA+expression+profiles.">Quantification of small non-coding RNAs allows an accurate comparison of miRNA expression profiles.</a> Journal of Biomedicine &amp; Biotechnology. 2009, 659028 (2009).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+win+the+battle+with+RNase.">How to win the battle with RNase.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (2), 101857 (2019).</li><li>Franzosa, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relating+the+metatranscriptome+and+metagenome+of+the+human+gut.">Relating the metatranscriptome and metagenome of the human gut.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (22), 2329-2338 (2014).</li><li>Wohnhaas, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fecal+microRNAs+show+promise+as+noninvasive+Crohn's+disease+biomarkers.">Fecal microRNAs show promise as noninvasive Crohn's disease biomarkers.</a> Crohn's &amp; Colitis. 2 (1), 003 (2020).</li><li>Tomkovich, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+colon+mucosal+biofilms+and+murine+host+communicate+via+altered+mRNA+and+microRNA+expression+during+cancer.">Human colon mucosal biofilms and murine host communicate via altered mRNA and microRNA expression during cancer.</a> mSystems. 5 (1), (2020).</li><li>Tarallo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+fecal+small+RNA+profiles+in+colorectal+cancer+reflect+gut+microbiome+composition+in+stool+samples.">Altered fecal small RNA profiles in colorectal cancer reflect gut microbiome composition in stool samples.</a> mSystems. 4 (5), 70 (2019).</li><li>Xing, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breed+differences+in+the+expression+levels+of+gga-miR-222a+in+laying+hens+influenced+H2S+production+by+regulating+methionine+synthase+genes+in+gut+bacteria.">Breed differences in the expression levels of gga-miR-222a in laying hens influenced H2S production by regulating methionine synthase genes in gut bacteria.</a> Research Square. , (2020).</li><li>Teng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-derived+exosomal+microRNAs+shape+the+gut+microbiota.">Plant-derived exosomal microRNAs shape the gut microbiota.</a> Cell Host &amp; Microbe. 24 (5), 637-652 (2018).</li><li>Moloney, G. M., Viola, M. F., Hoban, A. E., Dinan, T. G., Cryan, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Faecal+microRNAs:+indicators+of+imbalance+at+the+host-microbe+interface.">Faecal microRNAs: indicators of imbalance at the host-microbe interface.</a> Beneficial Microbes. , 1-10 (2017).</li><li>Giannoukos, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+robust+RNA-seq+process+for+cultured+bacteria+and+complex+community+transcriptomes.">Efficient and robust RNA-seq process for cultured bacteria and complex community transcriptomes.</a> Genome Biology. 13 (3), 23 (2012).</li></ol>

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier pertinent ou important lié à la méthode de recherche décrite dans ce document de protocole.

Il est important d’utiliser une technique sans RNase pour prévenir la contamination par la RNase pendant l’isolement7. Après la centrifugation et la formation d’une interphase compacte, il est essentiel d’éviter l’interphase, la phase inférieure et le contaminant particulaire flottant au-dessus de la phase aqueuse lors de la récupération de la phase aqueuse. De plus, deux étapes de lavage avec 500 μL et 250 μL Wash Solution 2/3 sont ajoutées pour éliminer les contaminants dans...

L’ARN extracellulaire est de plus en plus reconnu comme un facteur important qui médie de nombreux processus biologiques1. L’ARN extracellulaire dans les matières fécales a été signalé pour la première fois en 2008 en tant que marqueur du cancer du côlon et de la colite ulcéreuse active2, et il a récemment été révélé comme un composant normal de la lumière intestinale et des matières fécales et médie les communications hôte-microbe 3,4,5. Le but de ce protocole d’isolement d’ARN est d’extraire de l’ARN extracellulaire de haute qualité à partir d’échantillons fécaux prélevés sur des sujets animaux et humains. Le protocole a été adapté à partir d’un kit commercial d’isolation de miARN. L’ARN acquis est utilisé pour des analyses en aval telles que le séquençage de l’ARN, la RT-PCR et la micro-matrice. Le protocole comprend plusieurs conseils importants et utiles pour maximiser la quantité et la qualité de l’ARN présent dans les excréments des animaux et des humains. La raison de développer et d’optimiser cette méthode d’isolement de l’ARN (y compris les microARN) est de diminuer l’ARN microbien dans les fèces, de limiter les variables dans les études de recherche et d’analyser la composition de l’ARN dans l’intestin sans tenir compte des divers facteurs de confusion et sources de contamination. Il convient de noter que cet isolement d’ARN minimise la libération d’ARN par les cellules vivantes et les microbes vivants (ARN cellulaire). Il se concentre sur les ARN extracellulaires qui ont été libérés par les cellules intestinales ou ont été acquis par la prise alimentaire. Principalement, cette méthode ne convient pas aux études où le transcriptome microbien est étudié.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acid-Phenol: Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>AM9720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mirVana miRNA Isolation Kit</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>AM1561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free microcentrifuge tubes (1.5 mL, 2 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water (Not DEPC-treated)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor and Nuclease-Free Pipette tips (with filter)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerLyzer 24 Homogenizer</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>13155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fecal (micro) rna isolation

Il devient clair que l’ARN existe dans la lumière intestinale et les matières fécales chez les animaux et les humains. Le protocole décrit ci-dessous isole l’ARN total, y compris les microARN, provenant d’échantillons fécaux de sujets animaux et humains. L’objectif est d’isoler l’ARN total avec une pureté et une quantité élevées pour des analyses en aval telles que le séquençage de l’ARN, la RT-PCR et les micro-réseaux. Les avantages de ce protocole optimisé dans l’isolement des miARN sont la capacité d’isoler des produits d’ARN hautement purifiés avec des étapes de lavage supplémentaires décrites, une quantité accrue d’ARN obtenue avec une méthode améliorée de remise en suspension de l’échantillon et des pointes importantes de décontamination. Une limitation est l’incapacité de traiter et de purifier un échantillon plus grand de plus de 200 mg, car ces tailles d’échantillon causeraient une difficulté dans la formation claire de l’interphase. Par conséquent, la grande taille de l’échantillon peut contaminer la phase aqueuse à extraire comme décrit dans le protocole avec des matières organiques qui affectent la qualité de l’ARN isolé à la fin. Cependant, les isolats d’ARN provenant d’un échantillon allant jusqu’à 200 mg sont suffisants pour la plupart des analyses en aval.

Des ARN représentatifs ont été isolés à partir d’échantillons fécaux de souris de 50 mg (2 granulés fécaux de souris) et de 100 mg d’échantillons de selles humaines respectivement et élués dans de l’eau exempte de nucléases de 50 μL. L’analyse spectrophotométrique de la concentration suggère qu’une quantité totale de 49 μg et 16 μg d’ARN ont été isolées respectivement (tableau 1). La pureté de l’ARN était élevée, comme l’indiquent un rapport A260/A280 de ~2,0 et ...

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Fecal micro RNA Isolation

Ce protocole isole l’ARN total de haute qualité à partir d’échantillons fécaux de sujets animaux et humains. Un kit commercial d’isolation de miARN est utilisé avec une adaptation significative pour isoler l’ARN pur avec une quantité et une qualité optimisées. Les isolats d’ARN sont bons pour la plupart des tests d’ARN en aval tels que le séquençage, les micro-réseaux et la RT-PCR.

Isolement de l’ARN fécal (micro)

It is becoming clear that RNA exists in the gut lumen and feces in animals and humans. The protocol described below isolates total RNA including microRNAs ...

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Immunology and Infection

Unit 1

Fecal (micro) RNA Isolation

Diagnostic and Radiological Studies of the GI System

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4.4K vues.  Brigham and Women's Hospital and Harvard Medical School. Ce protocole isole l’ARN total de haute qualité à partir d’échantillons fécaux de sujets animaux et humains. Un kit commercial d’isolation de miARN est utilisé avec une adaptation significative pour isoler l’ARN pur avec une quantité et une qualité optimisées. Les isolats d’ARN sont bons pour la plupart des tests d’ARN en aval tels que le séquençage, les micro-réseaux et la RT-PCR.

Vidéo: Fecal micro RNA Isolation

RNA Interference in Ticks

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites of wild and domestic animals and humans, and are considered to be second worldwide to mosquitoes as vectors of human diseases1 and the most important vectors affecting cattle industry worldwide2. Ticks are classified in the subclass Acari, order Parasitiformes, suborder Ixodida and are distributed worldwide from Arctic to tropical regions3. Despite efforts to control tick infestations, these ectoparasites remain a serious problem for human and animal health4,5.
RNA interference (RNAi)6 is a nucleic acid-based reverse genetic approach that involves disruption of gene expression in order to determine gene function or its effect on a metabolic pathway. Small interfering RNAs (siRNAs) are the effector molecules of the RNAi pathway that is initiated by double-stranded RNA (dsRNA) and results in a potent sequence-specific degradation of cytoplasmic mRNAs containing the same sequence as the dsRNA trigger7-9. Post-transcriptional gene silencing mechanisms initiated by dsRNA have been discovered in all eukaryotes studied thus far, and RNAi has been rapidly developed in a variety of organisms as a tool for functional genomics studies and other applications10.
RNAi has become the most widely used gene-silencing technique in ticks and other organisms where alternative approaches for genetic manipulation are not available or are unreliable5,11. The genetic characterization of ticks has been limited until the recent application of RNAi12,13. In the short time that RNAi has been available, it has proved to be a valuable tool for studying tick gene function, the characterization of the tick-pathogen interface and the screening and characterization of tick protective antigens14. Herein, a method for RNAi through injection of dsRNA into unfed ticks is described. It is likely that the knowledge gained from this experimental approach will contribute markedly to the understanding of basic biological systems and the development of vaccines to control tick infestations and prevent transmission of tick-borne pathogens15-19.

A method for RNA interference (RNAi) by injection of dsRNA into unfed ticks is described. RNAi is the most widely used gene-silencing technique in ticks where the use of other methods of genetic manipulation has been limited.

ARN interférence dans les tiques

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites of wild and domestic animals and humans, and are considered to be second worldwide to mosquitoes as vectors ...

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Immunologie et infection

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the generation of extreme population diversity that facilitates virus adaptation and evolution. Increasing evidence shows that the intrinsic error rates, and the resulting mutation frequencies, of RNA viruses can be modulated by subtle amino acid changes to the viral polymerase. Although biochemical assays exist for some viral RNA polymerases that permit quantitative measure of incorporation fidelity, here we describe a simple method of measuring mutation frequencies of RNA viruses that has proven to be as accurate as biochemical approaches in identifying fidelity altering mutations. The approach uses conventional virological and sequencing techniques that can be performed in most biology laboratories. Based on our experience with a number of different viruses, we have identified the key steps that must be optimized to increase the likelihood of isolating fidelity variants and generating data of statistical significance. The isolation and characterization of fidelity altering mutations can provide new insights into polymerase structure and function1-3. Furthermore, these fidelity variants can be useful tools in characterizing mechanisms of virus adaptation and evolution4-7.

The present article describes the steps required to isolate and characterize RNA polymerase fidelity variants of RNA viruses and how to use mutation frequency data to confirm fidelity changes in tissue culture.

Isolement des variantes des virus à ARN de Fidelity et caractérisation de la fréquence de mutation de virus

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

Isolement des ARN Pseudomonas aeruginosa La colonisation du tractus gastro-intestinal murin

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable method of analysis by flow cytometry to study nanoparticle interaction with immune cells. Primary immune cells can be easily purified from human or mouse tissues by antibody-mediated magnetic isolation. In the first instance, the different cell populations running in a flow cytometer can be distinguished by the forward-scattered light (FSC), which is proportional to cell size, and the side-scattered light (SSC), related to cell internal complexity. Furthermore, fluorescently labeled antibodies against specific cell surface receptors permit the identification of several subpopulations within the same sample. Often, all these features vary when cells are boosted by external stimuli that change their physiological and morphological state. Here, 50 nm FITC-SiO2 nanoparticles are used as a model to identify the internalization of nanostructured materials in human blood immune cells. The cell fluorescence and side-scattered light increase after incubation with nanoparticles allowed us to define time and concentration dependence of nanoparticle-cell interaction. Moreover, such protocol can be extended to investigate Rhodamine-SiO2 nanoparticle interaction with primary microglia, the central nervous system resident immune cells, isolated from mutant mice that specifically express the Green Fluorescent Protein (GFP) in the monocyte/macrophage lineage. Finally, flow cytometry data related to nanoparticle internalization into the cells have been confirmed by confocal microscopy.

Analysis of nanoparticle interaction with defined subpopulations of immune cells by flow cytometry.

Détection de nanoparticules fluorescentes Interactions avec immunitaire primaire sous-populations de cellules par cytométrie en flux

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral proteins involved in the regulation of the virus activity recognize several nucleic acids. The nucleocapsid protein NCp7 (NC) is a key protein regulating several processes during virus replication. NC is in fact a chaperone destabilizing the secondary structures of RNA and DNA and facilitating their annealing. The inactivation of NC is a new approach and an interesting target for anti-HIV therapy. The Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) assay was developed to identify molecules able to inhibit the melting and annealing of RNA and DNA folded in thermodynamically stable tridimensional conformations, such as hairpin structures of TAR and cTAR elements of HIV, by the nucleocapsid protein of HIV-1. The new assay employs either the recombinant or the synthetic protein, and oligonucleotides without the need of their previous labeling. The analysis of the results is achieved by standard polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) followed by conventional nucleic acid staining. The protocol reported in this work describes how to perform the NAME assay with the full-length protein or its truncated version lacking the basic N-terminal domain, both competent as nucleic acids chaperones, and how to assess the inhibition of NC chaperone activity by a threading intercalator. Moreover, NAME can be performed in two different modes, useful to obtain indications on the putative mechanism of action of the identified NC inhibitors.

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

This protocol describes NAME, an assay that allows the rapid identification of molecules able to inhibit in vitro the chaperone activities of HIV-1 nucleocapsid protein.

Nucléocapside recuit-Mediated électrophorèse (NOM) Assay permet l&#39;identification rapide des VIH-1 inhibiteurs Nucleocapsid

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.

This study describes an imaging-based micro-neutralization assay to analyze the antigenic relationships between viruses. The protocol employs a flatbed scanner and has four steps, including titration, titration quantitation, neutralization, and neutralization quantitation. The assay works well with current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses.

L&#39;optimisation d&#39;un micro-neutralisation quantitative de dosage

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material

The RT-QuIC technique is a sensitive in vitro cell-free prion amplification assay based mainly on the seeded misfolding and aggregation of recombinant prion protein (PrP) substrate using prion seeds as a template for the conversion. RT-QuIC is a novel high-throughput technique which is analogous to real-time polymerase chain reaction (PCR). Detection of amyloid fibril growth is based on the dye Thioflavin T, which fluoresces upon specific interaction with &#7526;-sheet rich proteins. Thus, amyloid formation can be detected in real time. We attempted to develop a reliable non-invasive screening test to detect chronic wasting disease (CWD) prions in fecal extract. Here, we have specifically adapted the RT-QuIC technique to reveal PrPSc seeding activity in feces of CWD infected cervids. Initially, the seeding activity of the fecal extracts we prepared was relatively low in RT-QuIC, possibly due to potential assay inhibitors in the fecal material. To improve seeding activity of feces extracts and remove potential assay inhibitors, we homogenized the fecal samples in a buffer containing detergents and protease inhibitors. We also submitted the samples to different methodologies to concentrate PrPSc on the basis of protein precipitation using sodium phosphotungstic acid, and centrifugal force. Finally, the feces extracts were tested by optimized RT-QuIC which included substrate replacement in the protocol to improve the sensitivity of detection. Thus, we established a protocol for sensitive detection of CWD prion seeding activity in feces of pre-clinical and clinical cervids by RT-QuIC, which can be a practical tool for non-invasive CWD diagnosis.

Here, we present a protocol to describe a simple, fast and efficient prion amplification technique, the real-time quaking-induced conversion (RT-QuIC) method.

En temps réel Quaking induite par le test de Conversion pour détection de CWD Prions dans les matières fécales

The RT-QuIC technique is a sensitive in vitro cell-free prion amplification assay based mainly on the seeded misfolding and aggregation of recombinant ...

Culture Methods to Determine the Limit of Detection and Survival in Transport Media of Campylobacter Jejuni in Human Fecal Specimens

A culture from human stool for diagnosis of Campylobacter-based intestinal illness takes several days, a wait that taxes the fortitude of the physician and the patient. A culture is also prone to false negative results from random loss of viability during specimen handling, overgrowth of other fecal flora, and poor growth of several pathogenic Campylobacter species on traditional media. These problems can confound clinical decisions on patient treatment and have limited the field from answering fundamental questions on Campylobacter growth and infections. We describe a procedure that estimates the lower limit of bacterial numbers that can be detected by a culture and a method for quantifying survival of C. jejuni in media used for transport of this fragile organism. Knowing this information, it becomes possible to set clinically relevant detection thresholds for diagnostic tests and address unstudied issues of whether non-symptomatic colonization is prevalent, if co-infection with other enteric pathogens is common, or if bacterial load correlates with symptoms or serious sequelae. The study also included testing of 1,552 prospectively collected patient diarrheal fecal specimens that were initially classified by conventional culture and further tested by a new enzyme immunoassay. Positive and discrepant specimens were then screened by four molecular methods to assign true-positive or true-negative status. The 5 non-culture methods showed complete agreement on all 48 positive and discrepant specimens, while the culture mis-identified 14 (28%). The specimens that were incorrectly identified by culture included 13 false negative and 1 false positive sample. This basic protocol can be used with multiple Campylobacter spp. and will allow the numbers of Campylobacter bacteria that produce symptoms of gastroenteritis in humans to be determined and for prevalence rates to be updated.

Culture Methods to Determine the Limit of Detection and Survival in Transport Media of Campylobacter Jejuni in Human Fecal Specimens

Although stool culture for Campylobacter is imprecise, it is still considered the gold standard for identification. Methods to determine the limit of detection and survival in transport media of C. jejuni in human stool are described and compared with a new immunoassay with better accuracy.

Méthodes de culture pour déterminer la limite de détection et de survie dans les médias de transport de Campylobacter Jejuni dans les spécimens fécals humains

A culture from human stool for diagnosis of Campylobacter-based intestinal illness takes several days, a wait that taxes the fortitude of the physician ...

Supervised Machine Learning for Semi-Quantification of Extracellular DNA in Glomerulonephritis

Glomerular cell death is a pathological feature of myeloperoxidase anti neutrophil cytoplasmic antibody associated vasculitis (MPO-AAV). Extracellular deoxyribonucleic acid (ecDNA) is released during different forms of cell death including apoptosis, necrosis, necroptosis, neutrophil extracellular traps (NETs) and pyroptosis. Measurement of this cell death is time consuming with several different biomarkers required to identify the different biochemical forms of cell death. Measurement of ecDNA is generally conducted in serum and urine as a surrogate for renal damage, not in the actual target organ where the pathological injury occurs. The current difficulty in investigating ecDNA in the kidney is the lack of methods for formalin fixed paraffin embedded tissue (FFPE) both experimentally and in archived human kidney biopsies. This protocol provides a summary of the steps required to stain for ecDNA in FFPE tissue (both human and murine), quench autofluorescence and measure the ecDNA in the resulting images using a machine learning tool from the publicly available open source ImageJ plugin trainable Weka segmentation. Trainable Weka segmentation is applied to ecDNA within the glomeruli where the program learns to classify ecDNA. This classifier is applied to subsequent acquired kidney images, reducing the need for manual annotations of each individual image. The adaptability of the trainable Weka segmentation is demonstrated further in kidney tissue from experimental murine anti-MPO glomerulonephritis (GN), to identify NETs and ecMPO, common pathological contributors to anti-MPO GN. This method provides objective analysis of ecDNA in kidney tissue that demonstrates clearly the efficacy in which the trainable Weka segmentation program can distinguish ecDNA between healthy normal kidney tissue and diseased kidney tissue. This protocol can easily be adapted to identify ecDNA, NETs and ecMPO in other organs.

Extracellular DNA (ecDNA) released during cell death is proinflammatory and contributes to inflammation. Measurement of ecDNA at the site of injury can determine the efficacy of therapeutic treatment in the target organ. This protocol describes the use of a machine learning tool to automate measurement of ecDNA in kidney tissue.

Apprentissage automatique supervisé pour la semi-quantification de l’ADN extracellulaire dans la glomerulonephrite

Glomerular cell death is a pathological feature of myeloperoxidase anti neutrophil cytoplasmic antibody associated vasculitis (MPO-AAV). Extracellular ...

Therapeutic Evaluation of Fecal Microbiota Transplantation in an Interleukin 10-Deficient Mouse Model

With the development of microecology in recent years, the relationship between intestinal bacteria and inflammatory bowel disease (IBD) has attracted considerable attention. Accumulating evidence suggests that dysbiotic microbiota plays an active role in triggering or worsening the inflammatory process in IBD and that fecal microbiota transplantation (FMT) is an attractive therapeutic strategy since transferring a healthy microbiota to IBD patient could restore the appropriate host-microbiota communication. However, the molecular mechanisms are unclear, and the efficacy of FMT has not been very well established. Thus, further studies in animal models of IBD are necessary. In this method, we applied FMT from wild-type C57BL/6J mice to IL-10 deficient mice, a widely used mouse model of colitis. The study elaborates on collecting fecal pellets from the donor mice, making the fecal solution/suspension, administering the fecal solution, and monitoring the disease. We found that FMT significantly mitigated the cardiac impairment in IL-10 knockout mice, underlining its therapeutic potential for IBD management.

The interaction of genetic susceptibility, mucosal immunity, and intestinal microecological environment is involved in the pathogenesis of inflammatory bowel disease (IBD). In this study, we applied fecal microbiota transplantation to IL-10 deficient mice and investigated its impact on colonic inflammation and heart function.

Évaluation thérapeutique de la transplantation de microbiote fécal dans un modèle murin déficient en interleukine 10

With the development of microecology in recent years, the relationship between intestinal bacteria and inflammatory bowel disease (IBD) has attracted ...